如何克隆哺乳动物免疫基因的上游区启动子
抗体的表达原理
100mg／L左右的表达水平，大肠杆菌体系不能
对表达产物进行糖基化，只能表达抗体分子片
段，但由于其遗传背景清楚，操作简单，成本
低，周期短等优点，亦有较广泛的应用，尤其
在研究领域。
•
酵母细胞和昆虫细胞表达体系具有
一定的糖基化功能，能表达完整抗体分
子，可达到较高表达量 ，其操作及成本
较哺乳动物细脑有一定优势，但在抗体
表达载体含有以下几种基本元件：骨架序列、选 择标志基因、表达盒以及一些特殊的调控序列。 除骨架序列外，其它元件对抗体的高效表达均存 在一定的影响。
载体系统分类
• 根据工程细胞克隆中目的基因拷贝数能否 扩增，表达载体可分为两类：
• A 可扩增表达载体系统。
• B 不可扩增表达的载体系统。
•
有一类特殊的选择标志基因可以在外
配分泌抗体的功能。
•
因此表达的各种抗体具有抗体的功能活性：
由于转染的外源DNA在COS细胞并不整合，而
是以游离形式存在并复制，因此COS细胞最常
用于抗体的瞬时表达。近年来COS细胞己用于
筛选或检测新构建的新型抗体的活性及特征，
也用于研究从噬菌体库中筛选的抗体基因在真
核细胞中表达的功能和特点，还用于各种抗体
• 此外哺乳类动物细胞还拥有完整的转录、 翻译后加工及分泌等机制，包括抗体的糖 基化、羧基化等一系列复杂的加工过程， 因而哺乳动物细胞表达系统表达的抗体通 常具有正确的折叠和空间构象以及正确的 装配，具有良好生物活性，基本近似于天 然抗体。
•
同时哺乳动物细胞还能实现抗体的分
泌性表达，表达产物可分泌至无血清或无
二重组抗体片段的可溶表达由于可溶表达的抗体可能对宿主菌产生毒性因此可溶表达载体应选用严格调控的诱导型启动子来降低本底过强的启动子因为对大肠杆菌的分泌加工能力要求过高而并不能增加分泌表达的产量有时甚至会降低可溶表达的产量诱导的强度和持续时间也会影响产物的正确折叠多数情况下可以利用降低温度来增加可溶表达的产量经验值为2432度
寻找上游靶基因的方法
寻找上游靶基因的方法寻找上游靶基因的上游转录因子主要依赖于以下几种方法：1、生物信息学预测：1.Promoter分析：通过分析目标基因启动子区域的序列，预测可能存在的转录因子结合位点（TFBS）。
可以使用诸如JASPAR、TRANSFAC、Homer等工具，这些工具基于已知转录因子结合motif库来进行预测。
2.ChIP-Seq数据分析：查阅公共数据库中的ChromatinImmunoprecipitation followed by Sequencing(ChIP-Seq)数据，这些实验结果直接展示了转录因子在基因组上的结合位置，从而推断哪些转录因子可能调控目标基因。
2、实验验证：1.ChIP实验：通过Chromatin Immunoprecipitation实验，直接捕获与DNA结合的转录因子，然后通过PCR或测序来鉴定转录因子在目标基因启动子区域的存在。
2.报告基因实验：构建含有目标基因启动子片段的报告基因载体，将其转入细胞系，然后过表达或敲低潜在的转录因子，观察报告基因表达水平的变化，以验证转录因子对目标基因的影响。
3、基因表达谱关联分析：1.结合转录组测序（RNA-Seq）或微阵列数据，分析转录因子敲除或过表达时，下游基因表达谱的变化，找出与转录因子表达水平显著相关的基因，进一步筛选可能的靶基因。
4、CRISPR/Cas9基因编辑技术：1.利用CRISPR-Cas9系统在目标基因启动子区域内进行定点编辑，破坏潜在的转录因子结合位点，通过观察靶基因表达的变化，来验证转录因子与靶基因的关系。
综合以上方法，既可以初步通过生物信息学预测缩小范围，也能通过实验手段来验证预测结果，从而确定转录因子对靶基因的调控关系。
基因启动子分析
基因启动子分析一：克隆目的基因基本启动子序列我们都知道，基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游，当一个基因在没有确定其转录起始位点的时候，我们假定NCBI上提交的序列就是他的完整转录本，那么他的第一个碱基就是他的转录起始位点。
而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游2000bp左右和下游200bp左右，当然,这个是一般情况,具体问题还要具体分析.尤其现在发现一般的基因都是有几个转录起始位点的.我们通过该基因mRNA序列和基因组序列BLAST，就能够在染色体上找到这段基因组序列。
我这里用human的AGGF1基因做个例子给大家具体演示一下.1 首先需要在NCBI里面查找到AGGF1基因的mRNA序列,这个我想大家都应该很清楚,如下图.2 然后就是用这段mRNA序列和人类的基因组序列BLAST3 BLAST得到了很多结果，我们往往选择最上面那个最匹配的结果。
4 点击之后就可以看到下图，这个基因的14个外显子和13个内含子在5号染色体上的位置一目了然，第一个外显子在上面，说明这个基因在染色体上是正向的，基本启动子就应该在第一外显子上面，我用红色的方框标明了。
5 大家有没有注意到左上方有个数据框，我把数值改为76,360K 到 76,362.200 ,刚好2200BP,包括了第一个外显子的前200BP左右.然后点击红色框标明的Download/view sequence.6 然后就到了这个界面, Sequence Format 选择GenBank, 然后点击 Display. 就得到我们所需要的序列了.7 这里我们可以看到1989到2201是AGGF1的mRNA序列,说明我们的确找到了该基因5'非翻译区的上游启动子序列.建议将这2200bp都克隆下来.以上的步骤就是基因基本启动子的查找,其实还有很多调控序列是在基因内含子区域或者是基因的3'非翻译区等,序列查找的步骤和上面是一样的.8 还有一个方法更加简单,那就是用AGGF1的 前60bp序列和nucleotide 数据库 BLAST,可以得到该序列在染色体上的位置,需要注意的是,如果是反向的序列的话,我们就要选择反向互补的序列.二：软件预测顺式作用元件，做点突变分析得到这些序列后,克隆进没有启动子载体pGL3或者pTAL-luc中去，转染细胞, 测定荧光活性，如果有很强的活性,那么说明你已经成功克隆到了该基因的基本启动子. 然后可以通过5‘非翻译区一系列的缺失突变，不断把范围缩小,找到哪一段序列对于该基因的启动子活性是必须的或者是最重要的。
基因克隆的基础知识
基因克隆的基础知识：1、一般真核生物基因的转录依赖于RNA聚合酶II，但它和DNA序列的结合以及转录的开始并不是随机的，它只有通过识别目的基因的特定序列（启动子）并与之结合后方能开始正确转录，基因组的结构大致如下：＝＝GC区＝＝＝CAAT box＝＝TATA box＝＝TSS＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝AATAAA＝＝其中启动子主要跨越CAAT box和TATA box，RNA聚合酶II和启动子结合后就可以正常转录，不同的box作用不同，其中GC区和CAAT区主要调节转录的效率，去除这两个部分后将大大降低转录效率；而TATA box主要作用是参与转录起始位点（TSS）的确定，所以基因预测以及基因确定时可以看基因组中有无TATA box，但TATA box等序列并不是确定基因的充分必要条件，一些基因并不一定有TATA box，也未必全含上述三个box。
2、基因转录后，形成核不均一RNA（hnRNA），即mRNA的前体，其经过5加帽3加尾和内含子剪接后形成成熟mRNA。
TSS－－5UTR－－ATG＝exon＝gt－intron－ag＝exon＝……＝TAA－3UTR－AATAAA－poly （A）内含子剪接位点有特异性序列（gt/ag），内含子剪接后，使介于起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA，TGA，TAG）的外显子连在一起，它们是编码aa序列的ORF（open reading frame），也称为CDS（coding sequence）。
从TSS到ORF为5UTR（5'Untranslated Region）区，从TAA 到poly（A）为3UTR（3' Untranslated Region）。
TSS－－5UTR－－ATG＝＝＝ORF（CDS）＝＝＝TAA－3UTR－AATAAA－poly（A）site3、在确定ATG起始密码子时，可以用到KOZAK序列，它主要指有AXXATGG结构，即ATG 前－3位一般为A，ATG后为G，不过现在有一些现成的软件可以直接预测ORF，如ORF finder。
哺乳动物细胞表达系统
据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列 能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
真核表达载体-启动子
外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要 是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规 模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细 胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现 高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个 克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层 贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。
对细胞株选择性地进行遗传改造
BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白 的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV 早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。
Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动 子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。
这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。
真核表达载体-启动子
在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录 的基因，如编码红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、血红素加 氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件 (CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导作用因子1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录， 在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。
哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。
与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。
从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。
本文主要从表达系统及其两个组成部分一一表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。
研究现状①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。
②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。
如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子皿、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素出，集落刺激因子等。
有些产品已投入临床应用或试用。
③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30^g/l08细胞/24小时。
有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中（对于重组蛋白来讲，常是异源的），重组蛋白的分泌效率较低。
1表达载体1. 1表达栽体的类型哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。
利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。
根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。
病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。
常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒（sFv）载体等。
启动子、复制起始位点、起始密码子
.1.启动子：是转录时RNA聚合酶结合的位点，是位于基因编码区的一段DNA，与RNA聚合酶结合后起始mRNA合成的序列。
2.复制起始位点：是DNA复制的起点，是带动目的基因复制的3.起始密码子：是位于mRNA上的，是翻译开始的地方，其本质是RNA4.转录起始点：转录时，RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤。
5.一般启动子位于转录起始点上游，具体位置关系如下：a.真核生物有3类RNA聚合酶，负责转录3类不同的启动子。
b.RNA聚合酶I负责转录的rRNA基因，启动子（I类）较单一，由转录起始位点附近的两部分序列构成。
第一部分是核心启动子，由-45—+20位核苷酸组成，单独存在时就足以起始转录。
另一部分由-170—-107位序列组成，称为上游调控元件，能有效地增强转录效率。
c.RNA聚合酶Ⅲ负责转录的是5SrRNA、tRNA和某些核内小分子RNA（snRNA），其启动子（Ⅲ类）组成较复杂，又可被分为三个亚类。
两类5S rRNA和tRNA基因的启动子是内部启动子，位于转录起始位点的下游，都由两部分组成。
第三类启动子由三个部分组成，位于转录起始位点上游。
d.RNA聚合酶II负责转录的II类基因包括所有蛋白质编码基因和部分snRNA基因，后者的启动子结构与III类基因启动子中的第三种类型相似。
编码蛋白质的II类基因启动子在结构上有共同的保守序列，多数II类启动子有一个被称为TATA盒的共有序列，通常处于-30区，相对于转录起始位点的位置比较固定，也有一些II类启动子不含有TATA盒，这样的启动子称为无TATA盒启动子。
6.原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列-35区和-10区组成，位置关系：-35区，-10区与-35区之间的间隔，-10区，间隔，转录起始位点7.;..。
高中生物那点事儿
高中生物那点事儿1启动子、起始密码和复制原点启动子：是基因的一个组成部分，其化学本质是DNA的部分序列，控制基因转录的起始时间和基因表达的程度。
启动子就像“开关”，决定基因的活动。
启动子存在于基因编码区上游的非编码区，是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。
在启动子上有与RNA聚合酶结合的位点。
起始密码子：碱基顺序作为遗传信息而被正确翻译通常需要从某个特定的位置开始翻译，这个起始点的密码子就叫做起始密码子。
起始密码子由mRNA上相邻的3个碱基组成，从这3个碱基开始决定蛋白质合成。
蛋白质是由许多氨基酸组成的，而组成蛋白质的第一个氨基酸就是由起始密码子决定的。
真核生物的起始密码子AUG翻译对应的是甲硫氨酸。
少数细菌（属于原核生物）以GUG（缬氨酸）为起始密码。
复制原点：DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。
DNA 的复制是由许多复制原点处形成的起始复制叉开始的。
多个复制原点及由复制原点开始向DNA两端同时复制，都有利于加快DNA复制速度。
2终止子和终止密码终止子：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列（存在于基因的编码区下游的非编码区）。
终止子可分为两类：一类不依赖于蛋白辅助因子就能实现终止作用；另一类则需依赖蛋白辅助因子才能实现终止作用。
终止密码：是指蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA的三联体碱基序列。
在已知的64组密码子中，有3组不编码任何氨基酸，而是专司终止多肽合成，它们分别是UAG、UAA和UGA。
3 DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶和DNA连接酶DNA聚合酶：是细胞进行DNA复制过程中起主要作用的酶。
以DNA为模板，DNA聚合酶负责把一个个脱氧核苷酸通过脱水缩合的方式连接在一起。
复制方向是由DNA的5'端到3'端，即DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的1末端的羟基上，形成磷酸二酯键。
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分子生物学论文
如何克隆哺乳动物免疫基因的上游区启动子，并验证其中的调控元件？
实验原因：
随着气候变化，环境污染，水污染，放射性污染，重金属污染，生态系统遭到破坏，在这个疾病泛滥的时代，我们每个人、哺乳动物都不能避免生病这件事情，
而对于某些恶性疾病，对我们来说是致命的，如果我们能够掌握免疫启动上的技术，那么我们就可以按照我们的意愿及时对免疫基因的启动子进行调控，使得我们可以及时预防恶性疾病的侵袭，避免一定的经济损失，在体内合成大量的抗体，当病毒分子来袭时我们可以做好准备工作，对于养殖业来说可以大大降低生产时候药物资金的投入，同时使得我们的供应品更让人放心，同时对于人类来说，减少疾病的折磨，人和动物传染病、寄生虫病、肿瘤、自身免疫病和变态反应性疾病进行诊断，是免疫技术最突出的应用。
尤其是酶标抗体技术，已成为多种传染病的常规诊断方法，如已有人各型肝炎、猪瘟等ELISA试剂盒，它们简便、快速，又具有高度的敏感性和可重复性。
此外，免疫基因在疾病诊断、动物生理活动研究、物种及微生物鉴定、动物性状的免疫标记等方面有极其重要的应用，所以对哺乳动物免疫基因上游区启动子的研究是很有必要很有意义的一件事情。
实验方法：
启动子（promoter）是基因的一个组成部分，在遗传学中是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。
启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。
在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域,就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
完全的启动子称为规范序列。
在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribrow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录起始点上游-25~-30 bp处的共同序列似TAAA，也称为TATA区。
另外，在起始位点上游-70～-78 bp处还育另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中-35bp区相对应的序列．称为CAAT区（CAAT hox）。
在真核基因中，有少数基因没有TATA框。
没有TATA框的真核基因启动子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的则没有GC框。
GC框位于-80～-110bp处的GCCACACCC 或GGGCGGG序列。
TATA框的主要作用是使转录精确地起始；CAAT框和GC框则主要是控制转录起始的频率，特别是CAAT框对转录起始频率的作用更大。
如在TATA框同相邻的UPE之间插入核苷酸，也会影响转录使之减弱。
TATA框上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE）或上游激活序列。
-10序列又称为Pribnow盒（原核生物）。
在真核生物中相应的序列位于-35bp 处，称为TATA盒，又称为Goldberg-Hognessbox，是RNA聚合酶Ⅱ的结合部位。
-10和-35这两个部位都很重要。
上游控制元件从-180bp至-107bp，上游启动子有3个上游元件：TATA框，近端序列元件（PSE）h和八聚体元件（OCT）。
上游序列往往有另外的功能。
例如上游顺序可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。
上游顺序所引起的DNA结构的微细变化可能在双螺旋上被传导到相当远的距离，因此上游顺序的变化可以影响到-10和-35区的DNA结构细节。
启动子研究的第一步是确定启动子的位置及长度，主要方法是用却是实验来确定启动子上游的边界，当缺失影响转录起始时，说明该处就是启动子上游区的边界，
Smart Race技术是近年来开发的一种快速、方便的定位基因转录起始位点的方法。
启动子克隆方法：利用启动子探针质粒载体筛选启动子；启动子探针型载体
是一种经济、有效、快速分离基因启动子的工具型载体，包括两个部分：转化单元和检测单元。
其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。
利用启动子探针筛选启动子过程：先选用一种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计要求是克隆片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组或何物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。
当插入段同时满足
（1）具有基因启动子序列
（2）具有翻译起始区
（3）具有起始密码子
（4）插入方向正确
（5）插入片段3’端编码区序列抗性基因融合基因，从而启动抗性基因表达。
启动子区域的确定——染色体定位，根据基因图谱对序列进行染色体定位浏览其基因组上游基因，具体方法
（1）进行Genomic BLAST搜索；
（2）通过Genome view观察基因组结构；
（3）点击相应染色体区域上游的基因进行精确定位
实验结果：
基因上游调控序列的分析:
(1) 启动子预测，用FIRSTEF程序进行启动子预测，用PT-PCR等实验方法，获得的mRNA往往缺少完整的5’端，采用FirstEF程序可以对第一外显子和CPG 相关启动子进行预测。
(2) 转录因子结合位点分析：TFSEARCH程序和MATCH程序。
报告基因是一种编码可检测的蛋白质或酶的基因，可以通过对其表达产物的鉴定及定量分析等进而对目的基因进行研究，报告基因主要用于：1.把报告基因序列和起基因表达调控作用的序列连接起来，进行表达调控序列的结构和功能研究2、与目的基因融合表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达3、在反式作用因子相互作用检测体系中，可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质只见到相互作用。
另外，在基因工程中常用报告基因里对转化条件进行摸索和优化功能研究。
作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件
1、已被克隆且序列清楚
2、表达产物受体细胞不存在
3、表达产物能进行定量测定，在动物基因表达调控中，报告基因被广泛应用。
将所研究的目的基因调控序列克隆到报告基因的表达质粒中，然后将重组质粒导入适当细胞系，通过测定报告基因的表达的水平，间接评价，在调控序列指导下对基因表达的作用。