根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研究
根癌农杆菌介导hrf1基因转化小麦增强赤霉病抗性
用于双子 叶植 物转化 的方法 ， 如花粉 管通道法 、 农杆菌介 导 法、 因枪法等 ， 乎都可以成功地用于小麦基 因转化 ， 是 基 几 但 由于这些方法或操作繁琐或 代价高 昂， 小麦 的遗传转化仍 受 到很多 限制 。小 麦赤霉病 （ ｕａｉｍ ｈ ａ ｌｈ， Ｈ 是 Ｆ ｓｒ ｅｄｂｉ ｔＦ Ｂ） ｕ ｇ
ｔｉｆｍｌ ｇ ｓｅ ｓＪ ．Ｍｏ Ｂｏ Ｅ ｏ，００，７：６ ｈｓａ ｉ ｉ ａ ｉ ｐ ｒ ［］ ｙ ｎｎ ｏ ｍ ｌ ｉ ｖｌ２ ０ １ ３ ２—３３ ｌ ７．
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１ ７１ ２ ８—２ ９ ． ４： ２．
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农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化的几个影响因素研究
农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化的几个影响因素研究李朝炜;刘颖;王丹娜;阳秦婧;魏景芳【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2017(45)12【摘要】为研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素,以2个小麦品种石4185、科麦一号的成熟胚为转化受体材料,分别以GV3101、EHA105、LBA4404等3种农杆菌菌株(含有pCAMBIA1380双元载体)为供体材料进行转化,主要检测成熟胚愈伤组织β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因的表达情况.结果表明,不同小麦品种对转化体系的反应各不相同,菌株、受体的基因型以及外植体的继代时间和生理状态等均对转化效率有很大的影响.GV3101的侵染转化效果优于另外2个菌株,石4185成熟胚愈伤对农杆菌侵染的敏感性比科麦一号要高.继代培养时间的延长会不同程度地影响小麦成熟胚愈伤的转化效果.通过对转化体系几个影响因素的研究,有助于提高农杆菌介导成熟胚转化体系的效率.【总页数】3页(P45-47)【作者】李朝炜;刘颖;王丹娜;阳秦婧;魏景芳【作者单位】河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018;河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018;河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018;河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018;河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018【正文语种】中文【中图分类】S512.101【相关文献】1.根癌农杆菌介导小麦成熟胚的遗传转化研究2.根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研究3.农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化影响因素分析4.根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究5.农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤遗传转化研究进展因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小麦转基因方法及其评述
HEREDITAS (Beijing) 2011年5月, 33(5): 422―430 ISSN 0253-9772 综 述收稿日期: 2010−10−09; 修回日期: 2010−12−04基金项目:国家重大科技专项(编号：2008ZX08010-004)资助作者简介:叶兴国, 博士, 研究员, 博士生导师, 研究方向: 小麦生物技术育种。
E-mail: yexg@网络出版时间: 2011-04-02 17:53:03URL: /kcms/detail/11.1913.R.20110402.1753.005.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00422小麦转基因方法及其评述叶兴国, 陈明, 杜丽璞, 徐惠君中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081摘要: 小麦是遗传转化比较困难的作物之一。
为了克服小麦基因工程育种和功能基因组学研究的障碍, 人们分别尝试利用基因枪、花粉管通道、超声波、离子束注入、激光微束穿刺、PEG(Polyethylene glycol)、电击和农杆菌等方法转化小麦, 涉及的受体材料包括幼胚、成熟胚、花药愈伤组织、幼穗、芽尖和花器官。
文章对小麦主要遗传转化方法及其应用进行了介绍、回顾和评述, 分析、比较了获得安全型转基因小麦的几种策略, 以期增强读者对小麦转基因技术和进展的了解, 促进小麦转化技术的持续改进和提高。
关键词: 小麦; 遗传转化Description and evaluation of transformation approaches used in wheatYE Xing-Guo, CHEN Ming, DU Li-Pu, XU Hui-JunInstitute of Crop Sciences , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081, ChinaAbstract: Genetic transformation is a valuable tool for direct crop improvement and functional genomics study. Unfortu-nately, wheat is considered as a recalcitrant plant to genetic transformation due to its low efficiency and genotype depend-ency. To overcome these problems, various transformation methods such as biolistic bombardment, Agrobacterium tumefa-ciens , pollen-tube pathway, ion implantation, laser microbeams puncture, treatment with polyethylene glycol and ultrasonic wave, and electroporation have been reported in wheat using various types of explants including immature embryos, mature embryos, anthers derived calluses, inflorescences, apical meristems, and other floral organs. In this review, several major transformation approaches and their applications in wheat are reviewed, and potential strategies for the development of safe transgenic wheat plants are discussed. The objective of this review is to provide an update on current status of wheat trans-formation, and to stimulate further research for improving transformation efficiency in wheat.Keywords: wheat; genetic transformation小麦是世界上重要的粮食作物之一, 与社会经济发展、粮食安全供给和人类营养健康密切相关。
转基因技术在小麦遗传改良中的应用分析
转基因技术在小麦遗传改良中的应用分析作者：刘晏东来源：《农民致富之友（上半月）》 2020年第22期刘晏东小麦作为一种主要粮食作物，其产量影响着国民的生活品质，其品质也会影响小麦类食品的食品品质。
利用转基因技术实现对小麦遗传性的改良，可以实现对小麦产量、品质的提升，同时转基因小麦也能具有更强的抗病虫害能力及抗逆性，这对促进我国小麦种植业的发展有着中啊哟的意义。
为此，在小麦研究工作中，我们应该做好对转基因技术的应用研究工作，掌握相应的应用方法，了解小麦转基因技术应用过程中的现存问题，这对日后的小麦品种改良工作有重要意义。
一、小麦转基因技术的概述小麦转基因技术的技术原理是通过人工导入的方式，将外源基因或DNA植入小麦细胞之中，通过外源基因或DNA与小麦细胞的稳定融合，实现对小麦遗传基因的改良。
利用小麦转基因技术，能够达到有目的性的基因转化，根据小麦品种的改良目标，给予有针对性的转基因操作。
目前，小麦的基因转化主要的组织培养方法有两种，第一种是通过农杆菌介导、基因枪介导或花粉管通道法实现；第二种是通过PEG法、电激法来实现，而第一种组织培养方法为小麦遗传改良中的最常见技术手段。
1、转基因技术在小麦遗传改良中的改良方向转基因技术应用在小麦遗传改良之中，可以在小麦基因中加入除草剂基因、品质改良基因、抗病虫基因、抗逆性基因以及雄性不育基因等，通过这些基因的加入，可以显著提高小麦的品质与产量，同时也能减少小麦病虫害的发生，小麦对环境的适应能力也能显著提高。
2、小麦遗传改良的转化受体在小麦遗传改良之中，其转化受体可分为幼胚、成熟胚、胚性愈伤组织、盾片组织、茎尖组织以及幼穗等组织。
而高效的再生体系是实现小麦转基因的基础，为此，在进行小麦遗传改良时，应该为其建立高效的小麦组织培养体系。
在早期的小麦转基因的研究工作中，其悬浮细胞组织的再生能力较弱，这也让电激法的介导效果不佳，使小麦遗传改良受到了阻碍。
相关研究发现，小麦幼胚组织的愈合能力以及植株再生能力较高，符合小麦遗传改良的基础条件，可以作为遗传改良的理想转化受体，因此，目前的小麦转基因研究主要以小麦幼胚组织作为主要转化受体。
影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件的研究
影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件的研究贺杰;王伟;胡海燕;赵俊杰;校现周【摘要】利用小麦成熟胚愈伤组织的高效再生体系,对影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件:预培养时间、共培养时间、抗生素(Kan)筛选压、头抱霉素浓度、菌液浓度和侵染时间等进行了研究.最后确立的转化条件为:预培养时间为1～2 d,共培养时间为3 d,Kan筛选压为100 mg/L,头孢霉素所用浓度500 mg/L,当菌液浓度0O600=0.6浸染45 min.并对得到的再生植株进行了PCR检测,初步证实了目的基因转到了小麦基因组中.【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2010(029)005【总页数】4页(P5-7,11)【关键词】小麦;农杆菌;遗传转化【作者】贺杰;王伟;胡海燕;赵俊杰;校现周【作者单位】河南科技学院,河南,新乡,453003;河南科技学院,河南,新乡,453003;河南科技学院,河南,新乡,453003;河南科技学院,河南,新乡,453003;中国热带农业科学院橡胶研究所,海南,儋州,571737【正文语种】中文【中图分类】S512.1小麦作为世界上重要的粮食作物，其进行基因工程改良一直倍受关注。
自1993年Chan TM［1］利用农杆菌转化水稻获得转基因植株以来，农杆菌介导的转化方法在禾本科作物上的研究迅速展开，玉米和水稻已经建立相对完善的转化体系［2，3］，直到1997年，Cheng M等［4］才报道了利用农杆菌介导法获得gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因的转基因植株。
随后，农杆菌介导小麦遗传转化在许多实验室取得了成功。
Xia GM等［5］1999年获得农杆菌介导的nptⅡ基因的小麦当代转化植株。
本试验是在小麦成熟胚组织培养研究的基础上，以小麦成熟胚愈伤组织为受体，对农杆菌介导的小麦遗传转化的主要因子，如外植体预培养时间、共培养时间、抗生素(Kan)筛选压、头抱霉素浓度、接种菌液浓度和侵染时间等进行优化，以提高小麦遗传转化效率，为小麦的基因工程遗传改良育种奠定基础。
小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究进展_陶丽莉
麦类作物学报 2008,28(4):713-718Journal of Triticeae Crops小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究进展陶丽莉1,殷桂香2,1,叶兴国1(1.中国农业科学院作物科学研究所/农业部作物遗传育种重点实验室/国家基因资源与遗传改良重大科学工程,北京100081;2.长江大学农学院,湖北荆州434025) 摘 要:小麦成熟胚转化体系的建立对促进小麦基因工程研究和功能基因组研究具有重要意义。
小麦成熟胚具有取材方便、不受季节限制等优点,已成功应用于小麦组织培养及遗传转化研究,可望取代幼胚成为小麦遗传转化的方便受体。
本文就目前小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究进行了综述,目的是为进一步建立和完善小麦成熟胚再生体系和转化体系提供参考。
目前国内外采用较多的小麦成熟胚培养方式主要有完整成熟胚培养、胚乳支撑成熟胚培养、成熟胚刮碎培养和成熟胚切割培养等。
对培养基中激素种类、浓度配比的优化也进行了较多研究,并取得了一定结果。
利用基因枪轰击法和农杆菌介导法转化小麦成熟胚均成功获得了转基因植株,证明小麦成熟胚及其愈伤组织作为受体进行遗传转化研究具有可行性。
关键词:小麦;成熟胚;组织培养;遗传转化 中图分类号:S512.1;S336 文献标识码:A 文章编号:100921041(2008)0420713207Progress Outline of Wheat Tissue Culture and G enetic T ransformationby Using Wheat Mature Embryos As ExplantsTAO Li2li1,YIN G ui2xiang2,1,YE Xing2guo1(1.National Key Facilities for Crop Gene Resources and Genetic Improvement,Key Laboratory for Crop Genetics and Breedingof Agricultural Ministry,Crop Sciences Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100081,China;2.Agronomy College of Yangtze University,Jingzhou,Hubei434025,China)Abstract:Wheat mat ure embryo has been regarded as a high potential explant s for plant regeneration and genetic t ransformation because of some distinguish advantages such as easy collection all t he year round,consistent p hysiological stat us and econo mic experiment p rocess.In t he last ten years a great success has been achieved on t he tissue cult ure and t ransformation of wheat by using mat ure embryos worldwide.To get good regeneration system,t he mat ure embryo s are tested to be cult ured by several ways including whole embryo cult ure,endosperm2supported embryo cult ure,t hin embryo fragment s cult ure,and cutting embryo cult ure t reat ment s.The effect s of concent rations and combinations of va2 rious growt h regulators on callus induction and plant regeneration have also been st udied,and some a2 vailable result s obtained.U sing t he mat ure embryo s as target tissues,transgenic plant s have been re2 ported mediated wit h Agrobacterium technique and biolistic particle approach,proving t he bright pos2 sibility of t he explant s employed in wheat t ransformatio n.We summarized here t he progress of wheat mat ure embryo cult ure and t ransformation to p rovide reference for t he optimization of t he bot h sys2 tems.Efficient systems of t he wheat mat ure embryo cult ure and t ransformation will remarkably p ro2 mote wheat genetic engineering improvement and f unctional genomics st udy.K ey w ords:Wheat;Mat ure embryo s;Tissue cult ure;Transformation3收稿日期:2008202205 修回日期:2008205220基金项目:国家“863”项目(2007AA10Z129)。
根癌农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化影响因素研究
根癌农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化影响因素研究李静雯;张正英【摘要】为建立和优化根癌农杆菌介导的大麦遗传转化体系,以大麦幼胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化大麦的主要影响因素.结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织诱导率为转化指标,筛选出了对大麦幼胚感染力比较强的农杆菌菌株EHA105,以及高敏感受体基因型甘啤4号和秀81-47等.实验结果还表明,预培养1 d的大麦幼胚具有较高的瞬时表达率(91%),是较好的转化受体.菌液侵染浓度OD600=0.5,侵染时间为30 min时转化效率最高.在此基础上,侵染后幼胚与农杆菌采用液体共培养方式可明显提高转化效率,gus基因瞬时表达率最高可达90%.在优化条件下,转化约30 d后抗选择剂潮霉素(Hyg)的愈伤组织占受体组织总数的34.2%.【期刊名称】《大麦与谷类科学》【年(卷),期】2010(000)002【总页数】6页(P1-6)【关键词】大麦;幼胚;根癌农杆菌;遗传转化【作者】李静雯;张正英【作者单位】甘肃省农业科学院生物技术研究所,甘肃,兰州,730070;甘肃省农业科学院生物技术研究所,甘肃,兰州,730070【正文语种】中文【中图分类】S5禾谷类作物的遗传转化现已广泛用于改良作物品质，也是功能基因组学研究的有力手段[1]。
大麦作为世界上第四大粮食作物在全球100多个国家广泛种植。
除了其自身的重要研究价值，大麦(二倍体)也可作为研究其他遗传背景更为复杂的六倍体禾谷类作物(如小麦)的模式作物。
因此建立一个高效、稳定的大麦遗传转化体系是十分必要的。
大麦的遗传转化始于20世纪90年代。
1994年Wan等利用基因枪介导法获得了世界上第一例可育转基因大麦[2]。
1997年Tingay 等首次建立了农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化程序，并成功获得了大麦转基因植株[3]。
Trifonova[4]、Wu[5]、Murray[6]、Shrawat[7]、Hensel[8]等相继报道了提高农杆菌转化大麦频率的影响因素，如大麦基因型和外植体、菌株和载体、胚的大小及处理方式、预培养时间、共培养条件、乙酰丁香酮(AS)的作用、培养基成分等。
农杆菌介导主要农作物遗传转化的研究进展
籼 稻 品种 分 别 以 ５０ ｍｇ／Ｌ Ｈｙｇ、３０ ｍｇ／Ｌ Ｂａｓｔａ和 还 可能 会使 原有 物种 的正 常繁衍 生息 受到 一定程
关 键 词 ：主要 农 作 物 ；农 杆 菌 ；遗 传 转 化 ；应 用
中 图分 类 号 ：
文 献 标 识 码 ：
禾本 科是 种 子植 物 中最 有 经济 价 值 的植 物 ， 其 中的水 稻 、玉米 、小 麦等 是粮食 和饲 料 的主要来 源 。随着 人 口和经 济过度 增长带 来 的耕地 面积减 少 以及资 源 匾乏等 问题 ，使 得 人 们对 粮 食 产 量 和 品质 提 出 了更 高要求 。近 年来 ，利用转 基 因技术 ， 将外 源有 用 的基 因转 化到 禾本科 植物 的基 因工程 研究 不仅 为农业 生 产 提 供 了更 快 、更 直 接 的 改善 方法 ，也 为引进 有用 的农艺 性状 提供 了机会 。
第 ４期
李 浩 戈 等 ：农 杆 菌介 导 主 要农 作 物 遗传 转化 的研 究进 展
化有 影 响 。周 艳玲 等 比较 了潮 霉 素 （Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ， 的主要 粮食 来源 ，因此 关 于 转 基 因水 稻 的 食 品安
Ｈｙｇ）和草 丁膦 （Ｂａｓｔａ）的筛选 效果 ，发 现在粳 稻 和 全 问题 不容 忽视 ；转基 因水 稻释 放到 生态 系统 中 ，
农 杆 菌介导 法 是 以农 杆 菌 为 媒介 ，实 现外 源 基 因向植 物基 因组 的转 移 与整 合 的转 基 因技 术 。 植物 受伤后 产生 的 酚类化 合物作 为一 种信号 分子 激活农 杆 菌 的 ＤＮＡ转移 系统 ，农杆 菌 聚集 接 近植 物伤 口部 位细胞 ，Ｔ—ＤＮＡ转 移 至植 物 细 胞 并 整合 到植 物基 因组 中后 ，其 编码 的基 因在 细胞 中表达 。 由于单 子 叶植物 并 不 是农 杆 菌 的天 然 寄 主 ，该 方 法起初 只 用于 双子 叶植 物 中 ，近 十几 年 来 在单 子 叶植 物 中 也得 到 了广 泛 应用 ，目前 在水 稻 、玉米 、 小麦 这 ３大 重 要 粮 食 作 物 上 取 得 了 长 足 的 发 展 … 。本文 主 要 介 绍 了农 杆 菌 介 导 水 稻 、玉 米 、 小麦遗 传转 化 的影 响因素 、应用及 发展 趋势 。
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根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研究作者：李砚川来源：《湖北农业科学》2011年第17期摘要：以小麦栽培品种郑麦９０２３成熟胚半胚愈伤组织作为受体材料，通过农杆菌菌株ＧＶ３１０１将目的基因导入受体材料并对转化过程进行了优化。
考查了ＭＳ培养基中ＮＨ４ＮＯ３浓度对组织培养的影响，以及高渗处理对转化过程的作用。
结果显示，２．５倍的ＮＨ４ＮＯ３浓度可明显提高愈伤组织再生率，高渗处理对愈伤组织再生率的提高也有帮助。
经抗性筛选和ＰＣＲ鉴定，共得到了４株转基因小麦植株，平均转化效率为０．１８％。
关键词：小麦；成熟胚；农杆菌；转化中图分类号：Ｓ５１２．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）17－3637-03Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔＭａｔｕｒｅＥｍｂｒｙｏＴｉｓｓｕｅｓＬＩＹａｎ－ｃｈｕａｎ（ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅ Sciences ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄ by Agrobacteroum strain GV3101 ｕｓｉｎｇｅｘｐｌａｎｔｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｗｈｅａｔｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓｏｆＺｈｅｎｇｍａｉ９０２３ａｓｒｅｃｅｐｔｏｒ；ａｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＮＨ４ＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ 2.5 times ｏｆＮＨ４ＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｃould ｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ callus．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＰＣＲ identification，４ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｗｈｅａｔｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｖｅｒａｇｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ of ０．１８％．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｗｈｅａｔ；ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ１９９７年，Ｃｈｅｎｇ等［１］首次用农杆菌介导法获得可育的转基因小麦植株。
几年后，夏光敏等［２］、叶兴国等［３］也分别报道利用农杆菌法获得了转基因小麦植株。
随后越来越多的研究机构对农杆菌介导的小麦遗传转化方法作了更加细致与深入的研究［４－８］，使得该方法的转化效率不断提高。
但上述报道大多用小麦幼胚及其诱导产生的愈伤组织作为转化受体，虽然小麦幼胚再生能力强，但取材在时间和空间上受到很大限制，适宜转化的生理状态难以掌握，转化周期也比较长。
相比幼胚，成熟胚取材方便，生理状态一致，不受生长季节限制，是组织培养和遗传转化理想的外植体。
本研究以小麦成熟胚诱导的愈伤组织为转化受体，在已有研究基础上［９－１１］选择根癌农杆菌介导小麦遗传转化的几个重要影响因素，进行比较与优化，旨在为进一步建立和优化根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系奠定基础。
１材料与方法１．１试验材料小麦品种郑麦９０２３以及质粒ｐＴＲＡｋｃ－ＢＡＲ－ＵＴ－Ｒｓ－Ｄ２和根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１均由华中农业大学麦类分子生物学实验室提供。
１．２试验方法１．２．１培养基诱导培养基含ＭＳ基本培养基［１２］、肌醇１００ｍｇ／Ｌ、天门冬氨酸１３４ｍｇ／Ｌ、脯氨酸１１５ｍｇ／Ｌ、ＭＥＳ１．９５ｇ／Ｌ、２，４－Ｄ２ｍｇ／Ｌ、麦芽糖４０ｇ／Ｌ、植物凝胶５ｇ／Ｌ；同时设计了３种ＮＨ４ＮＯ３浓度修饰的诱导培养基（表１）。
浸染培养基、分化筛选培养基、生根筛选培养基及生根壮苗培养基等参照文献配制［９，１３］。
１．２．２种子表面消毒及预处理选取成熟饱满、颜色和大小相对一致的小麦成熟种子，用７０％的乙醇浸泡５ｍｉｎ，无菌水冲洗２～３次，再经０．１％ＨｇＣｌ２浸泡１５ｍｉｎ，无菌水冲洗６～８次后，置于含８ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ溶液的无菌三角瓶中３３℃浸泡５ｈ。
预处理后的种子用７０％的乙醇浸泡１ｍｉｎ，无菌水冲洗２～３次，再经０．１％的ＨｇＣl２浸泡５ｍｉｎ，无菌水冲洗３～４次。
１．２．３愈伤组织的诱导用左手拿镊子夹住已浸泡过的成熟种子无胚的一端，右手拿手术刀将成熟胚纵切成两半后，将胚剥出，切面向下放置于诱导培养基上，（２５±１）℃暗培养１４ｄ。
１．２．４农杆菌接种菌液的准备挑取含目的质粒的农杆菌ＧＶ３１０１单菌落于１０ｍＬ含２５ｍｇ／Ｌ kan、１００ｍｇ／Ｌ rｉｆ和１００ｍｇ／Ｌ cａｂ的ＹＥＢ培养基中，２８℃、２２０ｒ／ｍｉｎ暗培养过夜。
吸取１ｍＬ培养物转入５０ｍＬ含２５ｍｇ／Ｌ kan、１００ｍｇ／Ｌ rｉｆ和１００ｍｇ／Ｌ cａｂ的ＹＥＢ培养基中，２８℃、２２０ｒ／ｍｉｎ继续暗培养至ＯＤ６００nm＝０．８～１．０。
将菌液转至无菌离心管中，４５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；菌体沉淀用液体浸染培养基洗涤一次后，用液体浸染培养基重悬，使重悬菌液ＯＤ６００nm＝１．０。
重悬菌液中加入终浓度为２００μｍｏｌ／Ｌ的ＡＳ、０．０１５％的ＳｉｌｗｅｔＬ－７７，用于侵染小麦外植体。
１．２．５农杆菌介导转化转化前先将愈伤组织放入６孔培养板中室温下黑暗条件高渗处理２～４ｈ（对照不处理），然后吸出高渗培养液用重悬好的菌液室温下浸染２０ｍｉｎ，再用液体共培养培养基洗２次（每次５ｍｉｎ），取出愈伤组织，在无菌滤纸上吸去多余菌液，放置于含４００μＬ液体共培养培养基的无菌培养皿中内置灭菌ＷｈａｔｍａｎＮｏ．１滤纸上，２１℃黑暗共培养４８ｈ。
１．２．６转化受体的筛选共培养后的转化受体转至恢复培养基，恢复培养１～２周再转入再生培养基，培养２～４周。
待芽苗长至３ｃｍ左右，将其转入生根筛选培养基，最后将得到的抗性苗进行壮苗培养。
１．２．７ＰＣＲ检测基因组ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ法。
设计ＰＣＲ引物检测目的基因是否转入成功，引物序列为ＵｂｉＰ５：５′－ＣＡＴＣＴＣＴＧＴＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡＧ－３′；ＵｂｉＰ６：５′－ＣＧＧＴＡＧＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴＣ－３′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，目标片段大小为４９５ｂｐ。
反应体系为：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２１．５μＬ，１．２５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ２μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ引物各０．５μＬ，５Ｕ／μＬＴａｑ酶０．５μＬ，模板ＤＮＡ２０～５０ｎｇ，补超纯水至总体积２５μＬ。
ＰＣＲ反应条件为：９５℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５８℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３６个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。
ＰＣＲ产物采用１．２％琼脂糖进行凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相。
２结果与分析２．１ＮＨ４ＮＯ３浓度对农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化的影响培养基中加入不同浓度的ＮＨ４ＮＯ３，对小麦成熟胚组织的再生有明显的影响（表２）。
含２．５倍ＮＨ４ＮＯ３时再生率和抗性苗数明显高于其他浓度。
但随着ＮＨ４ＮＯ３浓度的继续增加，愈伤组织的诱导变得困难且生长缓慢，可能是由于ＮＨ４ＮＯ３浓度过高会导致植物细胞内外渗透压的变化，对其生长产生不利影响。
２．２高渗处理对郑麦９０２３成熟胚再生的影响愈伤组织的高渗处理能提高郑麦９０２３的再生率（图１），其机理可能是高渗处理造成愈伤组织的渗透胁迫，从而启动内在调节系统，提高愈伤组织活力。
另外，高渗处理后细胞内外形成压力差，细胞发生质壁分离，液泡变小，此时再与农杆菌混合，能有效地促使农杆菌吸附在细胞表面，并借助此压差更易转入到愈伤组织细胞内，从而提高转化效率。
２．３抗性植株的再生和转基因植株的获得预培养１４ｄ的郑麦９０２３成熟胚愈伤组织（图2Ｂ）经农杆菌感染后转到恢复培养基上，以促进侵染细胞的生长。
再转入再生培养基，培养２～４周。
待芽苗长至３ｃｍ左右（图2Ｃ），将其转入生根筛选培养基（图2Ｄ），期间大部分幼苗不能生根，最终变黄枯死（图2Ｅ），最后将得到的４株抗性苗进行壮苗培养，春化后移入温室（图2Ｆ）。
２．４转基因植株的ＰＣＲ检测结果提取４株转化植株的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，结果如图３。
从图３可以看出在３、４、５、６泳道中都有大小约５００ｂｐ的特异性片断，而阴性对照没有扩增产物，证明在转化植株中有目的基因的插入，平均转化效率为０．１８％。
３讨论以小麦成熟胚为外植体进行组织培养的报道已不少，农杆菌介导的小麦遗传转化也有很多研究，但以成熟胚为转化受体的报道很少。
本研究根据已有文献的研究基础和华中农业大学麦类分子生物学实验室的实际情况，以Ｙｕ等［９］的组织培养再生程序为基础，采用成熟胚纵切的培养方式，并参考了已报道的转化程序［１０－１４］，采用预培养１４ｄ经高渗处理后的愈伤组织为受体，用含２００μｍｏｌ／ＬＡＳ、０．０１５％ＳｉｌｗｅｔＬ－７７的浸染培养液培养３ｈ，干燥共培养３ｄ，经筛选鉴定得到了４株转基因小麦植株，初步建立了可用于小麦成熟胚的根癌农杆菌转化系统。
同源重组被认为是目的基因整合进植物基因组的主要方式之一，ＮＨ４ＮＯ３作为一种大量元素能提高同源重组的频率，所以在较高浓度的ＮＨ４ＮＯ３条件下外植体可能具有更高的转基因整合效率。
Ｂｏｙｋｏ等［１５］对农杆菌介导的烟草转化研究发现通过增加培养基中ＮＨ４ＮＯ３的浓度，转化效率比对照提高了３倍。
小麦的基因枪转化研究中也发现高浓度的ＮＨ４ＮＯ３不仅可以使转化效率增加７倍，而且胚性愈伤组织的发生效率也增加了２倍［１６］。
本实验的结果也证明２．５倍的ＮＨ４ＮＯ３浓度对农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化过程中愈伤组织的再生率、抗性苗数目的提高均有帮助。
在侵染过程中，运用高渗处理被认为可以提高转化效率，这可能是由于高渗处理后细胞内外形成压力差，细胞发生质壁分离，液泡变小，此时再与农杆菌混合，能有效地促使农杆菌吸附在细胞表面，并借助此压差更易转入到愈伤组织细胞内［１７］。
另外本研究发现高渗处理可以提高抗性愈伤的再生率，可能是由于成熟胚诱导的愈伤组织分化能力比较差，经高渗处理后，产生胁迫应答，使部分愈伤组织重呈胚性状态，从而明显地提高抗性愈伤的比率。
以上研究结果对于进一步开展以小麦成熟胚为外植体源的遗传转化研究具有参考意义。
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