太湖反硝化_硝化_亚硝化及氨化细菌分布及其作用_王国祥
硝化细菌与反硝化细菌及其在水产养殖业的应用
硝化细菌与反硝化细菌及其在水产养殖业的应用硝化细菌与反硝化细菌及其在水产养殖业的应用王玉堂全国水产技术推广总站近年来，硝化细菌在水产养殖业上应用越来越引起人美注意，从而引发了较为广泛的研究。
可以说，迄今为止，在大规模集约化养殖生产中，大都使用硝化细菌来净化水质。
因为在集约化的水产养殖系统中，经过长期的大量积累，水生生物排泄物等有机污染物甚至动物的尸体较多，在异养性细菌的分解作用下，其中的蛋白质及核酸会慢慢分解，产生大量的氨氮等对水产养殖动物有毒有害物质。
氨在亚硝化细菌或光合细菌作用下转化为亚硝酸盐，亚硝酸与一些金属离子结合形成亚硝酸盐；而亚硝酸盐有可和胺等物质结合，形成具有强烈致癌作用的亚硝酸胺。
因此，亚硝酸盐常与氨氮相提并论。
由于亚硝酸盐长期蓄积，致使养殖水生动物中毒，导致鱼、虾等抗病能力下降而受到各种病原体的侵袭。
但亚硝酸盐在硝化细菌的作用下，可转化为硝酸厚，很容易形成硝酸盐，从而成为可以被植物吸收利用的营养物质。
For personal use only in study and research; not for commercial use目前市售的一些据称有硝化作用的异养菌或真菌，虽然也能将氨氮氧化成硝酸盐，但通常只能利用无机碳源，其对氨的氧化作用也有十分微弱，反应速率远比自养性硝化细菌慢，不能被视为真正的硝化细菌。
硝化作用必须有全自养性硝化细菌来完成。
For personal use only in study and research; not for commercial use养殖池塘中的氨氮原本很适合于硝化细菌的生长，但因养殖池中存在大量的异养菌，受异养菌的排斥作用影响，适合硝化细菌栖息的地方相对于自然环境而言显然少得多，因此，没有足够数量的硝化细菌来消费过来的亚硝酸盐，就是问题所在。
一、硝化细菌及其生物学1、硝化细菌硝化细菌是指利用氨或亚硝酸盐作为主要生存能源，以及利用二氧化碳作为主要碳源的一类细菌。
常温条件下厌氧氨氧化生物滤池影响因素
常温条件下厌氧氨氧化生物滤池影响因素李冬;王俊安;陶晓晓;李占;张杰【摘要】为了推动厌氧氨氧化(ANAMMOX)在城市污水处理中的工程化应用,在常温条件下,采用生物滤池反应器,分别考察了硝酸盐、磷酸盐、氨盐和亚硝酸盐对ANAMMOX运行效能的影响.试验结果表明:当进水NO3--N质量浓度提高至约500mg/L时,不会对总氮去除负荷产生明显的影响;而当进水总磷质量浓度大于10mg/L时,总氮去除负荷下降明显,停止投加磷酸盐后,总氮去除负荷可以得到恢复;适当提高NU4+-N和NO2--N的浓度,有利于总氮去除负荷的提高.可见常温条件下,硝酸盐对于低氨氮城市污水ANAMMOX生物滤池的脱氮活性基本不存在影响.而正磷酸盐浓度负荷对于ANAMMOX反应具有一定的影响,且进水磷酸盐浓度的提高对常温低氨氮城市污水ANAMMOX反应存在可逆性抑制作用.【期刊名称】《哈尔滨工业大学学报》【年(卷),期】2010(042)006【总页数】4页(P869-872)【关键词】厌氧氨氧化;生物滤池;城市污水;生物脱氮;常温【作者】李冬;王俊安;陶晓晓;李占;张杰【作者单位】哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,哈尔滨,150090;北京工业大学,水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京,100124;北京工业大学,水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京,100124;北京工业大学,水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京,100124;北京工业大学,水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京,100124;哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,哈尔滨,150090【正文语种】中文【中图分类】X703.1厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，ANAMMOX)一经发现，便引起了国内外研究者的极大兴趣［1－5］.目前，ANAMMOX 工艺在国际上已经有不少成功的案例，其处理对象主要为污泥消化上清液和垃圾渗滤液等高温高氨氮废水［6－9］.本文以城市污水为研究对象，在常温条件下，实现了ANAMMOX生物滤池反应器的启动.为了进一步探究其长期运行的稳定性以及工程化应用的可行性，分别考察了硝酸盐、磷酸盐、铵盐和亚硝酸盐对ANAMMOX生物滤池反应器运行效能的影响.试验装置采用有机玻璃柱制成的生物滤池反应器模型，内径70 mm，高度2.0 m，柱内装填粒径为5.0～8.0 mm的页岩陶粒，装填高度为1.50 m，底部设300mm高的河卵石承托层，滤柱壁上每200 mm设一个取样口，水流采用上向流.反应装置如图1所示.试验原水以某大学教工家属西区生活污水经厌氧/好氧(A/O)生物除磷工艺处理后的二级出水为原污水，人工投加适量NaNO2以保证ANAMMOX反应的基质要求.原污水水质:CODCr=50～60 mg/L;ρNH4+－N=60 ～80 mg/L;ρNO2－－N＜1 mg/L;ρNO3－N＜1 mg/L;总磷为0.18～0.74 mg/L;水温为8～25℃;pH=7.50～8.00.水样分析项目中，NH+4－N采用纳氏试剂光度法;NO－2－N采用N－(1－萘基)－乙二胺光度法;NO－3－N采用麝香草酚分光光度法;DO和温度采用WTWinoLab StirrOx G多功能溶解氧在线测定仪;pH采用 OAKLON Waterproof pHTestr 10BNC型pH测定仪;CODCr按中国国家环保局和美国环境总署发布的标准方法测定.试验过程中，每次改变进水的基质浓度时，运行1 d后再取样化验.另外，由于试验用水中的有机氮含量较低，故以“三氮”浓度之和来表示总氮的浓度.以TN去除负荷来表征ANAMMOX生物滤池的运行效能.ANAMMOX的电子受体为亚硝酸盐，而不是硝酸盐，但其产物有少量的硝酸盐生成，而且如果ANAMMOX反应的预处理单元——部分亚硝化单元的曝气过量，进入ANAMMOX反应单元的硝酸盐量将会增加，这说明探究硝酸盐浓度对ANAMMOX反应是否存在影响是必要的.通过人工投加硝酸盐逐渐提高ANAMMOX反应器进水的硝氮浓度，系统在不同硝氮浓度条件下对总氮去除负荷的变化如图2所示.由图2可知，在进水NO－3－N的质量浓度从16.85 mg/L逐渐提高到500.31 mg/L的过程中，出水NO－3－N的浓度也同步提高，且均略大于进水NO－3－N的浓度值，这是由于生物滤柱反应器内ANAMMOX反应生成了少量的硝酸盐.另外，进水NO－3－N浓度的逐渐提高不但对ANAMMOX反应没有表现出抑制作用，反而对TN的去除负荷有提高的趋势，尤其是当进水NO－3－N的质量浓度达到本试验的最高值500.31 mg/L时，系统对总氮的去除负荷达到了3.43kg/(m3·d)，分析其原因，主要在于系统中除了ANAMMOX自养脱氮反应，还应该存在硝酸盐反硝化异养脱氮反应，由于A/O出水中仍含有一定浓度的COD，在较高浓度NO－3－N存在的条件下，反硝化异养菌得到了快速增殖，从而使系统对TN的去除量进一步提高.上述试验结果表明，硝酸盐对ANAMMOX反应本身没有抑制作用，其对TN去除负荷的影响主要在于有机物的存在，有机物的存在，使反硝化异养菌得到了繁殖，反硝化异养菌在反硝化脱氮的同时，进一步降低了系统中的COD含量，这在一定程度上对ANAMMOX反应是有利的.城市污水中含有一定浓度的磷酸盐，当ANAMMOX前端处理单元对磷没有去除或去除不够彻底时，会有部分磷酸盐进入ANAMMOX处理单元，而不同浓度的总磷对ANAMMOX反应是否会造成影响，尚值得探讨.本试验在常温条件下，通过向原污水中投加Na3PO4·12H2O(购自北京化学试剂厂)，逐渐提高进水总磷的浓度，研究了低氨氮城市污水中不同浓度总磷对ANAMMOX生物滤柱脱氮效能的影响.在试验不同阶段，进水总磷浓度、出水总磷浓度和ANAMMOX生物滤柱的总氮去除负荷变化曲线如图3所示.从图3可以看出，随着进水中总磷浓度的不断增加，ANAMMOX生物滤柱对总氮的去除负荷在试验初期变化不大.当投加总磷≤10 mg/L时，ANAMMOX生物滤柱对总氮的去除负荷变化并不大，基本保持在4 kg/(m3·d)左右，该阶段出水总磷浓度反而大于进水总磷浓度，这是由于原水中含有少量的磷酸盐，且ANAMMOX 生物滤柱对其基本上没有去除效果.当投加总磷＞10 mg/L时，随着磷酸盐投加浓度的不断增加，ANAMMOX生物滤柱对总氮的去除负荷呈明显下降趋势.当投加总磷=130 mg/L时，ANAMMOX生物滤柱对总氮的去除负荷下降到0.67kg/(m3·d)，仅为原来总氮去除负荷的16.8%，该阶段的进水总磷浓度大于出水总磷浓度，水中总磷的损失，说明ANAMMOX生物滤柱对总磷有一定的去除作用.由于ANAMMOX生物滤柱对总氮的去除负荷呈明显下降趋势与出水总磷浓度突然减少的现象几乎是在同时出现的，故认为二者之间应该存在一定的联系.经分析发现，伴随着ANAMMOX生物滤柱脱氮能力下降，反应器内有鸟粪石晶体等沉积物的形成.这些沉积物填充了ANAMMOX生物滤料的部分孔隙，从而阻滞了ANAMMOX反应基质的正常传递，其物理阻滞作用直接造成反应器脱氮负荷的明显下降［10］.当终止磷酸盐的投加后，对ANAMMOX生物滤柱出水水质进行化验分析，经计算，脱氮负荷在第24 h时恢复到了2.06 kg/(m3·d)，为原来的51.5%.之后，通过稀盐酸来调节pH，短期降低进水pH至6.00～6.70和自来水反冲洗约10 min 的联合作用，再运行24 h后取样分析，数据表明，ANAMMOX生物滤柱脱氮负荷已经恢复到了3.55 kg/(m3·d)，为原来系统正常运行脱氮负荷的88.8%.为了探究常温低氨氮城市污水条件下驯化扩增后的ANAMMOX菌对基质负荷的耐受性，在较低温度(10～15℃)条件下，通过人工投加铵盐和亚硝酸盐，对ANAMMOX反应系统进行了进一步研究，图4是在进水亚氮浓度不变的前提下，不同进水氨氮浓度对系统总氮去除负荷的影响结果.由图4可知，随着氨氮浓度的提高，系统总氮的去除率总体呈下降趋势，而总氮去除负荷在一开始呈逐渐增长趋势，当氨氮浓度提高至200.52 mg/L时，系统对总氮的去除负荷达到最大值0.36 kg/(m3·d)，而后，继续提高氨氮浓度后，系统对总氮的去除负荷又下降并维持在0.25 kg/(m3·d)附近的水平.可见，提高氨氮基质的浓度有利于提高ANAMMOX反应的活性，较高浓度(本试验为499.18 mg/L，约为500 mg/L)的氨氮对常温低氨氮城市污水条件下长期培养的ANAMMOX菌并无明显的抑制作用.为了考察亚氮对常温低氨氮城市污水条件下长期培养的ANAMMOX菌活性的影响，按照氨氮与亚氮质量比=1∶1.3的比例［11］，同步提高氨氮和亚氮的浓度，进行了对系统总氮去除负荷影响的研究.图5为不同氨氮和亚氮浓度之和的条件下系统对总氮去除负荷的影响效果.由图5可知，随着氨氮和亚氮浓度的同比增加，系统对总氮的去除率在一直下降.同时，系统的总氮去除负荷先从0.23 kg/(m3·d)提高至0.49 kg/(m3·d)，这时进水氨氮和亚氮的质量浓度值分别为100.86 mg/L和137.85 mg/L.之后，总氮去除负荷经过逐渐下降之后，又开始上升，并达到最高值0.49 kg/(m3·d)，此时进水氨氮和亚氮的质量浓度分别为241.12 mg/L和343.19 mg/L，而后，随着进水氨氮和亚氮浓度继续同步提高，总氮去除负荷逐渐下降，而当进水氨氮和亚氮的质量浓度分别为400.00 mg/L和530.80 mg/L时，总氮去除负荷仍可达到0.27kg/(m3·d)，但是，当进水氨氮和亚氮的质量浓度超过该值后，系统对总氮的去除基本没有效果.将图4和图5中总氮去除负荷的变化进行对比(见图6)，发现亚氮浓度的提高与氨氮一样也可以提高ANAMMOX反应的活性，且当亚氮质量浓度超过约250 mg/L 之后，对ANAMMOX表现出一定的抑制作用，但ANAMMOX菌对其有很好的适应性.当亚氮质量浓度达到约350 mg/L时，总氮去除负荷的提高较为明显，当不超过530 mg/L时，对总氮的去除仍有很好的效果.在试验过程中，当降低基质浓度后，受抑制的ANAMMOX菌的活性可以快速得到恢复，这说明了常温、低氨氮城市污水条件下培养的ANAMMOX菌对基质负荷的变化具有较好的稳定性和高浓度耐受性，这对其在高氨氮和亚氮废水中的应用有着重要意义.1)常温条件下，硝酸盐对于低氨氮城市污水ANAMMOX生物滤池的脱氮活性基本不存在影响.而正磷酸盐浓度负荷对于ANAMMOX反应具有一定的影响，且进水磷酸盐浓度的提高对常温低氨氮城市污水ANAMMOX反应存在可逆性抑制作用.2)基质浓度对于ANAMMOX反应存在一定的影响.在一定浓度范围内，氨氮和亚氮浓度的提高，有利于提高ANAMMOX生物滤池对总氮的去除负荷，而无法保证对总氮的去除率.3)较高质量浓度(约500 mg/L)的氨氮对常温、低氨氮城市污水条件下长期培养的ANAMMOX菌并无明显的抑制作用.而当亚氮质量浓度大于530 mg/L时，ANAMMOX菌的活性将受到明显地抑制作用，当降低基质浓度后，ANAMMOX 活性可以快速得到恢复.张杰(1938—)，男，教授，中国工程院院士.【相关文献】［1］MULDER A，VAN DE GRAAF A A，ROBERTSON L A，et al.Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor［J］.FEMS Microbiology Ecology， 1995，16(3):177 －183.［2］VAN DE GRAAF A A，MULDER A，DE BRUIJN P，et al.Anaerobic oxidation of ammonium is a biologically mediated process［J］.Appl Environ Microbiol， 1995，61(4):1246－1251.［3］JETTEN M S M，STROUS M，VAN DE PAS－SCHOONEN K T，et al.The anaerobic oxidation of ammonium［J］.FEMS Microbiology Reviews， 1999，22:421 －437.［4］JETTEN M S M，WAGNER M，FUERST 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MPN法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌
MPN多管发酵法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌1实验原理最大可能数(或最大或然数法，most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数（具体参见《土壤与环境微生物研究法》，科学出版社，2009），适用于测定在一个混杂的微生物群落中但却具有特殊生理功能的微生物类群。
本方法是基于选择适当稀释倍数的悬液，接种在特定的液体培养基中培养，检查培养基中是否有该生理类群微生物的生长。
根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出该生理类群的微生物数量。
特点：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
MPN法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
氨化作用是异养细菌将蛋白质水解为氨基酸，进而脱氨基产生氨的过程。
硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化成亚硝酸和硝酸的过程。
第一阶段由亚硝酸菌氧化氨为亚硝酸；第二阶段由硝酸菌氧化亚硝酸为硝酸。
这两类细菌都是自养的好氧细菌，生长缓慢，培养时间长。
反硝化作用是一类异养细菌在无氧条件下，利用有机物为电子供体，以硝酸盐为呼吸作用的电子受体，将其还原为N2O、N2的过程。
2实验材料2.1样品（1）固体样品（土样或沉积物等）：取一定质量的样品（1g或10g），装入盛有100ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡30min，制成均匀悬浊液。
然后用10倍梯度稀释法将悬浊液稀释成一系列梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等，具体视样品而定，微生物丰富的样品稀释的梯度相应大一些）。
（2）液体样品：取一定体积的样品（10ml），装入盛有90ml无菌水的三角瓶中，充分混匀，制成10-1稀释样。
太湖沉积物反硝化功能基因丰度及其与N2O通量的关系
生态环境学报 2019, 28(1): 136-142 Ecology and Environmental Sciences E-mail: editor@基金项目：国家自然科学基金项目（41371457；41771516；41771286）；中国科学院重点部署项目（KZZD-EW-10-02-1）；国家水体污染控制与治理科技重大专项（2013ZX07113001）作者简介：刘德鸿（1979年生），男，博士研究生，主要研究方向为土壤、沉积物生态环境。
E-mail: L66dehong@*通信作者，E-mail: jczhong@收稿日期：2018-08-21太湖沉积物反硝化功能基因丰度及其与N 2O 通量的关系刘德鸿1, 2, 3，文帅龙2，龚琬晴2，钟继承2*，钟文辉11. 南京师范大学地理科学学院，江苏 南京 210023；2. 湖泊与环境国家重点实验室/中国科学院南京地理与湖泊研究所，江苏 南京 210008；3. 洛阳市共生微生物与绿色发展重点实验室/河南科技大学农学院，河南 洛阳 471023摘要：温室气体N 2O 的生成和排放与反硝化功能微生物关系密切，探讨沉积物反硝化微生物功能基因丰度及其与N 2O 通量的关系有助于更好地理解沉积物N 2O 生成与排放的微生物学机制。
以太湖为研究对象，采用定量qPCR （Quantitative PCR ）技术测定了太湖沉积物反硝化功能基因（nirK 、nirS 、norB 和nosZ ）丰度，阐明了太湖沉积物反消化功能基因丰度的季节变化规律，并分析了反硝化功能基因丰度与沉积物N 2O 通量及其他环境因子的关系。
结果表明：太湖沉积物反硝化功能基因丰度呈现夏秋季高冬春季低，具有明显的季节变化特征，norB 基因丰度最高，均值为9.03×109 copies·g −1，其次为nirS 基因（1.14×109 copies·g −1），nirK 和nosZ 基因丰度均值分别为3.04×108 copies·g −1和1.09×108 copies·g −1。
硝化反应和反硝化反应
一、硝化反应在好氧条件下，通过亚硝酸盐菌和硝酸盐菌的作用，将氨氮氧化成亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程，称为生物硝化作用。
硝化反应包括亚硝化和硝化两个步骤:NH4++1.5O2 NO2-+H2O+2H+NO2-+0.5O2NO3-硝化反应总方程式：NH3+1.86O2+1.98HCO3- 0.02C5H7NO2+1.04H2O+0.98NO3--+1.88H2CO3若不考虑硝化过程硝化菌的增殖，其反应式可简化为NH4++2O2 NO3-+H2O+2H+从以上反应可知:1)1gNH4+-N氧化为NO3- 需要消耗2*50/14=7.14g碱（以CaCO3计)2)将1gNH4+-N氧化为NO2--N需要3.43gO2,氧化1gNO2--N需要1.14gO2，所以氧化1gNH4+-N需要4.57gO2。
硝化细菌所需的环境条件主要包括以下几方面：a.DO：DO应保持在2-3mg/L。
当溶解氧的浓度低于0.5mg/L时，硝化反应过程将受到限制。
b.PH和碱度：PH7.0-8.0，其中亚硝化菌6.0-7.5，硝化菌7.0-8.5。
最适合PH为8.0-8.4。
碱度维持在70mg/L以上。
碱度不够时，应补充碱c.温度：亚硝酸菌最佳生长温度为35℃，硝酸菌的最佳生长温度为35～42℃。
15℃以下时，硝化反应速度急剧下降；5℃时完全停止。
d.污泥龄：硝化菌的增殖速度很小，其最大比生长速率为 0.3～0.5d-1(温度20℃，pH8.0～8.4)。
为了维持池内一定量的硝化菌群，污泥停留时间必须大于硝化菌的最小世代时间。
对于实际应用中，活性污泥法脱氮，污泥龄一般11～23d。
e.污泥负荷：负荷不应过高，负荷宜0.05-0.15kgBOD/(kgMLSS·d)。
因为硝化菌是自养菌，有机物浓度高，将使异养菌成为优势菌种。
总氮负荷应≤0.35kgTN/(m3硝化段·d)，当负荷>0.43kg/(m3硝化段·d)时，硝化效率急剧下降。
污水处理中的硝化与反硝化过程
污水处理厂的硝化与反硝化应用
污水处理厂是硝化与反硝化过程的重要应用场所，通过硝化反应将有机 氮转化为硝酸盐，再通过反硝化反应将硝酸盐转化为氮气，从而达到去 除氮污染物的目的。
硝化反应通常在好氧条件下进行，由硝化细菌将氨氮氧化成硝酸盐；反 硝化反应则在缺氧条件下进行，由反硝化细菌将硝酸盐还原成氮气。
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硝化反应的微生物学基础
硝化细菌是一类好氧性细菌，能够将氨氮氧化成硝酸盐。
硝化细菌主要包括亚硝化Байду номын сангаас菌和硝化细菌两类，分别负责亚硝化和硝化两个阶段 。
硝化反应的影响因素
溶解氧
硝化反应是好氧反应，充足的溶解氧是保证硝化 反应顺利进行的关键。
pH值
硝化细菌适宜的pH值范围为7.5-8.5。
ABCD
温度
硝化细菌对温度较为敏感，适宜的温度范围为 20-30℃。
应对气候变化
资源回收利用
探索污水处理过程中资源的回收利用，如能源、肥 料等，提高污水处理的经济效益和社会效益。
随着气候变化加剧，污水处理系统需应对极 端天气和自然灾害的挑战，保障硝化与反硝 化过程的稳定运行。
国际合作与交流
加强国际合作与交流，引进先进技术与管理 经验，推动硝化与反硝化技术的创新发展。
害。
城市污水处理中的硝化与反硝化应用
城市污水中的氮污染物主要来源于生活污水和部分工业废水，硝化与反硝化过程在 城市污水处理中具有重要作用。
城市污水处理厂通常采用生物反应器进行硝化与反硝化反应，通过合理控制反应条 件，提高脱氮效率。
城市污水处理中的硝化与反硝化应用可以有效降低水体中氮污染物含量，改善城市 水环境质量。
污水深度处理的硝化与反硝化
污水深度处理的硝化与反硝化之巴公井开创作一。
硝化(1) 微生物：自营养型亚硝酸菌(Nitrosmohas)自营养型硝酸菌（Nitrobacter）(2) 反应：城市污水中的氮化物主要是NH3,硝化菌的作用是将NH3—N氧化为NO3—NNH+4+1.5O2———NO2+H2O+H+－ΔE亚硝酸菌ΔE=278.42kJNO2+0.5O2———NO-3－ΔE硝酸菌ΔE=278.42kJNH+4+2.0O2——— NO-3+H2+2H+－ΔE硝酸菌ΔE=351kJ研究标明,硝化反应速率主要取决于氨氮转化为亚硝酸盐的反应速率。
硝酸菌的细胞组织暗示为C5H7NO255NH+4+76O2+109HCO-3———C5H7NO2+54NO-2+57H2O+104H2Co3亚硝酸菌400 NO2+ NH+4+4 H2Co3+ HCO-3+195 O2 ——— C5H7NO2+3H2O+400 NO-3硝酸菌NH+4+1.86 O2+1.98HCO-3——— 0.02C5H7NO2+1.04H2O+0.98 NO-3+1.88H2Co3硝酸菌(3) 包管硝化反应正常进行的需要条件：pH 8~9水温亚硝酸菌反应最佳温度 t=35 0C t>15 0CDO 2 ~ 3 mg /L > 1.0 mg / L硝化1克NH3—N：消耗4。
57克O2消耗7。
14克碱度（擦CaCo3计）生成0。
17克硝酸菌细胞(4) 亚硝酸菌的增殖速度t=25OC活性污泥中µ(Nitrosmohas)=0.18e0.116(T-15) day –1µ(Nitrosmohas)=0.322 day–1 （20ＯＣ）纯种培养：µ(Nitrosmohas)=0.41e0.018(T-15) day -1河水中µ(Nitrosmohas)=0.79e0.069(T-15) day -1一般它营养型细菌的比增长速度µ =1。
典型生境中氨氧化古菌和厌氧氨氧化细菌的分布和丰度
典型生境中氨氧化古菌和厌氧氨氧化细菌的分布和丰度徐相龙;陈祥春;刘国华;范强;王皓;任争光;齐鲁;王洪臣【摘要】运用分子生物学方法研究了某富营养化湖泊污泥(以下简称湖泊污泥)、某长期施肥的稻田土壤(以下简称稻田土壤)和某污水处理厂硝化污泥(以下简称硝化污泥)中氨氧化古菌(AOA)和厌氧氨氧化(ANAMMOX)细菌的分布及丰度.结果表明,湖泊污泥、稻田土壤和硝化污泥中AOA的amoA基因Shannon指数分别为1.64、2.14、0.57,稻田土壤的生物多样性最丰富;但以上3种生境中AOA的amoA基因丰度分别为(1.45±0.13)×107、(7.24士0.25)×105、(3.46±0.22)×10 5拷贝数/g(以干质量计,下同),湖泊污泥中最大.湖泊污泥和稻田土壤中的AOA与水/沉积物中的古菌亲缘关系相近,既有来自水/沉积物分支,又有来自土壤/沉积物分支;硝化污泥中的AOA与土壤/沉积物中的古菌亲缘关系相近,全部来自土壤/沉积物分支.湖泊污泥、稻田土壤和硝化污泥中ANAMMOX细菌的16S rRNA基因Shannon指数都较小,生物多样性不丰富,但hzsB基因的丰度分别达到(1.32土0.17)×108、(2.88±0.28)×108、(7.76±0.25)×108拷贝数/g.湖泊污泥、稻田土壤中ANAMMOX细菌的优势种属于Brocadia属;硝化污泥中ANAMMOX细菌的Brocadia和Kuenenia几乎各占一半.【期刊名称】《环境污染与防治》【年(卷),期】2016(038)012【总页数】6页(P59-64)【关键词】氨氧化古菌;厌氧氨氧化细菌;生物多样性;基因丰度【作者】徐相龙;陈祥春;刘国华;范强;王皓;任争光;齐鲁;王洪臣【作者单位】中国人民大学环境学院,北京100872;济南热力有限公司,山东济南250100;中国人民大学环境学院,北京100872;中国人民大学环境学院,北京100872;中国人民大学环境学院,北京100872;中国人民大学环境学院,北京100872;中国人民大学环境学院,北京100872;中国人民大学环境学院,北京100872【正文语种】中文氨氧化作用作为硝化反应的第1步，是硝化过程的限速步骤，其反应机制是利用好氧微生物将转化为一直以来，研究者们普遍认为这一反应中起主要作用的是好氧氨氧化细菌(AOB)。
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应用与环境生物学报 1998,5(2):190～194 C hin.J.Appl.Envir on.Biol. 1998-04-25太湖反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌分布及其作用＊王国祥 濮培民 黄宜凯 张圣照(中国科学院南京地理与湖泊研究所 南京 210008)摘 要 用最大可能数(M P N:Most-Probable-Number)法,测定了太湖五里湖敞水区及各种生态类型水生高等植物群落内的反硝化、硝化、亚硝化和氨化细菌的分布,并分析探讨了它们的作用.结果表明,反硝化细菌的最大可能数[n(MPN)],在水生高等植物群落内水体中较敞水区湖水高2～5个数量级,差异极显著(P<0.01),漂浮植物群落内水体的反硝化细菌n(MPN)较沉水和浮叶植物群落内水体高2～3个数量级,差异极显著(P<0.01);硝化细菌n(MPN),敞水区湖水高于凤眼莲、水花生群落内水体,差异显著(P<0.05),菱群落与其他群落比较,亦有极显著性差异(P<0.01);亚硝化细菌n(MPN),在水生高等植物群落内的水体中较敞水区高3～4个数量级,差异极显著(P<0.01);氨化细菌n(MPN),在水生高等植物群落内的水体中高于敞水区水体.除硝化细菌外,反硝化、亚硝化及氨化细菌均在根际处最为密集,且由根际向外呈现递减趋势.各种水生高等植物群落内氮循环细菌分布及微环境的差异,促进了有机氮的分解、铵态氮的硝化和挥发、硝酸盐氮的反硝化作用.室内培养试验结果表明,水生高等植物生长区水样的氨化产气量为敞水区的2倍左右,凤眼莲、水花生覆盖下的水样反硝化产气量分别为敞水区的6.2和4.8倍,表明有水生高等植物生长的水体,氮素容易释放进入大气.关键词 反硝化细菌;硝化细菌;亚硝化细菌;氨化细菌;太湖中图法分类号 Q939.108∶Q178.513DISTRIBUTION AND ROLE OF DENITRIFYING,NITRIFYING,NITROSATION AND AMMONIFYINGBACTERIA IN THE TAIHU LAKEW ANG Guoxiang,PU Peimin,HUANG Yikai&ZHANG Shengzhao(Nanjing Ins titute of Geography&Limnology,the C hine se Academy of Sci enc es,Nanjing 210008)A bstract The distribution and role of four nitrogen cycle bacteria,includ ing ammonifying bacteria,denitri-fying bacteria,nitrobacteria and nitrosobacteria,were determined with MPN method in the Taihu Lake.Themost probable number[n(MPN)]of denitrifying bacteria in the water covered by Alternanthera philoxeroidesand Eichho rnia crass ipes are about2～3and2～5order-of-magnitudes higher than those in the water vegetatedwith other macrophytes and in the unvegetated water,respectively.There is a significant difference bet weenthem(P<0.01).The n(MPN)of ammonifyin g bacteria in vegetated water are markedl y higher than those inthe unvegetated water.The n(MPN)of nitrosobacteria in the vegetated water are notably higher than those inthe unvegetated water(P<0.01).The n(MPN)of nitrobacteria and nitrosobacteria in the water vegetatedwith sub merged plants are higher than those in the water covered by floating plants.The n(MPN)of ammonify-ing and denitrifying bacteria,nitrosobacteria are very dense in rhizosphere and present a decreas ing tendencyfrom root surface to outside.The results demonstrate that the differences in distribution of the four nitrogen bac-收稿日期:1998-02-27 接受日期:1998-04-28＊中国国家科委和欧洲联盟科技部支持项目 Phys ic-biological engineering for removing al gae and purifying water quality in Lake Tai-hu,China,合同号CI1＊-CT93-0094(DG12HSMU)teria among the different aquatic macrophytes play a significant role in nitrogen removal .The results of cultureexperiment show that the volume of the gas produced by ammonification in the vagetated water is about 2timesas much as that in the un vegetated open water .The volumes of the gas produced by deitrification in the watercovered by water peanut and hyacinth are 6.2and 4.8times as much as those in the unvegetated water .It indi -cates that nitrogen is liable to emit to atmosphere from the vegetated water .Keywords denitrifying bacteria ;nitrobacteria ;nitrosobacteria ;ammonifying bacteria ;Taihu Lake氮循环过程包括生物固氮、氨化、硝化、反硝化及同化等作用,其中生物固氮、氨化、硝化及反硝化是微生物的特有过程[1～3].对稻田氮循环研究表明:由硝化-反硝化细菌所引起的硝化-反硝化作用是土壤、湿地中氮素损失的重要机制之一[4～6],氮肥施入稻田后其氮素损失可达30%～75%,而且大部分氮素以分子态形式进入大气.在湿地研究中,国外提出了根区法,认为根际微生物在湿地植物根际的氧化-还原微环境中,进行着硝化-反硝化作用,促进了湿地氮素释放[7,8].对湖泊生态系统中氮循环细菌分布,国外有一些报道[1～4,9],国内尚未见报道.本项研究结果表明,水生高等植物覆盖区内的氨化和反硝化细菌密度明显高于无植物覆盖的敞水区;附着于水生高等植物根际的氨化细菌将水中的有机氮转化为无机氮(其中大部分转化为气态的氨气直接进入大气);同时,反硝化细菌将无机氮盐(NO -3-N 及NO -2-N )还原为气态的N 2O 及N 2,并释放到大气中,从而削减了水体中的氮负荷,这对于富营养化湖泊的净化具有特别重要的积极意义.1 实验部分1.1 样品采集及样品处理在太湖无锡中桥湖湾的湖面敞水区和各种水生高等植物生长区,按标准方法[10]直接采集细菌水样;并同时在凤眼莲根系外10cm 、30cm 处用无菌针筒采集细菌水样,取样深度为水面下20cm .采集凤眼莲根样,经实验室无菌处理[11],分别获得根际菌和根面菌的菌悬液,与水样同法测氮循环细菌数量.1.2 氮循环细菌的n (MPN )测定用最大可能数(MPN :Most -Probable -Number )法测定水样中硝化、亚硝化、氨化及反硝化细菌的数量n(MPN )[11～13].分别配制硝化、亚硝化、氨化及反硝化细菌培养基[12,13],调节pH 值,分装于l 150mm ×d i 14mm 的试管中,并将l 30mm ×d i 5mm 的小指管分别倒置于装有氨化和反硝化细菌培养基的每支试管内,加塞,在121℃下灭菌20min .每个水样作3～4个10倍系列稀释,每支试管中接种水样和稀释水样各1mL ,每一稀释度做5个平行.在(28±1)℃条件下,氨化细菌、反硝化细菌培养15d ,硝化和亚硝化细菌培养30d .以红石蕊试纸、纳氏试剂、格里斯(Griess )试剂、二苯胺试剂、醋酸-硫酸亚铁试剂等检测各种形态氮的产生和消失情况,定期观测发酵管内发酵、产气情况[12,13].查MPN 表[10],用下式计算样品中的细菌数量n (MPN )/L -1.n (MPN )=MPN 指数×[10(mL )÷接种量最大的一管样品量(mL )]根样及根表附着物样,亦用上式计算样品鲜重(m FW )的n (MPN ),单位:kg -1.在比较水样、根样及根表附着物(根际)样n (MPN )时,视1L 水为1kg .1.3 氨化和反硝化强度的测定在用MPN 法定量测定水体氮循环细菌数量的同时,用l 200m m ×d i 30mm 的大试管(内倒置5.0mL 的离心管),分别盛50mL 氨化、反硝化细菌培养基,各设5个平行,分别测氨化、反硝化强度.培养基分装后,同MPN 法灭菌,每管接种原水样5mL ,同样条件培养15d ,记录离心管内截留的气体量.2 实验结果2.1 敞水区和水生高等植物群落内氮循环细菌数量分布的比较由图1、表1可见,反硝化细菌n (MPN ),在水生高等植物群落内水体中明显高于无水生高等植物覆盖的1912期王国祥等:太湖反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌分布及其作用 敞水区湖水,平均高2～5个数量级.Q 检验结果表明,各种水生高等植物群落内反硝化细菌最大可能数与敞水区比较均有极显著性差异(P <0.01).由图2、表1可见,硝化细菌n (MPN ),在敞水区略高于凤眼莲、水花生及荇菜群落内,但除凤眼莲、水花生群落内与敞水区的湖水硝化细菌n (MPN )有显著性差异(P <0.05)外,其余均无显著性差异(P >0.05).表1 各种水生高等植物群落内外氮循环细菌最大可能数[n (MPN )]的几何均值Table 1 The geometric means of n (MPN )of nitrogen cycle bacteria ins ide and outside macrophyte communities菱(T )＊＊凤眼莲(E )＊＊水花生(A )＊＊荇菜(Ny )＊伊乐藻＊(El )＊＊轮叶黑藻＊(Hy )＊＊敞水区(o w )＊＊反硝化菌(db )3.99×1048.44×1062.18×1074.94×1052.50×1052.50×1042.61×102硝化菌(nb )2.92×1041.48×1021.61×1028.07×1029.00×1031.70×1043.08×103亚硝化菌(nob )4.25×1067.57×1052.11×1054.60×1059.00×1064.60×1061.68×102氨化菌(ab )2.62×1051.30×1051.40×1059.94×1041.40×1031.40×1034.28×103＊仅1次测定值,不参与方差分析 Only one n (MPN )determination ,not used in analysis of variance .＊＊T :Tr apa sp ,E :Eic hhor nia crass ipes ,A :Alter nanthe ra philox eroides ,Ny :N ymphoides pelt ata ,El :Elodea nuttallii ,Hy :Hydrilla ve rticillata ,ow :open water ;db :denitrifying bacteria ,nb :nitrifying bacteria ,nob :nitros ation bacteria ,ab :am -monif ying bacteria (下同The sa me belo w )图1 不同水生高等植物群落内反硝化细菌分布Fig .1 Distribution of denitrifying bacteria in different macrophytes 图2 同水生高等植物群落内硝化细菌分布Fig .2 Distribution of nitrobacteria in different macrophytes 由图3、表1可见,亚硝化细菌n (MPN ),在水生高等植物群落内水体中比敞水区湖水高3～4个数量级.各种水生高等植物群落内亚硝化细菌n (MPN )与敞水区比较均有极显著性差异(P <0.01).由图4、表1可见,菱、凤眼莲、水花生及荇菜群落内氨化细菌n (MPN )略高于敞水区,但差异性并不显著(P >0.05).图3 不同水生高等植物群落内亚硝化细菌分布Fig .3 Distribution of nitrosobacteria in different macrophytes 图4 不同水生高等植物群落内氨化细菌分布Fig .4 Distribution of ammonifying bacteria in different macrophytes2.2 不同生态类型水生高等植物群落内水体氮循环细菌分布的比较由图1、表1可见,漂浮植物凤眼莲和水花生群落内水体反硝化细菌n (MPN )高于沉水植物菱、伊乐藻、轮叶黑藻,2～3个数量级.Q 检验结果表明,凤眼莲与水花生、菱与荇菜的反硝化细菌n (MPN )均无显著性差异(P >0.05);而凤眼莲与菱及荇菜、水花生与菱及荇菜的反硝化细菌n (MPN )均有极显著性差异(P <0.01).由图2、表1可见,在菱沉水植物(轮叶黑藻和伊乐藻)群落中,水体硝化细菌n (MPN )较高,Q 检验结果表明,菱与凤眼莲、水花生及荇菜群落内的水体硝化细菌n (MPN )比较均有显著性差异(P <0.01),而其余群落之间无显著差异(P >0.05).由图3、表1可见,亚硝化细菌n (MPN ),除在菱与水花生群落内的水体之间有显著性差异(P <0.05)外,192 应用与环境生物学报 5卷在其余群落内的水体之间均无显著性差异(P >0.05).Q 检验结果还表明,各群落内的水体之间,氨化细菌n (MPN )均无显著性差异(P >0.05).2.3 水生高等植物根际氮循环细菌的梯度分布 由图5可见,凤眼莲根系絮状附着物(根际)的氨化、反硝化及亚硝化细菌n (MPN )均高于根表面及远离群落根际的区域,尤其是根际反硝化细菌的n (MPN )较根表面高4个数量级、较根外10cm 和30cm 处的水体分别高2和5个数量级;根际氨化、亚硝化细菌较根表面分别高3和2个数量级,较根外的两点亦分别高2～3个数量级.2.4 氨化和反硝化作用产气量在测定敞水区、凤眼莲、水花生及菱群落内水体氨化和反硝化细菌n (MPN )的同时,还测定了各样品氨化图5 凤眼莲根际周围氮循环细菌分布Fig .5 Distribution of nitrogen c ycle bacteria around t he root of Eichhornia c rass ipes rs :根面root surface ,rh :根际rhizosphere or :根外outside of root (见表1See Table 1)和反硝化产气量(表2)及主要气体类别.纳氏法测定结果表明,氨化作用产生的气体主要是NH 3;气相色谱分析结果表明,反硝化作用产生的气体主要是N 2O . 统计分析结果表明,样品氨化、反硝化细菌的最大可能数之对数与产气量的相关系数分别为0.866、0.873;显著性检验结果:t 值分别为10.038、25.938,均大于t (0.001,10)=4.587,表明样品氨化、反硝化细菌的最大可能数之对数与产气量相关性有极显著意义.表2 氨化和反硝化细菌的最大可能数与气体截留量Table 2 The catching gas volume and n (MPN )of ammonifying and denitrifyin g bacteria氨化细菌(Ammonifying bacteria )1997-061997-081997-09-x g 反硝化细菌(Denitrifying bacteria )1997-061997-081997-09-x g ＊＊凤眼莲(E )＊n (MPN )V /mL 1.7×1041.12.5×1052.53.5×1052.71.1×1052.11.7×1072.91.8×1062.41.6×1083.91.7×1073.1水花生(A )＊n (MPN )V /mL 9.0×1042.53.0×1041.19.0×1052.21.3×1051.99.0×1062.51.8×1072.11.8×1082.63.1×1072.4菱(T )＊n (MPN )V /mL 1.8×1052.51.7×1052.51.8×1062.73.8×1052.63.0×1040.66.0×1040.89.0×1050.73.1×1050.7敞水区(ow )＊n (MPN )V /mL 2.5×1041.22.5×1030.91.5×1041.13.1×1031.19.0×1020.51.2×1020.51.4×1020.53.1×1020.5＊见表1 See Table 1 ＊＊-x g :几何平均值Geometric means 由表2可知,氨化作用产气量,菱群落内水样最高,为敞水区水样的2.36倍;凤眼莲、水花生群落内水样的氨化作用产气量分别为敞水区水样的1.91、1.73倍.因此,在水生高等植物群落内,由于氨化细菌较多,环境条件较适宜(pH 7.9～8.8),氨化作用将有机氮还原为铵和氨,促进了湖水中的氮以气态氨的形式挥发.凤眼莲、水花生群落内水样的反硝化产气量分别敞水区的6.2、4.8倍,而菱群落内水样的反硝化产气量仅为敞水区的1.4倍.特别是在凤眼莲、水花生群落内,水体溶解氧较低(0.19～0.90mg /L ),p H (7.5～9.0)等环境条件较适宜,有利于反硝化细菌进行反硝化作用,将水中的NO -3-N 还原为NO -2-N 及气体N 2O 和N 2,从而促进了湖水氮素释放.3 讨论3.1 水生高等植物与氮循环细菌的分布水生高等植物是水体氮循环细菌的重要载体.反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌是水体及湿地环境中常见的菌群,其生长和繁殖不仅受底物浓度影响,而且受环境条件影响.特别是反硝化与硝化及亚硝化细菌,前者往往分布在厌氧还原环境中,而后两者则通常分布于富氧氧化环境中.在湖泊的敞水区,由于湖水的均质性,因此,这些菌群很难同时形成优势并产生作用.而在水生高等植物根际存在氧化还原微环境,空气中的氧1932期王国祥等:太湖反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌分布及其作用 气通过水生高等植物的根茎叶通气组织到达水生高等植物根部,并扩散到根表面,环绕根形成一薄的氧化层(即根际氧化带aerobic rhizosphere )[4];在这一氧化层外,由于水生高等植物的覆盖及其呼吸代谢作用,往往处于缺氧状态.正是由于在水生高等植物根区存在这样一个富氧-缺氧的氧化还原微环境(图6),因此,反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌能够同时出现并发挥其作用.研究结果表明,反硝化、亚硝化及氨化细菌在水生高等植物群落内的水体中均高于敞水区,而且在植物根际处最为密集.这说明,水生高等植物是水体反硝化、亚硝化及氨化细菌的重要载体.用水生高等植物净化受污水体,由于同时引入了大量的氮循环细菌,并为氨化、硝化-反硝化作用创造了有利条件,从而促进了水体氮循环过程,增强了水体自净功能.图6 水生高等植物根际氧化还原微环境及氮循环Fi g .6 The microenvironment of oxido -reduction in the root zone of aquatic macrophytes and nitrogen cycle (1)氨化作用ammoniation (2)反硝化作用denitrification(3)硝化作用nitrification (4)亚硝化作用nitrosofication 3.2 氮循环细菌分布对氮循环过程的影响在氮循环过程中,反硝化、硝化、亚硝化及氨化作用是微生物的特有环境功能,只有存在这些细菌,才能发生相应的氮循环过程,因此,氮循环细菌的分布对氮循环过程有重要影响.而且,用MPN 法测定氮循环细菌,其依据就是各类氮循环细菌的生理功能.测定水样反硝化细菌含量就是依据该水样在一定条件下将NO -3-N 转化为NO -2-N 及产气(N 2O 、N 2)的概率,估算水样中反硝化细菌的n (MPN );测定水样硝化或亚硝化细菌含量就是依据该水样在一定条件下将NO -2-N 或NH +4-N 转化为NO -3-N 或NO -2-N 的概率,估算水样中硝化或亚硝化细菌的n (MPN );测定水样氨化细菌含量就是依据该水样在一定条件下将有机氮转化为铵或氨氮的概率,估算水样中氨化细菌的n (MPN ).因此,用MPN 法测定的水体反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌结果,在某种意义上反映了该水体反硝化、硝化、亚硝化及氨化作用强度.特别是反硝化作用,国内外的研究业已证明,在有水生植物生长的湿地或水体中较无水生植物生长的湿地或水体强烈[6～8,11].本研究结果表明,反硝化细菌在水生高等植物群落内水体中明显高于敞水区湖水,在漂浮植物群落内水体中明显高于沉水和浮叶植物群落内水体;而且漂浮植物群落内的水体,由于受其上群落的覆盖影响,溶解氧较低,处于相对缺氧状态(0.19～0.90mg /L ).研究结果进一步揭示,正是由于水生高等植物群落内存在密集的反硝化细菌及有利的反硝化微环境,所以反硝化作用特别强烈.致谢 感谢中国科学院太湖湖泊生态系统研究站杨龙元研究员给予的大力支持和帮助.参考文献1 Rheinheimer G .Aquatic Microbiology .3rd ed .New Y ork :J ohn Wiley &Sons ,19852 Matul ewich VA ,Fins tein M S .Distribution of autotrophic nitrifying bacteria in a polluted river (the Pass aic ).Appl Envir on Mic robi ol 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