大肠杆菌的转化及重组菌的筛选解析
实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌
pET32a
多克隆位点（MCS）：外源DNA片段的插入位点
Amps菌株
pET32a
Ampr
培养基上含有X-Gal和 IPTG时，可使用蓝白 斑筛选方法鉴别真正 的重组的转化子。
涂布于含Amp的培养基上，可以生长。 次日可见白色菌落-- 转化子。
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 复制起始位点 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
实验报告
思考题
(1). 根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？ (2). 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落 ，你将如何解释这实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次继代或储于４℃的培 养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制 备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为 0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同), 这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过 滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至 100ml,用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于 4℃冰箱储存 .
3. 复苏：向每管中加入800μl LB液体培养基(注：不含
Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时，使细菌恢
复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态制备及转化
大肠杆菌感受态制备及转化大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，常见于土壤、水体、人和动物的肠道等地方。
由于其易于培养和操作，成为生物学研究中常用的实验材料。
本文将介绍大肠杆菌的感受态制备及转化的过程。
感受态制备是指将大肠杆菌细胞从冻存状态恢复到活跃状态的过程。
为了保证感受态制备的成功，首先需要准备培养基和细菌菌种。
常用的培养基有LB培养基和SOC培养基，其中LB培养基适用于大肠杆菌的一般培养，SOC培养基则适用于感受态制备和转化实验。
培养基的配制需按照实验要求进行，注意消毒措施，避免污染。
感受态制备的过程一般包括以下几个步骤。
首先，将冻存的大肠杆菌菌种转移到预先加热的LB培养基中，进行孵育培养。
培养温度和时间根据实验需要进行调整，通常为37摄氏度下培养12-16小时。
其次，将培养物进行稀释，使其浓度适合后续实验操作。
最后，将稀释后的细菌液进行离心，去除上清液，沉淀后的菌体即为感受态大肠杆菌。
感受态大肠杆菌的转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌细胞中的过程。
转化的前提是大肠杆菌细胞处于感受态，即细胞膜对外源DNA具有较高的通透性。
转化的关键是选择合适的质粒载体和转化方法。
常用的质粒载体有pUC19、pGEM-T等，这些载体具有含有抗生素抗性基因的特点，可以通过抗生素的选择来筛选转化成功的细菌。
质粒载体通常通过限制酶切与外源DNA进行连接，形成重组质粒。
将重组质粒与感受态大肠杆菌进行转化后，通过培养在含有抗生素的培养基上筛选，即可得到含有目标基因的转化菌落。
转化的方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
热激法是将感受态大肠杆菌与重组质粒混合后，在高温条件下进行短暂的热冲击，使细菌细胞膜通透性增加，促进外源DNA的摄入。
电穿孔法是利用电场作用使细菌细胞膜产生孔隙，使外源DNA通过孔隙进入细胞。
化学法则是利用化学试剂改变细菌细胞膜的性质，增加其对外源DNA的吸收能力。
转化后的菌落需要进行筛选，常用的方法是通过抗生素选择。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
大肠杆菌重组蛋白表达流程
大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。
启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。
2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。
在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。
3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。
转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。
转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。
4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。
此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。
5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。
诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。
6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。
可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。
常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。
7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。
确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。
需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。
为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。
简述大肠杆菌转化法的原理
简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。
其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。
质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。
2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。
这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。
3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。
这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。
4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。
5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。
这些菌落会在培养基中形成可见的生长。
通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。
这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
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实验三大肠杆菌的转化及重组菌的筛选
一、实验目的
学习和掌握转化大肠杆菌的通用方法，并进行转化子的筛选
二、实验原理
转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。
大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competent cell）。
经CaCl2处理后大肠杆菌与外源DNA混合进行42℃短时间的热激可利于外源DNA转化，然后再经过恢复和筛选，选择转化子。
三、实验材料
E.coli (受体) pBSK+质粒DNA
四、实验仪器、器皿及试剂
1．仪器：低温冷冻高速离心机、恒温水浴箱、超净工作台、冰箱
2．器皿：Eppendorf离心管、微量加样器及Tip 、乳胶手套
3．试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml 氨苄青霉素、0.1mol/l CaCl2溶液
五、实验步骤
1．从甘油保存菌种中接种一环E.coli至LB平板上，37℃倒置培养过夜。
2．挑取2~3mm直径的单菌落接种至有50ml LB液体培养基的三角瓶中，37℃震荡培养2小时（摇床转速250r/min）当OD590为0.375即可。
3．吸取1.4ml菌液至Eppendorf管，7000g离心2min，弃上清，并倒置于吸水纸上。
4．重复步骤3一次。
5．将细菌悬浮于1ml预冷的0.1mol /lCaCl2溶液中，置冰浴10min。
6．7000g离心2min，弃上清，收集细菌。
7．将细菌重悬于200μl预冷的0.1mol /l CaCl2溶液，冰浴30min。
8．每管加入质粒DNA50ng/10μl，轻轻混匀，冰浴放置20min，设一不加质粒DNA的对照。
9．将管置于42℃水浴中2min，不要摇动。
10．迅速转移至冰浴2min。
11．加入800μlLB液体培养基，37℃培养45min，以便转化菌表达抗性。
12．接种到含100μg/ml Amp的LB冷平板上。
13．将平板倒置入37℃恒温培养箱培养过夜。
14．确信对照无菌落时，在Amp培养基上长出的菌落即是转化子。
六、注意事项
1．试剂纯度高是非常重要的，尤其是CaCl2，有时同一厂家出品的不同批号产品，其致敏的感受态细胞转化率也有一定区别，所以应该进行预实
验鉴定其致敏效果。
2．贮存的菌株应保存在-70℃，有经验表明，直接从-70℃取出的菌株，培养致敏感后，比连续使用或4℃短期保存的细菌的转化率要高，致敏前
应收获对数期或对数生长前期的细菌用于制备感受态细胞。
3．转化实验使用的玻璃器皿，微量吸管及Eppendorf管等，应进行高压消毒。
4．注意无菌操作，防止污染杂菌。