第10章-基因工程的操作过程教学内容

（3）花粉通道法 适用于被子植物
柱头
雌 蕊 花柱
胚珠 子房
子房壁
花药
雄 蕊
花丝
子房的结构
子房壁
珠被 珠心
胚
（胚囊）
珠
极核
卵细胞
滴加目的基因溶液
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发 后，花粉管要穿过花柱直通 胚囊。花粉管通道法就是在 植物受粉后，花粉形成的花 粉管还未愈合前，剪去柱头， 然后，滴加DNA（含目的基 因），使目的基因借助花粉 管通道进入受体细胞。
1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
（1）农杆菌转化法
①农杆菌：
植物的受伤组织会产生一些糖 类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受 伤组织集中 ，使植物形成肿瘤。
此类物质主要在双子叶植物细胞壁 中合成，通常不存在于单子叶植物中 ， 农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物， 对大多数单子叶植物没有感染能力。
（1）农杆菌转化法
②原理：
Ti质粒上的T-DNA可以转 移到受体细胞，并整合到受 体细胞染色体的DNA上。
③转化过程:
Ti质粒
构建
表 达
转入
农 杆
导入
目的基因
载 体
菌
植 物 细 胞
插入
植物细胞 染色DNA
表达
新 性 状
（2）基因枪法
适用于单子叶植物
基因枪法又称微 弹轰击法，是利用压 缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表 面的表达载体DNA打 入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表 达的方法。
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
2.将目的基因导入动物细胞
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体 显微注射
受精卵 早期胚胎培养
移植到子宫
新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：CaCl2法（ Ca2+增加细菌细胞的通透性） 常用菌：大肠杆菌
转化的#43;诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴 性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术， 其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶 结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出 现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一 些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率 的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任 何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的 什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做 成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白 基因等。
终止子：位于基因的尾端 的一段特殊的DNA片断， 能终止转录。
标记基因：为了鉴别受体 细胞中是否含有目的基因， 从而筛选出有目的基因的 受体细胞。
启动子 目的基因
表达载体
终止子
复制原点 标记基因
表达载体的模式图
注意：
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因 和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体 基础上增加了 目的基因 、启动子、终止子 三 部分结构 ②用到的工具酶：既用到 限制酶 切割载体， 又用到 DNA连接酶 将目的基因和载体拼接， 两种酶作用的化学键都是 磷酸二酯键 。 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表 达载体的方式携带进去。
第10章-基因工程的操作过程
一、表达载体的构建
科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败， 才获得成功。
起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载 体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗 虫基因在棉花体内没有表达。
然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子 (抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉 花植株还是没有抗虫能力。
取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组 DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接 纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌 通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方 法转移质粒或重组DNA分子
大肠杆菌感受态细胞的制备：
100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的20 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心 收集菌体 用1 ml 冰冷的100 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：
二、将目的基因导入受体细胞
（一）转化：目受的体基细因 胞进 内入 维持_受_稳__体__定__细____胞和___内表_，_达_并_的且过在程
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
将目的基因导入 动物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——氯化钙法（感受 态细胞）
微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
过程：
Ca2+处理大 肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态 细胞吸 收DNA
细菌能够吸收DNA的状态
受体生物 受体细胞
植物
受精卵 体细胞
动物
受精卵
导入方法
农杆菌转化法 基因枪法
花粉管通道法
显微注 射技术
微生物
细胞/个体
用Ca2+处理成 感受态细胞
2、过程:
质粒
DNA分子
同一种 限制酶处理
一个 切口 两个 黏性末端
两个 切口 获得目的基因
DNA连接酶 重组DNA（重组质粒）
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
表 b、启动子 达 c、终止子 载 体 d、标记基因
e、复制原点
启动子 目的基因
表达载体
终止子
复制原点 标记基因
表达载体的模式图
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是 RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转 录出mRNA，最终获得蛋白质。
科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中 插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵， 结果成长的植株，有了抗虫能力。
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自 身基因的启动子才能比较有利于导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；