根癌农杆菌介导的遗传转化
通过基因插入失活获得能覆盖整个基因组的突变体库是功能基因组学研究的基础性工作，但是建立真菌突变体库的传统方法都存在缺点．如转座子法的插入位点不完全随机，而且倾向于插入非编码位点；REMI导致较高比例的非质粒插入突变体，而且易产生多拷贝插入，这给突变体分析带来很多麻烦。相对于转座子和REMI技术，农杆菌介导的真菌转化具有以下四个特点：
4.2真菌受体对转化效率的影响
选择合适的受体组织对于实现丝状真菌高效快捷的转化非常重要。大多数丝状真菌很容易培养产生大量的分生孢子，因此采用孢子或刚萌发的孢子作为受体通常是真菌转化中最方便高效的选择［8］。对于产孢子能力差甚至于不产孢的菌株，可以直接以菌丝体组织为受体进行转化操作。采用不同受体组织，转化效率往往会受到影响。
2、丝状真菌ATMT转化大致过程
丝状真菌ATMT遗传转化过程比较简单，不需要复杂的仪器设备，且基本相同，依次为构建二元载体、活化根癌农杆菌、准备真菌分生孢子和共转化，大致如下：根据实验目的构建二元载体，挑取携有双元载体的根癌农杆菌单菌落到含有相应抗生素的基本培养（minimalmedium，MM)中培养过夜；收集菌体用诱导培养液（inductionmedium，IM)洗涤并稀释至一定的浓度后待用［或在含有乙酰丁香酮（AS，acetosyringone)的诱导培养液中培养后再使用］；取前述农杆菌液与等量新鲜的真菌受体混合，并涂布于固体共培养基（co-cultivationmedium，CM)承载的滤膜上（或以液体形式混合振荡培养)，恒温培养一段时间；洗脱（或吸取)共培养物，涂布选择性平板，培养至菌落形成后挑取转化子，将抗性菌落转移至新鲜含有适宜抗生素的培养基上培养，收集菌丝体．提取抗性菌落的基因组DNA， 通过Southern杂交来鉴定阳性转化子和确定插入T-DNA 的拷贝数，以及通过TAIL-PCR（thermal asvmmetric interlaced PCR)技术来获取T-DNA 的侧翼序列。
4、影响根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化效率的因素
转化效率高低是衡量一个转化系统好坏的重要指标．研究表明转化条件对农杆菌介导的遗传转化效率有明显的影响。影响转化效率的因素包括农杆菌菌株的类型、真菌受体类型、转化细胞的浓度、已酰丁香酮的用量、共培养时间和温度等。
4.1农杆菌菌株对转化效率的影响
能够转化丝状真菌的农杆菌有很多种，目前比较不同菌株对转化效率影响的实验还很少，因此不能判断哪个是最有效的转化菌株［2］。但是可以肯定菌株类型对转化效率是有影响的，而一些菌株根本不能用于特定真菌的转化。
4.3乙酰丁香酮对转化效率的影响
Michielse等研究表明农杆菌介导的真菌转化系统和植物转化系统的原理相同，都需要一系列Vir蛋白的参与．其中VirF、VirH和VirE3是丝状真菌转化不可缺少［9］。乙酰丁香酮（AS)在转化中的作用是诱导Vir毒蛋白的产生。研究表明AS是转化成功与否的决定性因素．对Beauveria bassiana、Fusarium oxysporum和Trichode viride等真菌的转化条件研究表明．在诱导过程中不加入AS会导致转化效率的降低［10］。而共培养过程中缺少AS会导致无转化子的产生［11』另外乙酰丁香酮在诱导和共转化过程中的浓度也影响转化效率。
3.3随机插入单拷贝
ATMT的非同源转化，大部分转化子为单拷贝的T-DNA 插入。转化子基因组中T-DNA插入比例高，且多为单拷贝插入。REMI方法转化的突变体20％～100％都不是由DNA插入引起的，而农杆菌转化的突变体有90％以上都是由DNA插入引起的［7］。
3.4转化子稳定
农杆菌介导的丝状真菌遗传转化体系可以利用各种形式的受体．因此当采用具有单核的分生孢子为转化受体时可以得到后代不分离的转化子，避免了真菌菌丝多核所造成的转化子不稳定的难题。而转座子法和REMI等转化方法都需要采用多核的菌丝为原料置备原生质体，产生不稳定的转化后代。
根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展
摘要：根癌农杆菌介导的遗传转化系统因具有操作简便，转化效率高，容易得到单拷贝随机插入的转化子，并且转化子稳定等特点而成为近年来丝状真菌遗传转化的主要研究手段之一，也使该系统有可能成为丝状真菌基因组研究的有力工具。本文就根癌农杆菌转化丝状真菌原理、过程、种类、影响转化效率的因素及其应用等方面进行了综述。
4.5转化时间对转化效率的影响
转化时间是影响转化效率的另一因素．一些研究也证明48h为最佳共培养时间［14］，随着共培养时间的延长，抗性转化子的数目也随之增多。但是对于不同的丝状真菌来说．所采用的共培养时间差异很大［15］。
4.6转化温度对转化效率的影响
共转化温度也是影响转化效率的重要因素．研究者对20～37℃这一温度范围农杆菌的转化效率进行了研究．认为22～25℃是最适的转化温度［16］。过高的转化温度会使农杆菌的转化功能丧失，从而导致转化效率降低。
参考文献
[1]Yan PS (闫培生), Luo XC (罗信昌), Zhou Q (周启). Advanceand prospectof filamentous fungi gene engineering.ProgBiotech(生物工程进展), 1999,19: 36～41
[2] Michielse CB,Hoykaas PJ,v&n den Hondel CA,et 01．Agrobacterium-mediated transformation as tool for functional genomics in fungi[J]．Gurr Genet,2005,48:1
5.2利用基因插入突变标记、克隆相关基因
插入突变是另一个反向遗传学的研究方法［19］。当T-DNA中不存在与受体染色体同源序列时，T-DNA主要以异源重组形式整合进染色体基因组中。因此，可利用T-DNA 标签法产生插入突变从而分离克隆真菌相关基因［20］。
6、前景及展望
真菌的遗传转化的效率极大的影响着真菌功能基因组学研究的开展和深入。根癌农杆菌介导的丝状真菌的转化，克服了丝状真菌用常规转化方法转化率低、操作繁杂等缺点。也正由于这一转化系统具有操作简便、转化高效稳定、T-DNA在真菌染色体基因组中的随机插入以单位点为主、位点整合精确且可转移大片段DNA等优点，非常适合于构建各种真菌的随机插入突变体库，有利于新基因的标记和快速克隆［21］，使该系统成为丝状真菌基因组研究的有力工具，并显示出了良好的发展潜力，具有广阔的应用前景［22］。相信随着对农杆菌介导真菌遗传转化各个因素的进一步深入研究和探讨， 更多的真菌将会利用该方法成功地实现遗传转化。
与根癌农杆菌介导植物遗传转化相似，农杆菌转化真菌时，同样需要vir（virulence)基因的活化，即T-DNA（transferred DNA)转移至真菌同植物一样是依赖于毒性系统的。Michieise等利用一系列毒性蛋白基因缺失的农杆菌突变体转化Aspergillusawamori，以阐明不同毒性蛋白在T-DNA转移至A．awamori的作用。研究结果显示，任何一个调节蛋白（VirA，VirG)，或者是转运通道蛋白（virB)，或是T链复合物形成蛋白（VirD，VirC，VirE2)的失活都会严重的降低转化效率。这一结果表明，农杆菌介导A．awamori的高效转化需要一个完整的T-DNA转移机制。这些都证明农杆菌转化高等和低等真核生物的机理具有一定的保守性。然而，Michielse等的研究也显示，VirE3，VirH，VirF毒性蛋白，在农杆菌转化A．awamori的过程中并不是必需的。另有研究表明控制农杆菌向植物细胞附着的chvA，chvB及exoC基因在酵母的转化中也并非必不可少。因此，根癌农杆菌转化真菌的机理还需要由更多相关的试验研究来阐明。
5、根癌农杆菌介导真菌遗传转化的应用
5.1利用基因敲除研究基因功能
利用基因敲除方法可为研究基因功能提供最直接最有力的证据［17］。当T-DNA中含有与宿主基因组同源的序列时，T-DNA就会以同源重组的方式整合进基因组，并且双交换同源重组占相当比例［18］。因此，将目标基因的部分序列克隆至T-DNA 两个边界之间，构建目标基因的打靶载体，然后利用农杆菌介导进行转化，就可以实现目标基因的敲除，进而根据表型变化来研究该基因的功能。
近年来发展了很多转化的方法，但并非所有方法都适用于丝状真菌。以往丝状真菌的常规转化方法有PEG介导的原生质体转化，限制酶介导的插入突变（Restriction enzyme-mediated insertional，REMI)等，但是这些转化技术或需要制备原生质体、或转化效率低．阻碍了它们在研究丝状真菌功能基因中的应用。根癌农杆菌介导的转化体系（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)克服了这些缺点．为丝状真菌的遗传转化和功能基因研究提供了有力的工具，现已被广泛地运用于丝状真菌的遗传操作目前已经实现了对泡盛曲霉（Aspergilus awamori)、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa)、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)和瓜类炭疽（Colletotrichum lagenarium)等60多种真菌的遗传转化［2］。
转化时仍然需要制备原生质体。不同真菌原生质体制备的条件差异很大，因此往往碰到原生质体制备率或再生率低［5］等问题。而ATMT转化的受体材料可以是多种类型的，既可以用原生质体，也可以用分生孢子、菌丝甚至真菌组织体［6］。
3.2转化效率高
同传统的真菌转化方法，如PEG．CaCI2法相比，ATMT方法的转化效率有明显提高。研究表明农杆菌介导丝状真菌的转化效率一般在300～7200个转化子每107个细胞． 比一般真菌转化方法高100～1000倍［6］。
4.4菌体浓度对转化效率的影响
转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度都影响转化效率。较高的受体孢子浓度转化率相对较高。同样使用较高浓度的农杆菌也可以提高转化效率。但是对这两个因素来说其最高使用浓度都有一定的界限［12］．当受体真菌的细胞浓度过高时则导致真菌的过量生长而不能挑出转化子，使转化效率降低。［13］同样原因，当农杆菌浓度过高时由于农杆菌过度生长引起严重污染，也会导致转化率下降。
分子生物学-根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化
根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化1 柑桔材料的准备不同品种的柑桔胚性愈伤组织保存于MT固体培养基上，每20-25d继代一次。
侵染前转入悬浮MT（附加100μM乙酰丁香酮）培养基中培养4天后用于侵染。
2 农杆菌侵染液的制备1.农杆菌（保存在-70℃）在含有50 mg·L-卡那霉素的YEB选择培养基上划线培养，28℃暗培养。
2.长出菌落后，挑取单菌落在新的选择培养基上涂皿。
3.取出培养24小时后的菌落群，再用不加卡那霉素的MT（附加100μM乙酰丁香酮）液体培养基震荡培养2个小时。
4.用分光光度计测量菌液的OD600值，并用MT液体培养基调整到 OD600=0.5～1.0进行侵染。
3侵染实验1.将悬浮培养4d的愈伤组织转入稀释菌液中浸泡20-30 min。
2.用无菌滤纸吸干表面菌液，转到MT基本培养基上，19℃共培养2～3 d。
3.共培养后的愈伤组织在无菌水中轻轻漂洗数次，直至洗液变清为止，再加入含有400 mg/L头孢霉素的无菌水浸泡20 min，倾去洗液。
4.将外植体置于无菌滤纸上吸干，转入筛选培养基（根据不同的质粒载体添加不同浓度的筛选剂），28℃暗培养。
4抗性愈伤组织的选择培养和再生（以质粒载体pCAMBIA1303为例）1.愈伤组织刚转移到筛选培养基上时，应该表现为对照逐渐褐化、死亡，转化处理的愈伤组织中转化部分逐渐长出新的抗性愈伤组织。
2.将新形成的抗性愈伤组织转至新的筛选培养基上进行继代培养，当得到的抗性胚性愈伤组织达到一定量时，将一部分转入MT+甘油2%+ Cef 50 mg·L-1的胚状体分化固体培养基上。
3.有球形胚状体开始出现后，将得到的胚状体转入MT+ME 1500 mg·L-1+ Cef50 mg·L-1培养基上，使胚状体进一步长大，形成子叶型胚状体。
7-9周后，将子叶型胚状体转入MT+Cef 50 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1 +BA 0.5mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培养基上再生芽，1个月后就可见再生芽长出。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种广泛应用于真菌基因功能研究与基因工程改造的技术。
通过利用根癌农杆菌T-DNA插入系统，将外源DNA转移至真菌细胞中，并将其整合到其基因组特定位点中，以此实现真菌基因突变、功能分析和引入外源基因等目的。
本文将介绍根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的原理、方法和应用，并对其研究进展进行概述。
一、技术原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种经常被应用于植物基因工程的重要媒介，其T-DNA插入系统是实现外源基因整合的重要工具。
T-DNA是根癌农杆菌质粒中可转移DNA的一部分，其特点是，在植物感染过程中，T-DNA可被转移至寄主植物细胞内，并随后整合到其基因组中。
利用这一特点，将要转化的DNA导入到T-DNA载体中，然后插入到根癌农杆菌中，再将根癌农杆菌和真菌竹蜜菇接触，使得根癌农杆菌向真菌转移T-DNA，并通过T-DNA的插入将外源DNA整合到真菌基因组中。
二、方法简介根癌农杆菌介导的真菌遗传转化分为三个主要步骤，包括构建T-DNA载体、初始感染和筛选鉴定。
1. T-DNA载体构建T-DNA载体是根癌农杆菌之间传递转移DNA的载体，也是构建真菌遗传转化所需的载体。
在构建T-DNA载体时，需要创建flanking序列、筛选标记和转入基因。
其中，flanking序列是T-DNA插入到基因组中的标记，通常使用真核生物的基因表达元件，如启动序列或终止序列等，在T-DNA插入过程中随之整合到基因组中。
筛选标记则是指用于鉴定转化后的真菌是否包含T-DNA的标志，一般建议选择抗性基因或荧光蛋白基因。
转入基因则是要转入真菌中并施加特定的功能的外源基因。
2. 初始感染根癌农杆菌与真菌的接触是通过共培养实现的。
首先，将竹蜜菇生长在含有不同浓度的根癌农杆菌悬浮液的培养基上。
当根癌农杆菌悬浮液达到适当的浓度时，将其与真菌孢子混合，并将混合物培养在适当的时间和温度下，使根癌农杆菌向真菌细胞释放T-DNA，再经过植物激素、光照等处理，使真菌细胞产生表型变化，如生长速度快慢、菌丝分化、子实体大小等，这些都是外源DNA整合到基因组中的结果。
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种重要的生物技术手段，被广泛应用于真菌基因工程研究和相关产业生产中。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术利用农杆菌Ti质粒中的T-DNA片段将外源基因导入真菌细胞内，使真菌细胞具有新的遗传特性。
近年来，随着生物技术的发展和研究的深入，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究取得了令人瞩目的进展。
一、根癌农杆菌介导的真菌遗传转化原理及方法1.构建适合真菌的质粒载体，将外源基因插入T-DNA载体中，构建成适合真菌遗传转化的质粒载体。
2.将构建好的质粒载体通过农杆菌进行转化，使其含有T-DNA片段。
3.利用农杆菌与真菌细胞的接触，将质粒中的T-DNA片段导入真菌细胞内。
4.筛选和鉴定转化后的真菌株系，确认外源基因是否成功导入真菌细胞中，并对转化菌株进行鉴定和分离纯化。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在农业生产中有着广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 抗病力提高：根癌农杆菌介导的真菌遗传转化可以实现真菌对病原菌的抗性提高，使植物在生长过程中更加健康，减少病害发生的可能性。
2. 产量增加：通过真菌遗传转化技术可以使真菌获得更好的生长特性和代谢特性，从而提高作物产量。
3. 抗逆性提高：真菌经过遗传改造后，可能对环境中的逆境条件具有更强的抵抗能力，使植物更加适应不良环境的生长条件。
4. 品质改进：真菌遗传转化技术还可以用于改进植物的品质，比如提高农作物的风味、口感等。
1. 药物生产：利用真菌遗传转化技术可以大规模生产生物药物，比如抗生素、激素等，在生物医药领域有着重要的应用。
2. 新药研发：真菌遗传转化技术可以用于研发新的药物，通过改造真菌代谢途径等方式，获得新型的生物活性化合物。
3. 医学研究：真菌遗传转化技术也可以用于医学研究领域，比如用于疾病的基因治疗、蛋白质表达等。
1. 技术改进：研究者不断优化根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术，提高转化效率和稳定性，为真菌的遗传改造提供更好的手段。
根癌农杆菌介导CMO基因在96-Ⅱ喜树中的遗传转化
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材 料
将 无菌苗顶端完全伸展的叶片剪成直径 ０ ． ５ ｃ ｍ 的叶盘 ， 接种在愈伤组织诱导 培养 基上 ， 每个处理 ３ Ｏ个外植 体 ， 预培 养 ０— ７ ｄ 。用 Ｄ 为０ ． ２～１ ． ０的菌液侵染 预培养后 的外
植体 ， 以未被侵染的外植体作对照 。侵染期间不断摇 动 ， 使农
脂、 ｐ Ｈ值为 ５ ． ８ ， 培养 温度 为 （ ２ ５ ４ － ２ ）℃ ， 光 源为 日光灯 ， 光
照时间为 １ ６ ｈ ／ ｄ 。 根癌 农 杆 菌 菌 株 Ｌ Ｂ Ａ ４ ４ ４、 ０ 质粒 ｐ Ｂ Ｉ １ ２ １ （ 含 有 单 拷 贝 Ｃ ＭＯ基 因， 用于转 化） 来源于大连理工大学生物工程研究 所。
该植物表达载体 含有 Ｃ ａ ＭＶ ３ ５ Ｓ启 动子驱 动的辽 宁碱蓬 胆碱
单加氧酶 Ｃ ＭＯ基 因以及 １ 个嵌合 Ｎ ｏ ｓ Ｎ Ｐ ＴＩ １ 基 因（ 图１ ） 。用 液氮冻融法将 ｐ Ｂ Ｉ １ ２ １ 一Ｃ ＭＯ导入菌株 Ｌ Ｂ Ａ ４ ４ ０ ４ 。 工具酶购 自 Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ 公 司， Ｄ Ｉ Ｇ标记试剂盒购 自 Ｒ ｏ ｃ ｈ ｅ 公 司， 用 于分子检 测 的 Ｃ ＭＯ基 因引 物 由生工 生物 工程 （ 上海 ） 有限公 司合 成。其他 常规试剂均 为国产分析纯 。
江苏农 业科 学 ２ ０ １ ３年第 ４ １ 卷第 ４期
农杆菌介导法
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。
下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。
该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
农杆菌介导遗传转化原理
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冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
根癌农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究进展
将农杆菌作为载体成功获得转基因烟草的试验发生在1983年，其后的30多年，农杆菌介导的遗传转化技术在双子叶植物的研究中得到了长足发展。
之后，关于单子叶植物在这方面的研究却比较少，因为农杆菌寄主范围局限于双子叶植物和一些裸子植物。
单子叶植物被认为不能作为农杆菌的宿主，所以难以被转化。
因此最初人们关于单子叶植物通过根癌农杆菌介导遗传转化的研究很少，而多是采用PEG法、基因枪法及电激法等。
1根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展1.1水稻水稻作为单子叶植物研究的模式植物，关于根癌农杆菌介导水稻遗传转化的研究开始得比较早。
水稻的遗传转化研究从完全否定其可行性，到可以进行转化，从低频率转化到高频率，经过几十年的研究发展，已经具备了相当的理论基础和研究成果，实现了许多优质的外源基因对水稻的遗传转化[1]。
李宝健证明了水稻是可以通过农杆菌进行遗传转化的，并获得了转基因的水稻，虽然其转化频率很低，却是农杆菌介导转化单子叶植物的一大突破。
这之后，Hiei证明了水稻是可以被有效侵染的，他不仅利用胚性愈伤组织作外植体，还将粳稻的转化频率提高到28.3%，并建立了水稻的遗传转化体系。
王春萍等[2]将ThIPK2基因通过农杆菌介导法插入到籼稻科恢675中，经验证后，通过该试验结果完善了优良的遗传转化体系。
张燕红等[3]利用农杆菌介导法，将SiPEBP基因转入到秋田小町、新稻21号以及08GY30-5-4这3个新疆品种水稻中，试验结果表明，3个品种的抗性愈伤率皆达到了40%以上。
1.2玉米玉米作为三大粮食作物之一，是作为单子叶植物研究的重要对象。
1996年，Ishida等[4]选用玉米自交系A188幼胚作为受体的转基因试验，获得了世界上第一株用该方法转化的转基因玉米，从而证实玉米是能够被转化的，为玉米的遗传转化研究提供了一定的理论基础。
邢小龙等[5]将GUS作为目的基因，以玉米杂交种“郑单958”为材料，以Bar作筛选标记，试验结果表明，在侵染浓度0.6、侵染时间2h、真空处理时间10min的条件下，“郑单958”作为受体能有效提高转化效率。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化1
实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化一实验目的了解植物遗传转化的方法和理论掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术二原理植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。
自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。
农杆菌介导法土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。
农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
简略地说。
其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。
根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化的一些影响因素
摘
要： 对根癌农杆 菌介导的马铃薯遗传转化过程中涉及 的外植体选择 、 预培养 、 共培养时间等因素进行优
化 。结果表明 ， 马铃薯 的茎段和叶片均能诱导出愈伤组织并分化成苗 ； 在转化前对外植体预培养 ２ ｄ ， 再用 ０ Ｄ 为 ０ ． ５的农杆菌菌液侵染 １ ０ ｍｉ ｎ ， 共培养 ３ ｄ ， 转生苗进行 Ｐ Ｃ Ｒ检测 ， 结果表明 ， 特异切割马铃薯纺锤块茎类病毒 的核酶基因已导入 了马铃薯 。
Ｙ Ａ Ｎ Ｊ ｉ ａ ｎ － ｊ ｕ ｎ ， Ｂ Ａ Ｉ Ｙ ｕ ｎ － ｆ ｅ ｎ ｇ ２ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ Ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ － ｌ ｉ ａ ｎ ｇ Ｉ ， Ｆ Ｅ Ｎ Ｇ Ｒ ｕ ｉ － ｙ ｕ ｎ ２ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ Ｙ ａ ｏ ２ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ Ｗｅ ｉ — ｆ ｅ ｎ ｓ’ 。 （ １ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｘ ｉ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｔ ａ ｉ ｙ ｕ ａ ｎ ０ ３ ０ ０ ０ ６ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ． Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｃ ｒ ｏ ｐ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｘ ｉ
Ａｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｗ ｉ ｔ ｈ ０ ． ５ ０Ｄ６ ０ ０ ｆ ０ ｒ １ ０ ｍｉ ｎ ，ｃ ｏ — ｃ ｕ ｌ ｕｒ ｔ ｅ ｆ ｏ ｅ ｘ ｐ ｌ ｎｔ ａ ｓ ａ ｎ ｄ Ａｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｆ ｏ ｒ ３ ｄ ａ ｙ ｓ ． Ａ ｒ ｉ ｏｚ ｂ ｙ ｍｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ｉ ｎ ｇ ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ