根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化-PPT资料
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农杆菌转化原理及技术 PPT
愈伤诱导
NB培养基为基 本培养基加入相 应植物生长调节
剂
共培养
整个操作过 程约需8天
第一天（预培养） 第三天（划菌） 第五天（侵染、共培养) 第八天（脱菌、筛选）
抗性愈伤的筛选与 再生成完整植株
技术关键：诱导与培养“状态良好”的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继 代次数不超过8代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效 去除农杆菌或者抑制农杆菌生长（合适的抗生素及其浓度）；快速筛选（2-3次 筛选）；迅速分化再生。
Ti plasm id w ith the new gene
+
cell’s DNA
A g ro b a cteriu m
Plant cell
Transform ation
The new gene
Transgenic plant
C ell division农菌介导转化水稻的方法水稻（籼稻）根癌农杆菌转化技术流程
❖ Vir区为30Kb,由 VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、VirH 等七个操纵子共24个基因起共调控作用。
Ti质粒结构示意图
农杆菌侵染过程
❖ 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;
❖ 这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和 virG 基因,再诱导Vir区的其他基因;
❖ 根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒 （Ti质粒）。
❖ 根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区（Vir区）、结合区 （Con区）、复制起始区（Ori区）和T-DNA区四个部 分，其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。
❖ T-DNA区左右边界各有25bp的重复序列，其中14bp是 核心，分10bp（CAGGAATATAT)和4bp（GTAA)不连 续的两组，是完全保守的。
根癌农杆菌介导法课件
相较而言，二元载体更多优点： 1、构建方便； 2、效率高； 3、不会带人大量
无用的冗余DNA序列。
——二元载体
l基本原理： T-DNA区与Vir区不在同一个载
体上， Vir区通过反式作用使T-DNA区发生
转移。
微型Ti质粒
缺失Vir，T-DNA卸 甲，引入酶切位点
l根癌农杆菌
去掉T-DNA去
辅助Ti质粒
力，这些组织发生创伤活环境诱导时，加 速分裂，处于转化的敏感期。
——基因枪法Vs 农杆菌法
转化
宿主
操作
可
效率
范围
控度
基因枪法 低
无限制 简便
高
单子叶
根癌农杆 高 植物；一 复杂
低
菌介导法
些双子叶
植物
l 因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系, 改 造的Ti质粒就是一个优良的植物转基因载体。
Ti-质粒的基因结构
——Ti质粒结构 特点
T-DNA区 (transferred DNA region)
Vir区 (virulence region)
l 转移到植物基因组中的DNA 序列，与肿瘤形相关。
l 激活T-DNA的转移，使植物 致瘤，是毒性区。
Con区
l 调控Ti质粒在根癌农杆菌
( region encoding conjugation) 之间的转移，是接合转移
编码区。
Ori区 (origin of replication)
Байду номын сангаас
l 调控Ti质粒的自我复制， 为复制起始区。
——Ti质粒的改造 策略
由于野生Ti质粒直接作为植物基因工 程载体，存在许多障碍，故对野生型Ti质 粒可以采取两种不同的改造策略——一元 载体系统和二元载体系统。
无用的冗余DNA序列。
——二元载体
l基本原理： T-DNA区与Vir区不在同一个载
体上， Vir区通过反式作用使T-DNA区发生
转移。
微型Ti质粒
缺失Vir，T-DNA卸 甲，引入酶切位点
l根癌农杆菌
去掉T-DNA去
辅助Ti质粒
力，这些组织发生创伤活环境诱导时，加 速分裂，处于转化的敏感期。
——基因枪法Vs 农杆菌法
转化
宿主
操作
可
效率
范围
控度
基因枪法 低
无限制 简便
高
单子叶
根癌农杆 高 植物；一 复杂
低
菌介导法
些双子叶
植物
l 因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系, 改 造的Ti质粒就是一个优良的植物转基因载体。
Ti-质粒的基因结构
——Ti质粒结构 特点
T-DNA区 (transferred DNA region)
Vir区 (virulence region)
l 转移到植物基因组中的DNA 序列，与肿瘤形相关。
l 激活T-DNA的转移，使植物 致瘤，是毒性区。
Con区
l 调控Ti质粒在根癌农杆菌
( region encoding conjugation) 之间的转移，是接合转移
编码区。
Ori区 (origin of replication)
Байду номын сангаас
l 调控Ti质粒的自我复制， 为复制起始区。
——Ti质粒的改造 策略
由于野生Ti质粒直接作为植物基因工 程载体，存在许多障碍，故对野生型Ti质 粒可以采取两种不同的改造策略——一元 载体系统和二元载体系统。
根癌农杆菌
21
根瘤菌科，农杆菌属
（Agrobacterium）：
——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进 入细胞后，将T-DNA插入植物基因 组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状 不定根，干扰植物的正常生长
－根癌农杆菌（A. tumefaciens）
Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用）
纯化和稳定遗传 －不需要特殊的专用设备
缺点： －只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没
有方向性
33
也称微弹轰击法：将外源DNA包 被在微小的金粒或钨粒表面，然后 在高压的作用下微粒被高速射入受 体细胞或组织。微粒上的外源 DNA进入细胞后，整合到植物染 色体上，从而实现基因的转化。
可将基因枪分为三种类型： 第一类是以火药作为动力； 第二类是以高压气体作为动力； 第三类是以高压放电作为动力。
14
杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理
当昆虫吞食后，ICP在昆虫中肠的碱性消化液和胰蛋 白酶作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠 上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于 细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平 衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水 死亡。
由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性 条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响。
34
基因枪
35
1) 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺 价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因 矮牵牛等；
2) 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物 质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮 生长因子等；
3) 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中 的作用
13
Bt能杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素（杀虫晶体蛋白， Bt）。
根瘤菌科，农杆菌属
（Agrobacterium）：
——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进 入细胞后，将T-DNA插入植物基因 组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状 不定根，干扰植物的正常生长
－根癌农杆菌（A. tumefaciens）
Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用）
纯化和稳定遗传 －不需要特殊的专用设备
缺点： －只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没
有方向性
33
也称微弹轰击法：将外源DNA包 被在微小的金粒或钨粒表面，然后 在高压的作用下微粒被高速射入受 体细胞或组织。微粒上的外源 DNA进入细胞后，整合到植物染 色体上，从而实现基因的转化。
可将基因枪分为三种类型： 第一类是以火药作为动力； 第二类是以高压气体作为动力； 第三类是以高压放电作为动力。
14
杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理
当昆虫吞食后，ICP在昆虫中肠的碱性消化液和胰蛋 白酶作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠 上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于 细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平 衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水 死亡。
由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性 条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响。
34
基因枪
35
1) 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺 价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因 矮牵牛等；
2) 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物 质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮 生长因子等；
3) 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中 的作用
13
Bt能杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素（杀虫晶体蛋白， Bt）。
植物基因转化PPT课件
C、双元载体 • 利用两个载体分别提供T-DAN区域（卸甲的）和毒性功能
第20页/共29页
克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由 农杆菌完成目的基因向植物基 因组的转移
第21页/共29页
四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化 （二）基因枪 （三）整株植物转化 （四）叶绿体转化
第23页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒 一个中间载体（intermediate vector）组成 （一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适 的T-DNA片断，而构成的小型质粒 ）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
第5页/共29页
根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
第6页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
第11页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
第20页/共29页
克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由 农杆菌完成目的基因向植物基 因组的转移
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四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化 （二）基因枪 （三）整株植物转化 （四）叶绿体转化
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根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒 一个中间载体（intermediate vector）组成 （一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适 的T-DNA片断，而构成的小型质粒 ）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
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根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
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根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
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根癌农杆菌介导的遗传转化
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
三、根癌农杆菌Ti质粒转化方法
• 整体植株接种共感染法 • 优点：实验周期短；充分利用无菌实生苗 的生长潜力；避免在转化过程中其它细菌 污染；避免农杆菌在培养基上的过度生长； 具较高的转化率。 • 缺点：嵌合体严重；转化细胞的筛选困难。 • 原生质体共培养转化法 • 最大优点实减少嵌合体产生；缺点是原生 质体再生困难，获得转化株少，操作比较 复杂。
• 叶盘转化法 • 优点：适用性广；改良的叶盘法可以适用于其它 外植体如茎段、子叶等；操作简单且重复性高。 • 注意事项：掌握叶组织侵入农杆菌培养液的适宜 时间；叶片在培养过程中常膨大而扭曲，可把切 口边缘压入埋藏在培养基中；制备叶盘是最好避 免叶脉进入。
农杆菌Ti质粒转化系统的优点
• 该转化系统是模仿天然的转化载体系统，成功率高， 效果好； • 机理研究最清楚，方法最成熟，应用最广泛； • Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DNA片段插入，目 前已把50kb的DNA转入植物细胞中； • 农杆菌Ti质粒转化系统的外源基因以单拷贝为多 数，遗传稳定性好，且多数符合孟德尔遗传规律。
• 根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因 导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源 基因在植物细胞中得到表达，致使植物细胞 转化为肿瘤状态，并大量合成冠瘿碱。这些 冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源，有利于农杆 菌的繁殖和Ti质粒的转移，进一步扩大侵染 领域。
二、根癌农杆菌转化程序及操作原理
农杆菌基因转化可分为三部分： • 受体系统的建立； • Ti质粒转化载体的构建； • 目的基因的转化。
农杆菌附着后不能立即转化只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤因此共培养时间必须长于16h时间过长由于农杆菌的过度生长植物细胞因受到毒害而死亡
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
植物基因工程载体及其构建ppt课件
一、T-DNA的加工及转移
Vir基因操纵子系统被活化后，在农杆菌中可测到单链TDNA（ss T-DNA，亦称T链或正链），T链的形成取决于 VirD1及VirD2两种蛋白，这些蛋白一起决定内切酶活性， 在边界重复序列的特定位点形成切口，产生单链断裂。因 为T链的合成是从右边界至左边界，即5′→3′，若右边界缺 失，则T链的合成便无法开始，故目前认为T-DNA是以T链 形式向植物细胞转移的，而不是双链的T-DNA分子。左边 界作为DNA合成起始点的效率比右边界低，这并不是因为 左、右边界的核苷酸序列有什么不同，而是因为在右边界 的右边约17bp的超驱动序列，它可使T链的形成大大增加， 故 被 称 作 为 “ 转 化 增 强 子 （ transfer enhancer 或 overdrive），除去增强子序列导致菌株致病力消失。T链 的形成过程如图8-1示出。
左边界（TL）缺失突变仍能致瘤,但右边界（TR）缺失则不再能
致瘤,这里几乎完全没有T-DNA的转移,这说明右边界(TR)在T-DNA 转移中的重要性。
3. T-DNA上的编码基因及功能
T-DNA的转录有下述共同点：
①T-DNA的两条链都是有意义链,即都能被转录。
②T-DNA上每个基因都有各自的启动子。
第二节 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能 二、T-DNA的基因结构与功能 三、Vir区操纵子的基因结构与功能
一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能
1. Ti质粒的遗传特性及类型
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传 物质，为双股共价闭合的环状DNA分子， 其分子量为95～156×106D, 约有200kb组 成。
3. VirG操纵子的诱导表达及功能
VirG操纵子小于VirA，只有1.0kb，同样是单基因 结构，只能编码一条多肽，被称为VirG蛋白，即DNA结 合活化蛋白（DNA-binding activator protein）。它的C 端已知有DNA结合活性。它的N未端部分具有磷酸化的 酸性结构。当磷酸化的A蛋白将其磷酸基转到VirG蛋白 （30kD）保守的天冬氨酸盐残基上时，使VirG蛋白活化。 活化的VirG蛋白可能以二体或多体形式结合到Vir区启动 子的特定区域，从而成为其它Vir基因转录的激活因子， 打开VirB、C、D、E、H等几个基因。并己证明，VirA或 VirG突变后会减弱或完全失去对其它Vir位点活化的诱导。 VirA及VirG的这种调控作用被称为双因子调控体系（two 一component regu1atory system）。
植物细胞转基因技术幻灯片PPT
基因枪法最早是由美国康 奈尔大学的Sanford最先提出 的。它通过高速飞行的金属颗 粒将包被其外的目的基因直接 导入到受体细胞内，最后整合 到植物基因组并得以表达从而 实现基因转化的方法。1992 年，世界首例转基因小鼠就是 通过该法获得的。
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头 特制手枪
射击植物
优点： 抑制了受体材料的限制，不必制备原生质体。 实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 缺点： 进去的DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易获得再生植株。
固
➢ 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处
理
➢ 使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固
着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进展操作。
优点：
转化率高，特别是在没有适宜的DNA载体系统时 更有价值
对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接 受位点
受体不用特殊的选择系统
可以控制转移的量和转移物的浓度
DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿主, 可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染 色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、 电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离 子束介导法和花粉管通道法。
➢基因枪法 ➢电击法 ➢花粉管通道法 ➢化学物质诱导法 ➢显微注射法 ➢脂质体法
1.基因枪法
利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
4.化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特
定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。 常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、 PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头 特制手枪
射击植物
优点： 抑制了受体材料的限制，不必制备原生质体。 实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 缺点： 进去的DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易获得再生植株。
固
➢ 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处
理
➢ 使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固
着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进展操作。
优点：
转化率高，特别是在没有适宜的DNA载体系统时 更有价值
对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接 受位点
受体不用特殊的选择系统
可以控制转移的量和转移物的浓度
DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿主, 可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染 色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、 电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离 子束介导法和花粉管通道法。
➢基因枪法 ➢电击法 ➢花粉管通道法 ➢化学物质诱导法 ➢显微注射法 ➢脂质体法
1.基因枪法
利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
4.化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特
定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。 常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、 PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG
根癌农杆菌介导植物基因遗传转化技术共36页
成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
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• 诱导物的采用三种方法：1）在农杆菌液体培养基 时加AS，加入时间在制备工程菌侵染液前4－6小时 加入；2）AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基 中；3）在农杆菌液体培养基中和共培养基中都加 入AS。
• 含AS的培养基PH值为5.0-5.6时，vir区基因的诱导 达最高水平。
外植体的选择
• 通过对不同外植体转化成功的实例分析， 叶片（叶柄）为35％、子叶为9％、胚轴 为10％、茎为17％。
三、根癌农杆菌Ti质粒转化方法
• 整体植株接种共感染法 • 优点：实验周期短；充分利用无菌实生苗
的生长潜力；避免在转化过程中其它细菌 污染；避免农杆菌在培养基上的过度生长； 具较高的转化率。 • 缺点：嵌合体严重；转化细胞的筛选困难。 • 原生质体共培养转化法 • 最大优点实减少嵌合体产生；缺点是原生 质体再生困难，获得转化株少，操作比较 复杂。
移到含抗生素的培养基上培养。 • 脱菌的抗生素：常用的脱菌抗生素有羧苄
青霉素、头孢霉素等；使用原则是在达到 抑制农杆菌生长的目的后，尽量降低其浓 度。 • 脱菌培养时间：脱菌培养的时间一般需5－ 6次继代培养，有的一直使用抗生素，直到
试管苗形成。
• 转化体的选择培养
• 选择压：抗生素加入培养基后，对细胞 的生长产生一种选择作用，即为选择压 。加入的抗生素浓度越大，选择压也越 大。选择压的强度应根据植物的特性而 定，一般浓度范围Km为50－100mg/L； htp为10－20 mg/L ，ppt为5－20 mg/L 。
2）田间取材通过预培养起驯化作用，使外植体 适应于试管离体培养条件，保持活跃的生长代谢状 态；
3）减少外植体转化过程中的杂菌污染率；
• 有利于侵染接种的外植体能与培养基平整接触；
• 外植体的预培养时间和培养效果有明显关系，一般 2－3天为宜。
外植体的农杆菌接种
• 掌握外植体在菌液中浸泡的时间，一般控 制在数秒至数分，以叶盘边缘充分湿润为 度，不要超过30分钟；
• 不同外植体与农杆菌的最佳共培养时间不同。
• 农杆菌的增殖适度 • 共培养中农杆菌的增殖适度直接与转
化有关，农杆菌增殖和生长状态与其 侵染能力相关。 • 控制农杆菌增殖的方法：
1）调整工程菌的浓度； 2）控制共培养时间； 3）使用抗生素调控农杆菌的增殖 生长。
外植体脱菌及选择培养
• 外植体的脱菌培养 所谓脱菌培养，就是把共培养的外植体转
根癌农杆菌的遗传宿主及内共生原理
• 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号 ；
• 这些化学诱导物通过农杆菌的细胞膜，活化virA和 virG基因，再诱导vir区的其他基因；
• vir基因的活化，作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移； • T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上； • T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素； • 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因，分解
• 转化外植体的选择原则： 1）以叶片、子叶、胚轴为首选材料； 2）要注意外植体年龄，选择幼年的外
植体； 3）以幼胚、体细胞胚及成熟胚作为外
植体应考虑其转化的最佳感受期； 4）应考虑感受太细胞在外植体的部位
。
外植体的预培养、接种及共培养
• 外植体的预培养作用：
1）促进细胞分裂，分裂状态的细胞更容易整合 外源DN部分： • 受体系统的建立； • Ti质粒转化载体的构建； • 目的基因的转化。
根癌农杆菌的制备
• 农杆菌的培养、生长状态及纯度对转化具有重要作用 。
• 农杆菌的培养：
1）培养基：目前常用的农杆菌培养基有LB、YEB、 YEM、TY、PA、523等，其中LB、YEB、YEM、523属富 集培养基，是常用的制备工程菌液的培养基；PA和TY 是常用的农杆菌选择培养时的培养基。
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
学生：贾俊忠 学号：2019103070
一.根癌农杆菌的生物学特性 • 农杆菌细胞呈杆状，以1－4根周生鞭毛进行
运动。农杆菌侵染时，细菌通过原有的病斑 或伤口进入宿主组织，但细菌本身不进入宿 主植物细胞，只是把Ti质粒的DNA片段导入 植物细胞的基因组中； • 根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，对单 子叶植物不很敏感。
• 在选择培养条件下再生细胞和转化细胞是 否一致，关系到能否得到真正的转会体， 只有同时具有再生和转化潜力的细胞才有 可能分化成转基因植株。
• 假转化体产生的原因：1）外植体的再生部 位与选择培养基未充分接触，选择压不起 作用；2）转化细胞对非转化细胞的滋养作 用；3）转移T-DNA未整合，只是瞬时表达 ；4）生理性抗性植株。
• 选择的方法及时期
• 根据选择和再生的关系分两种：一种 是先再生后选择，弊端是嵌合体严重， 假转化体多，后期选择纯化困难；另 一种是先选择后再生，转化体少，但 嵌合体少，假转化体少，转化体纯化 方便。
•
根据选择压加入的时期不同，分为前 期选择、延迟选择和后期选择。
• 选择培养过程中转化和再生细胞的一致性
植物细胞产生的冠瘿碱作为唯一的碳源和氮源； • 冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti
质粒的接合转移，扩大侵染范围。
• 根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因 导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源 基因在植物细胞中得到表达，致使植物细胞 转化为肿瘤状态，并大量合成冠瘿碱。这些 冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源，有利于农杆 菌的繁殖和Ti质粒的转移，进一步扩大侵染 领域。
2）农杆菌的生长条件：农杆菌培养分为固体平板 培养和液体振荡培养，固体培养一般需2－3天，液体 培养一般需1－2天，25－30度；当细菌增长达对数生 长期，可以稀释培养或储存于4度冰箱；用光密度测
定法测定农杆菌浓度。
Vir区基因活化诱导物的使用
• Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化 合物对vir区基因的活化具有重要作用，常用的诱 导物是乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮；
• 菌液浓度对不同植物的外植体有一定差异 ，一般浓度范围OD600＝0.05-0.7之间；
• 浸泡后的外植体在滤纸上吸干要适度。
农杆菌与外植体的共培养
• 最佳共培养时间：农杆菌附着后不能立即转化， 只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤 ，因此，共培养时间必须长于16h，时间过长，由 于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死 亡。
• 含AS的培养基PH值为5.0-5.6时，vir区基因的诱导 达最高水平。
外植体的选择
• 通过对不同外植体转化成功的实例分析， 叶片（叶柄）为35％、子叶为9％、胚轴 为10％、茎为17％。
三、根癌农杆菌Ti质粒转化方法
• 整体植株接种共感染法 • 优点：实验周期短；充分利用无菌实生苗
的生长潜力；避免在转化过程中其它细菌 污染；避免农杆菌在培养基上的过度生长； 具较高的转化率。 • 缺点：嵌合体严重；转化细胞的筛选困难。 • 原生质体共培养转化法 • 最大优点实减少嵌合体产生；缺点是原生 质体再生困难，获得转化株少，操作比较 复杂。
移到含抗生素的培养基上培养。 • 脱菌的抗生素：常用的脱菌抗生素有羧苄
青霉素、头孢霉素等；使用原则是在达到 抑制农杆菌生长的目的后，尽量降低其浓 度。 • 脱菌培养时间：脱菌培养的时间一般需5－ 6次继代培养，有的一直使用抗生素，直到
试管苗形成。
• 转化体的选择培养
• 选择压：抗生素加入培养基后，对细胞 的生长产生一种选择作用，即为选择压 。加入的抗生素浓度越大，选择压也越 大。选择压的强度应根据植物的特性而 定，一般浓度范围Km为50－100mg/L； htp为10－20 mg/L ，ppt为5－20 mg/L 。
2）田间取材通过预培养起驯化作用，使外植体 适应于试管离体培养条件，保持活跃的生长代谢状 态；
3）减少外植体转化过程中的杂菌污染率；
• 有利于侵染接种的外植体能与培养基平整接触；
• 外植体的预培养时间和培养效果有明显关系，一般 2－3天为宜。
外植体的农杆菌接种
• 掌握外植体在菌液中浸泡的时间，一般控 制在数秒至数分，以叶盘边缘充分湿润为 度，不要超过30分钟；
• 不同外植体与农杆菌的最佳共培养时间不同。
• 农杆菌的增殖适度 • 共培养中农杆菌的增殖适度直接与转
化有关，农杆菌增殖和生长状态与其 侵染能力相关。 • 控制农杆菌增殖的方法：
1）调整工程菌的浓度； 2）控制共培养时间； 3）使用抗生素调控农杆菌的增殖 生长。
外植体脱菌及选择培养
• 外植体的脱菌培养 所谓脱菌培养，就是把共培养的外植体转
根癌农杆菌的遗传宿主及内共生原理
• 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号 ；
• 这些化学诱导物通过农杆菌的细胞膜，活化virA和 virG基因，再诱导vir区的其他基因；
• vir基因的活化，作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移； • T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上； • T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素； • 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因，分解
• 转化外植体的选择原则： 1）以叶片、子叶、胚轴为首选材料； 2）要注意外植体年龄，选择幼年的外
植体； 3）以幼胚、体细胞胚及成熟胚作为外
植体应考虑其转化的最佳感受期； 4）应考虑感受太细胞在外植体的部位
。
外植体的预培养、接种及共培养
• 外植体的预培养作用：
1）促进细胞分裂，分裂状态的细胞更容易整合 外源DN部分： • 受体系统的建立； • Ti质粒转化载体的构建； • 目的基因的转化。
根癌农杆菌的制备
• 农杆菌的培养、生长状态及纯度对转化具有重要作用 。
• 农杆菌的培养：
1）培养基：目前常用的农杆菌培养基有LB、YEB、 YEM、TY、PA、523等，其中LB、YEB、YEM、523属富 集培养基，是常用的制备工程菌液的培养基；PA和TY 是常用的农杆菌选择培养时的培养基。
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
学生：贾俊忠 学号：2019103070
一.根癌农杆菌的生物学特性 • 农杆菌细胞呈杆状，以1－4根周生鞭毛进行
运动。农杆菌侵染时，细菌通过原有的病斑 或伤口进入宿主组织，但细菌本身不进入宿 主植物细胞，只是把Ti质粒的DNA片段导入 植物细胞的基因组中； • 根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，对单 子叶植物不很敏感。
• 在选择培养条件下再生细胞和转化细胞是 否一致，关系到能否得到真正的转会体， 只有同时具有再生和转化潜力的细胞才有 可能分化成转基因植株。
• 假转化体产生的原因：1）外植体的再生部 位与选择培养基未充分接触，选择压不起 作用；2）转化细胞对非转化细胞的滋养作 用；3）转移T-DNA未整合，只是瞬时表达 ；4）生理性抗性植株。
• 选择的方法及时期
• 根据选择和再生的关系分两种：一种 是先再生后选择，弊端是嵌合体严重， 假转化体多，后期选择纯化困难；另 一种是先选择后再生，转化体少，但 嵌合体少，假转化体少，转化体纯化 方便。
•
根据选择压加入的时期不同，分为前 期选择、延迟选择和后期选择。
• 选择培养过程中转化和再生细胞的一致性
植物细胞产生的冠瘿碱作为唯一的碳源和氮源； • 冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti
质粒的接合转移，扩大侵染范围。
• 根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因 导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源 基因在植物细胞中得到表达，致使植物细胞 转化为肿瘤状态，并大量合成冠瘿碱。这些 冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源，有利于农杆 菌的繁殖和Ti质粒的转移，进一步扩大侵染 领域。
2）农杆菌的生长条件：农杆菌培养分为固体平板 培养和液体振荡培养，固体培养一般需2－3天，液体 培养一般需1－2天，25－30度；当细菌增长达对数生 长期，可以稀释培养或储存于4度冰箱；用光密度测
定法测定农杆菌浓度。
Vir区基因活化诱导物的使用
• Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化 合物对vir区基因的活化具有重要作用，常用的诱 导物是乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮；
• 菌液浓度对不同植物的外植体有一定差异 ，一般浓度范围OD600＝0.05-0.7之间；
• 浸泡后的外植体在滤纸上吸干要适度。
农杆菌与外植体的共培养
• 最佳共培养时间：农杆菌附着后不能立即转化， 只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤 ，因此，共培养时间必须长于16h，时间过长，由 于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死 亡。