02+基因操作的单元过程

使外源DNA 进行复制的能力；
表达外源重组体的某些表型特征，以利于 重组菌的选择和鉴定。
2.转化

是指感受态的宿主细胞捕获（重组） DNA 分子的过程； 感受态细胞（competent cells）是 处于能摄取外界 DNA 分子的生理状态 的细胞。


方法：CaCl2处理、电转化等
3.转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主 4.显微注射：
基因工程的单元过程
Genetic Engineering
一、何谓基因工程？
外源基因通过体外重组后而导入受体
细胞内，使这个基因能在受体细胞内 复制、转录、翻译表达的操作叫做基 因工程，又称重组DNA技术，基因操 作，基因克隆。
基因的体外重组：不同的DNA分子间发
生共价连接形成重组DNA分子。
质粒DNA
4-1-2 目的基因与载体的酶切（切）


载体
限制性内切酶
1. 载体（Vector）
能有效运载外源
DNA 片段（基因）进入 受体细胞内的、可自主复制的 DNA 片段。
含义：
①载体同外源 DNA 在体外组成重组分子
②进入受体细胞后能进行自我复制 ③载体决定了外源基因的复制、扩增、传 代乃至表达
library ）
含重组分子的转化菌3、cDNA（Complementary DNA library）
以生物细胞的总mRNA为模板，用逆转录酶
合成互补的双链cDNA，cDNA
的提取 的鉴定
的合成和克隆
目的cDNA
mRNA的提取与纯化
5.电穿孔：电场脉冲在细胞壁上打孔
4-1-5 重组菌的筛选和鉴定（筛）


根据载体遗传标记检测
根据克隆DNA序列检测

根据外源基因表达产物检测
1.根据载体遗传标记检测

抗药性筛选法：四环素、氨卞青霉素筛 选pBR322质粒 营养缺陷型筛选法：载体分子上携带某种
营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能 合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含 此营养组份的培养基上，长出的便是转化子

3-3 基因工程的应用----环境保护

利用基因工程可获得同时能分解多种有物质
的新型菌种。1975年，获得了能同时降解四
种烃类的“超级菌”，能分解原油中约三分
之二的烃。
一年 几小时
海上浮油
3-4 基因工程的应用----医学
基因工程菌生产药物：
基因工程菌：蛋白类药物转基因工程菌 转基因植物：转基因抗性作物 转基因动物：转基因牛，乳汁中含蛋白药物
治疗糖尿病、多种内脏疾病
3-4g胰岛素
100kg胰脏 30-40升大肠杆菌发酵液
传统工艺
基因工程
3-2 基因工程的应用---农业


固氮基因工程：能独立固氮的新型作物；
木质素分解酶或纤维素分解酶基因的酵母 基因工程菌：利用稻草、木屑等廉价原料 来生产酒精； 抗性基因工程：改良和培育农作物和家畜、 家禽新品种（植物的抗盐、抗旱、抗病基 因以及鱼的抗冻蛋白基因）等。
一般能识别和切割
Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
G + GATCC CCTAG G
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平末端切口
目的基因用Bam HⅠ切割
载体DNA用Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
+
GATCC G GATCC G
T4 DNA连接酶
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
载体自连
影印
菌落原位杂交
洗涤 杂交
感光
2.根据克隆DNA序列检测
DNA测序：
最可靠的检测方法；
测序服务已商业化，可很方便地进行。
3.检测外源基因表达产物
蛋白质生物功能检测：
如：纳豆激酶具有溶 纤活性，在纤维蛋白 平板上会出现溶纤圈。
3.检测外源基因表达产物
免疫检测：利用外源
基因表达蛋白相应的 抗体来检测
1、化学合成法获取目的基因
将几个单核苷酸通过有机化学反应以3’,
5’- 磷酸二酯键连接起来形成寡核苷酸片段 （目的基因）的方法。
条件:必须知道目的基因的核苷酸排列顺序
或目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密 码子推导出DNA的碱基序列。
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
局限性：
不能合成太长的基因，只适用于克隆小分
重组菌的培养工程
通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件； 通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案。
本章重点
概念：基因工程、PCR、载体、限制
性核酸内切酶、转化、感受态细胞
基因操作的基本步骤是怎样的？每一
步骤各需要哪些物质参与？
重组子的筛选鉴定有哪些方法？
聚丙烯酰胺凝胶电泳：
如：外源表达蛋白分 子量约为27kd
4-1-6 目的基因的扩增和表达（表）

目的基因的扩增（通过重组菌的增 殖即可达到） 目的基因的表达：

1. 目的基因表达的影响因素
宿主的选择：原核、真核表达系统各有优劣
表达载体的构建
表达载体启动子、终止子的强弱（转录水平） 是否具有翻译所必需的序列（SD序列） 重组载体的稳定性、拷贝数
四、基因工程的主要内容 4-1 基因工程的基本操作过程
分（离目的基因）
切（割目的基因和载体）
接（连目的基因和载体）
转（化宿主细胞）
筛（选阳性克隆）
表（达目的基因）
分
目的基因 基因载体
切
接
重组体
筛
转 表
4-1-1 目的基因的获得（分）

化学合成法基因组DNAcDNA
聚合酶链反应PCR
重组体
目的基因自连
目的基因 载体
限制性内切酶
T4DNA连接酶 15º C 重组体 载体自连 目的基因自连
2.平末端 DNA 片段的连接

直接用 T4 DNA连接酶连接，但效率仅 为粘性未端的1% 同聚物加尾法

人工接头连接法等
目的基因 限制酶或机械剪切
5´ 3´ 5´ 3´ A(A)nA 3´ 5´ 5´ 3´
限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，主要利用的是Ⅱ
命名
HindⅢ
属 系 株 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写
第四个字母代表株
用罗马数字表示发现的先后次序
特点
4~8 个碱基对的、具有回 文结构的核苷酸序列 大多数识别序列切割方式有两种： 切割产生突出的粘性末端（sticky ends） 切割产生平头末端（ blunt ends ）


显色筛选法：蓝白斑筛选pUC质粒
2.根据克隆DNA序列检测
限制性酶切图谱法：
如：质粒3593bp；目 的片段830bp；则：重 组质粒4.4kb；
PCR检测：
以重组质粒为模板PCR 可得到830bp的条带
2.根据克隆DNA序列检测
核酸分子杂交：
应用放射性标记的特定的DNA或RNA作 探针（已知序列），与待测的核酸序列进 行杂交。 探针只能与互补的特异核酸特异结合， 通过检测放射性杂交信号来定位待测序列。
基因片段
重组DNA
二、基因工程技术的诞生

1972年，美国斯坦福大学P. Berg等将新的遗传信息 插入SV40病毒 DNA，标志着基因工程技术的诞生。
1973年，Cohen等构建了第一个有功能的重组DNA 分子（DNA克隆）。 1977年，美国Boyer等人第一次使大肠杆菌产生了 人脑的一种激素：生长激素释放抑制素。

抗生素、人胰岛素、抗体、干扰素、激素、血
细胞介素等的基因工程菌； 基因工程疫苗； 氨基酸高产基因工程菌；


工业和医用酶制剂高产基因工程菌。
基因工程菌经济效益
抑制和调节多种激素的作用
5mg人体生长激素释放激素(SS)
50万只羊脑中提取 传统工艺 10升大肠杆菌发酵液
基因工程
基因工程菌经济效益
----插入的外源DNA序列可转录翻 译成多肽链
根据载体进入受体细胞的不同可分为：
原核细胞表达载体
真核细胞表达载体 常用载体的种类： ①质粒（plasmid）载体 ②噬菌体载体 ③病毒载体
质粒
作为载体必备：
复制起始点（ori）；
抗生素抗性基因：如：抗氨苄青霉素基因Ampr、
抗四环素基因Tetr、抗卡那霉素基因Kanr、抗 氯霉素基因Cmlr、抗链霉素基因Strr等
mRNA
逆转录酶
ＤＮＡ聚合酶杂化双链cDNAcDNA 基因重组转化
4、聚合酶链式反应
（polymerase chain reaction ）PCR
体外快速扩增特定目的基因或者
DNA 序列
的方法 。 以拟扩增的DNA分子为模板 以一对分别与模板5′末端和3′末端相互补的 寡核酸苷片段为引物 在 DNA 聚合酶的作用下使模板链延伸直至 完成新的DNA合成 重复该过程，即可使目的DNA片段得到扩增
子肽的基因
如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的
结果可能与天然基因不完全一致（遗传密码 的种直接从基因组中分离目的基因的方法。 步骤：