微生物实验2
临床微生物检验_实验二
课后作业
复习今天接种细菌的各种生化反应原理与结果 预习第二天的各种生化反应原理及结果观察
第二天实验内容
试剂：苯丙、尿素、（赖氨酸、鸟氨酸、氨对）、 DNA酶、硝还、O/F 以上各种生化微量管 2支/人 O/F管 4支/人
菌种：大肠、变形、沙门、志贺、金葡、铜绿 其他：砂轮、接种针、酒精灯 观察昨天的生化反应结果并记录
③产生硫化氢 + 铁盐
FeS 黑色沉淀
应用：检测肠杆菌科细菌对乳糖、葡萄糖的分解和 产H2S能力。
克氏双糖铁试验结果示意图
未接种菌 的KIA
乳（－） 葡（＋） H2S(-)
乳（-） 葡（+）
H2S(+)
乳（+） 葡（产酸产气） H2S(-)
各种生化培养基接种的细菌
葡萄糖： 大肠埃希菌 、 沙门菌或志贺菌
砂轮接种针酒精灯?观察昨天的生化反应结果并记录mr和vp加试剂后观察无色红色vp试验甲基红试验紫红色橘黄色加试剂后观察乳葡产酸产气h2s大肠埃希菌在kia中结果乳葡h2s伤寒沙门菌在kia中结果乳葡h2s志贺菌在kia中生长结果kakakaaa?原理
广州医科大学
临床微生物学检验
实验 第二周
实验内容
指示剂
颜色改变
酸→碱
溴甲酚紫
黄→紫
溴麝香草酚蓝 黄→蓝
甲基红
红→黄
中性红
红→黄
酚红
黄红
感应0 6.8～8.0 6.8～8.4
碳水化合物代谢试验
1、糖(醇、苷)类发酵试验
原理：细菌含发酵糖(苷、醇)类的酶不同， 分解糖（苷、醇）能力不同，代谢产 物不同，指示剂呈酸性或碱性反应。
（再35℃0.5～1小时后观察）
实验二微生物的分离、纯化和接种
实验二微生物的分离、纯化和接种微生物的分离、纯化1、目的要求1.1了解微生物分离和纯化的原理1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法2、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。
而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。
3、实验材料3.1培养基肉汤培养基（固体）。
3.2溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。
3.3仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。
4流程倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。
5、步骤5.1平板划线分离法5.1.1倒平板倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。
并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。
5.1.2划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。
划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
实验二微生物的分离、纯化和接种
实验二微生物的分离、纯化和接种微生物的分离、纯化1、目的要求1.1了解微生物分离和纯化的原理1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法2、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。
而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。
3、实验材料3.1培养基肉汤培养基（固体）。
3.2溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。
3.3仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。
4流程倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。
5、步骤5.1平板划线分离法5.1.1倒平板倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。
并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。
5.1.2划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。
划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
医学微生物学实验二抗酸染色
实验考试
（五）实验结果
初染
石
脱色
盐 酸 酒 精
复染
碱 性 美 兰
未染色
初染后
脱色后
复染后
红色为抗酸染色阳性； 蓝色为抗酸染色阴性。 红色为抗酸染色阳性； 蓝色为抗酸染色阴性。
结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序， 结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝 状生长；背景及非抗酸性细菌呈兰色。 状生长；背景及非抗酸性细菌呈兰色。
二实验原理分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质主要是分枝菌酸它包围在肽聚糖的外面所以分枝杆菌一般不易着色要经过加热和延长染色时间来促使其着色同时分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后就很难被酸性脱色剂脱色故名抗酸染色
医学微生物学实验二
微生物学教研室： 微生物学教研室：3029130
科教科： 科教科：3029945
实验内容
1.实验一结果的观察和分析； 1.实验一结果的观察和分析； 实验一结果的观察和分析 2.细菌内毒素的检测技术； 2.细菌内毒素的检测技术； 细菌内毒素的检测技术 3.抗酸染色； 3.抗酸染色； 抗酸染色 4.实验考试。 4.实验考试。 实验考试
一、实验一结果的观察和分析
咽喉部细菌
空气中细菌
ห้องสมุดไป่ตู้三）实验材料
1.细菌： BCG）。 1.细菌：卡介苗 （BCG）。 细菌 2.抗酸染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、 2.抗酸染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱 抗酸染液 盐酸酒精 性美兰溶液。 性美兰溶液。 3.其它：接种环、酒精灯、载玻片，玻片夹等。 3.其它：接种环、酒精灯、载玻片，玻片夹等。 其它
二、内毒素的检测技术 鲎试验） （鲎试验）
1.内毒素检测方法 1.内毒素检测方法 家兔发热法，鲎试验。 家兔发热法，鲎试验。
实训二 微生物实验常用灭菌和消毒方法
实训二微生物实验常用灭菌和消毒方法一、实验目的1、学习微生物实验常用灭菌消毒方法；2、掌握高压蒸汽灭菌法、干热灭菌法等常用灭菌方法；3、熟悉灭菌消毒过程中的注意事项。
二、实验原理消毒是指杀灭或清除传播媒介上病原微生物，但不一定杀灭芽孢，使其达到无害化的处理。
灭菌是指杀灭或清除传播媒介上所有微生物，包括芽孢。
灭菌方法通常分为：（1）加热灭菌；（2）过滤除菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。
以下介绍几种微生物实验常用灭菌消毒方法。
（一）干热灭菌干热灭菌是指利用干热空气杀灭微生物，一般在电烘箱中进行。
由于蛋白质在干燥无水的情况下不容易凝固，干热灭菌所需温度较湿热灭菌高，时间也较湿热灭菌长。
一般须在140℃左右保持恒温3-4h，方能达到灭菌的目的。
干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌，凡带有橡胶的物品和培养基，都不能进行干热灭菌。
烘箱内装入物品应留有空隙，以利于空气流动，否则箱内受热不均，部分物品灭菌不彻底。
（二）高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌是一种湿热灭菌方法，是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待锅内冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热。
由于此时水蒸气无法排出，增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。
高压蒸汽是最有效的灭菌法，能迅速地达到完全彻底灭菌的效果。
一般在121℃灭菌15-30min，所有微生物包括芽孢在内都可杀死。
在同一温度下，湿热杀菌效果比干热好，因为微生物细胞蛋白质在湿热情况下更易凝固。
高压蒸汽灭菌锅有立式和卧式两种。
各种微生物的营养体在100℃温度下半小时即可被杀死，而其芽孢和孢子在这种条件下却不会失去生活力。
间歇灭菌就是根据这一原理进行的。
间歇灭菌是保持100℃，30min杀死培养基内杂菌的营养体，然后将含有芽胞和孢子的培养基在温箱内或室温放置24h，使芽孢和孢子萌发为营养体，再用100℃处理30min，再放置24h。
实验二细菌的观察
细菌一般形态染色观察一、实验目的学习了解微生物染色的基本原理与方法学习掌握细菌的简单染色和革兰氏鉴别染色技术巩固显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理细菌的个体极微小，无色透明，必须借助于染色法，使细菌（或背景）着色，与背景（或菌体）形成明显的对比便于在显微镜下观察细菌的形态构造。
染色方法主要有：见下图简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用染料有：碱性染料：结晶紫、碱性复红、龙胆紫、番红、中性红、孔雀绿等。
酸性染料：酸性复红、刚果红、曙红等简单染色一般常用碱性染料进行染色原因：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色细菌细胞壁含有蛋白质或多肽，也就有等电点已知细菌的等电点pH为2～5。
革兰氏阳性菌为2～3，革兰氏阴性菌为4～5。
当细菌的培养液pH值大于等电点时，细菌带有负电荷；反之，带有正电荷。
一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性（7～7.5）、中性、偏酸性（6～7）条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷革兰氏染色革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌对这种染色反应的不同，可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类，其机理是由于细菌细胞壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。
革兰氏染色对于细菌的分类、鉴定及食品卫生检测都有重要意义。
革兰氏染色原理影响革兰氏染色结果的因素菌龄培养基pH值染色技术：涂片质量、染色时间、脱色时间、染色脱色均匀度等三、实验器材1. 器材：显微镜，擦镜纸，二甲苯，香柏油，载玻片，接种环，酒精灯,火柴，吸水纸，无菌牙签。
2. 染色液及试剂：石碳酸复红染液、碱性美蓝染液、结晶紫染色液，路戈氏碘液，95％的酒精，蕃红染色液，黑色素水溶液，蒸馏水。
3. 菌种：白葡萄球菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种各1支。
四、操作步骤（一）简单染色涂片火焰固定染色水洗干燥镜检（二）革兰氏染色涂片→干燥→火焰固定结晶紫染色→水洗碘液媒染95%酒精脱色→水洗蕃红复染→水洗干燥镜检（三）口腔中微生物观察负染色五、实验报告1、实验结果绘图2、思考题（1）细菌制片过程应注意哪些？（2）试分析菌龄、培养pH、染色技术对革兰氏染色结果的影响。
2.1 微生物的实验室培养(2)
B.在皿底上标记日期等方便
C.正着放臵容易破碎
D.防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
解析 平板倒臵主要是防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
是平板划线法和稀释涂布
平板法。下列有关这两种方法的叙述错误的是( B )
1
2
3
4
A.均将大肠杆菌接种在固体培养基的表面
孢子繁殖形成，这种菌落才符合要求。
解析答案
1
2
3
4
4.右表是从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。请回答下面的问题。
(1) 培养基的类型很多，但培养基中一
般都含有水、碳源、 氮源 和无机盐。
上述培养基配方中能充当碳源的成分
试剂
用量
试剂
用量
牛肉膏/g
蛋白胨/g
5
10
琼脂/g —
20 —
是 牛肉膏和蛋白胨 。培养基配制完成
答案
应用示例
2.右图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法操作结果。 下列叙述中，错误的是( 后才能取菌液 )
A.甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却 B.对于浓度较高的菌液，如果甲中的
稀释倍数仅为102，则所得的菌落不
是由单一的细胞或孢子繁殖而成
C.乙中培养皿中所得的菌落都符合要求
D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
环境微生物学-实验二 微生物的染色
实验二微生物染色一、实验目的1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法；2、学习用压滴法制作标本片；3、学习微生物染色的原理；4、学习微生物涂片、染色的基本技术。
二、实验仪器和材料显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯；美蓝染液，草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液；酵母菌、大肠杆菌、枯草杆菌。
三、染色原理微生物（尤其是细菌）的机体小且是无色透明的，在活体细菌内又含有大量的水分。
因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。
当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有明显的明暗差，难以看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。
通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，在显微镜下观察。
微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其它化合物组成的，所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。
两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性，带正电；在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性，带负电。
经测定，细菌的等电点pI在pH=2~5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH > 7）或偏酸性（pH=6~7）溶液中，细菌等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的居多。
碱性染料并不是碱而是一种盐，电解时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合，而使细菌着色。
碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红（沙黄）等。
微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。
四、染色方法1、简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
常用的简单染色染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红（沙黄）等。
2、革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阴性细菌（G－）和革兰氏阳性细菌（G+）。