兽医生物制品学_第七章___实验动物、动物实验的基本技术方法
兽医生物制品生产的基本技术
兽医生物制品生产的基本技术【知识目标】·熟悉① 兽医生物制品菌(毒)种的概念及保存；② 病毒增殖方法；③ 实验动物的分类及特点； ④ 实验动物的概念； ⑤ 实验动物的正确选择。
·理解 ① 细菌的生长繁殖规律； ② 病毒的组织细胞培养。
·掌握① 细菌培养方法及培养基的制备；② 禽胚培养技术；③ 掌握实验动物的捕捉、保定和采血技术。
·了解① 兽医生物制品菌种、毒种的分类及选育与鉴定；② 细菌生长繁殖的营养要求；③ 实验动物的繁育与生产管理。
【能力目标】·能进行细菌培养、禽胚培养等操作；·能应用动物实验技术。
第一节 菌种与毒种选育技术一、菌(毒)种的概念与分类菌(毒)种是国家的重要生物资源，世界各国对这项资源都极为重视，并设置各种专业性保藏机构，现在不少国家的菌种与毒种中心都采用计算机进行管理。
我国于1980年成立了兽医微生物菌种保藏管理中心，设在中国兽药监察所(简称中监所)，专门从事兽医微生物菌种的收集、保藏、管理、交流和供应。
(一)、菌(毒)种的概念兽医生物制品的菌种与毒种是指应用于兽医生物制品生产、检定和研究的细菌菌种、病毒毒种以及分类地位在原虫以下的生物种，主要指兽医生物制品生产、检定用的菌种与毒种。
(二)、菌(毒)种的分类兽医生物制品用的菌(毒)种，按其存兽医生物制品生产、检定过程中的用途可分为四类：1．生产用的菌(毒)种(1) 直接生产用的菌(毒)种生物秀—专心做生物！ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ易生物－领先的生物医药商务平台ｗｗｗ．ｅｂｉｏｅ．ｃｏｍ生物秀论坛－学术交流，资源共享，互助社区ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ／ｂｂｓ／直接用本微生物或其产物制备疫苗、类毒素、诊断抗原等生物制品，参与制品的加工与处理，如制备新城疫油佐剂火活疫苗的新城疫病毒，制造破伤风类毒素的破伤风棱菌，生产鸡白痢全血玻板凝集抗原的鸡白痢沙门氏菌等。
(2) 免疫用的菌(毒)种主要用于生产免疫血清和诊断血清，如制备小鹅瘟免疫血清的小鹅瘟病毒，制备炭疽沉淀素的炭疽杆菌。
兽医生物制品学.doc
兽医生物制品学.doc兽医生物制品学：是以防备兽医学和生物工程学理论为根底，研讨动物流行症和寄生虫病的免疫防备、确诊和医治用生物行制品的制造理论和技能、出产工艺、制质量量查验与操控及保藏和运用办法，以增强动物机体特异性和非特异性免疫力，及时精确确诊动物疫病，并给予特异性医治，避免疫病传达的综合性运用学科。
兽医生物制品：是依据免疫学原理，运用微生物、寄生虫及其代谢产品或免疫应答产品制备的一类物质，专供相应的疫病确诊、医治或防备之用。
疫苗：凡接种动物后能发生主动免疫和防备疾病的一类生物制剂均称为疫苗，包含细菌性疫苗、病毒性疫苗和寄生虫行疫苗。
兽医生物制品学的运用：免疫防备；确诊；医治生物制品安性质分类：疫苗、类毒素、确诊制品、抗病血清、微生物制剂、副免疫制品。
疫苗安抗原的性质和制备工艺分为：活疫苗、死疫苗、基因疫苗活疫苗与死疫苗的优缺点比较：活疫苗能够在免疫动物体内繁衍，能影响机体发生全面的系统免疫反响和部分免疫反响；免疫力耐久，有利于铲除部分野毒；产值高，出产成本低。
可是该类疫苗残毒在天然界动物群体内持续传递后有毒力增强和返祖风险；有不同抗原的搅扰现象；要求在低温、冷暗的条件下运送和贮存。
死疫苗不能在免疫动物体内繁衍，比较安全，不发生全身性副效果，无毒力返祖现象；有利于多价或多联等混合疫苗；制备安稳，受外界环境影响小，有利于保存和运送。
但该类疫苗出产成本高，需屡次免疫。
并且一般只能诱导机体发生体液免疫和免疫回忆，故常需用佐剂或带着系统来增强其免疫效果。
灭活：指损坏微生物的生物学活性、繁衍才能和致病性，但尽可能不影响其免疫原性。
或指损坏确诊血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对确诊试验的干扰效果。
用于灭活微生物的化学试剂或药物。
微生物致弱：是指经过各种办法使病原微生物的致病性下降或丢失，但其它生物学活性以及免疫原性并未发生实质性改动。
灭活剂：用于灭活微生物的化学试剂或药物灭活剂的品种：1.甲醛溶液2.常用烷化剂：3.苯酚：4.结晶紫甲基青莲甲紫5.β-丙酰内酯影响灭活效果的要素（1）灭活剂特异性（2）微生物品种与特性（3）灭活剂浓度（4）灭活剂温度（5）灭活时刻（灭活时刻与灭活剂浓度和效果温度密切相关）（6）酸碱度（在微酸性时灭活速度慢，抗原性坚持较好；碱性时灭活速度快，担抗原性易受损坏（ 7）有机物存在。
兽医生物制品学ppt课件
巢式PCR示意图
3.反向PCR(IPCR):
反向PCR用于扩增已 知序列两端的未知 DNA片段，因此一对 引物与常规PCR一样 与已知序列互补但是 方向却是相反的。 IPCR步骤主要包括酶 切、自身连接还化、 扩增和序列分析。
四、聚合酶链反应（PCR）
PCR技术是DNA体外扩增技术，以单链DNA为模 板，在DNA聚合酶的作用下引物沿5‘→3’方向不断延 伸，利用4种dNTP合成新的互补DNA链，然后在高 温下变性为单链，再在低温下使引物DNA片段与其复 性，并在DNA聚合酶的作用下开始新一轮DNA合成。 经如此反复循环（变性－退火－延伸）30~60次左右 就可在短时间内将目的DNA扩增数百万倍。PCR技术 为疾病诊断提供了简便、快速、特异、敏感的检测手 段，适于检测不宜分离培养或含量极微的样品中病原 体特定基因片段的有无，或分析不同样品中此片段的 异同。 为了检测RNA样品可以先进行反转录，然后进行 PCR扩增DNA，这就是RNA的反转录－聚合酶链反应 （RT－PCR）。PCR与酶切图谱分析和分子杂交技术
免疫标记法
抗杂交体标记法：在杂交过程中作为探针的核酸 与其互补的核酸能形成杂交体，杂交体本身具有 一定抗原性，因而可用抗杂交体的抗体并结合带 标记的第二抗体对杂交体进行检测 半抗原标记法：通过对已知核酸片段做一定的修 饰，在探针的某些部位连接半抗原，探针通互补 核酸片段 杂交后，与半抗原的特异性抗体结合， 再通过结合带标记的第二抗体对形成的杂交体进 行检测。
斑点杂交
1、原理及步骤：提取病毒、细菌、Cell DNA ↓ 点样品至膜、干燥、固定 ↓ 探针、DNA变性、杂交 ↓ 洗膜、放射自显影 2、应用： ↓ 1）混合样品DNA 结果分析
兽医生物制品学大纲2010新
《兽医生物制品学》课程教学大纲（Veterinary Biologicals）课程编号：学分： 2学时：36（其中：26实验时10上机学时0）先修课程：兽医微生物学、兽医免疫学、兽医病理学、兽医传染病学等适用专业：动物医学开课部门：生物与食品工程学院一、课程的性质与目标本课程属于动物医学专业方向限选课，通过学习本课程，要求学生掌握各类生物制品的特性和用途，掌握各类生物制品的基本制造理论、生产工艺流程等，了解生物制品的制造新技术和国家对生物制品研究、生产及使用中质量管理与控制的有关政策。
为从事动物医学专业领域或生物制品制造与销售行业工作打下坚实的理论基础。
二、课程的主要内容及基本要求第一章绪论（2学时）[知识点]1.生物制品学的概念与应用；2.兽医生物制品学的概述；3.我国兽医生物制品发展的历史与成就；4.兽医生物制品学的发展方向与前景。
[重点]生物制品学的概念与应用。
[难点]兽医生物制品学的发展方向与前景。
[基本要求]1.掌握兽用生物制品的概念、分类、应用；2.了解兽用生物制品的命名原则、兽医生物制品发展的方向。
[实践与练习]1.基本概念：生物制品、疫苗、活疫苗与灭活疫苗、重组活疫苗、基因工程活载体疫苗、亚单位疫苗、基因工程亚单位疫苗。
2.兽医生物制品有什么作用？有哪些种类？3.简述生物制品的命名原则。
第二章灭活剂、保护剂与免疫佐剂（4学时）[知识点]1.灭活剂；2.保护剂；3.免疫佐剂；4.新型免疫佐剂。
[重点]灭活剂、免疫佐剂。
[难点]新型免疫佐剂。
[基本要求]1.掌握灭活剂、佐剂、保护剂的概念、影响灭活剂作用的因素；2.理解灭活剂、佐剂、保护剂在兽用生物制品生产中的作用。
[实践与练习]1.基本概念：灭活、灭活剂、保护剂、免疫佐剂、冻干。
2.灭活剂的灭活机理和方法？灭活作用的影响因素有哪些？3.简述生物制品冻干保护剂的组成及其作用。
4.何谓佐剂？免疫佐剂有哪些种类？佐剂加强免疫反应的机理是什么。
5 第四章 兽医生物制品生产的基本技术
2．通过物理途径选育
热和干燥等物理因素可干扰DNA的复制， 从而引起突变，导致遗传性状的改变。 如，巴斯德在1881年即将炭疽强毒菌株在 42.5℃高温下长期传代培养，导致菌的遗传性 状变异，从而育成了炭疽弱毒菌株作为制造用 菌种。1885年巴斯德又将含有狂犬病病毒的脑 脊髓置于干燥条件中处理，制成弱毒疫苗。 日本乙型脑炎病毒强毒株则经紫外线照射后 引起突变，从而出现遗传性状分离，再进行蚀 斑挑选，育成了弱毒株，用于制造疫苗。
选择
由于微生物变异的方向难以预测，所以只能在培育过 程中对各个表现遗传性状的群体按照需要进行选择，以求 筛选出目的变异株。首先从外表观察和检查开始，然后再 作系统的检测筛选。初选依据包括： ①细菌菌落特征的变异，如菌落大小、形状、色泽、粗糙 或光滑和荧光等； ②病毒蚀斑的变异； ③对温度敏感性变异； ④对药物敏感性变异； ⑤对营养要求变异，如对氨基酸的特殊需要； ⑥对宿主动物易感性变异。
（3）杂交减毒：
将两种遗传性状不同的菌（毒）株，在 传代培育中进行自然杂交，以导致不同菌 （毒）株间基因发生交换而育成有使用价值 的弱毒株。 如流行性感冒弱毒株的育成，是将温度 敏感弱毒株（抗原性较低）与流行强毒株进 行混合培养传代，使两者毒力基因发生交换， 其后代即成为毒力低和抗原性强的毒株，再 用于制造弱毒疫苗。
第四章 兽医生物制品生产
的基本技术
第一节 菌种与毒种选育技术
生产用菌种和毒种是兽医生物制品生产的关键， 也是生物制品质量的直接保证。 由于生物制品用途的不同，所选择的菌种和 毒种也各异，有的致病力强、抗原性好的，有的则 要求致病力弱或仅有感染性而无病害性，免疫原性 高的菌（毒）种。 菌种和毒种筛选的基本原则是：根据所生产的 制品的用途、使用方法、使用方式、生产过程和条 件等因素，从细菌和病毒的安全性、免疫原性、遗 传稳定性及生产实用性等方面，进行评价和筛选。
医学实验动物学实验
用右手抓住兔颈背部皮肤，轻轻提起，然后 用左手托住兔臀部或后肢进行抓取。
实验动物编号与标记方法
01
02
03
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染色法
使用化学药品涂染动物身体的 不同部位，根据颜色进行编号
与标记。
耳标法
在动物耳朵上打孔或挂上标签 ，根据不同位置或标签进行编
号与标记。
烙印法
使用烙印机在动物身体表面烙 印数字或字母，进行编号与标
环保要求
实验室应遵守国家和地方环保法规，确保废水、废气等排 放符合相关标准，减少对环境的污染。
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02 03
实验动物法规
各国都制定了相应的实验动物法规，对实验动物的饲养、使用和管理等 方面进行规范。例如，我国制定了《实验动物管理条例》等法规，以保 障实验动物的福利和权益。
实验动物伦理审查
在进行涉及实验动物的医学研究前，需要经过伦理审查委员会的审查和 批准。该委员会会对实验的必要性、合理性、动物福利等方面进行综合 考虑和评估。
04 医学实验动物模型建立与 应用
疾病模型建立方法举例
1 2
诱发性动物模型
通过物理、化学或生物等致病因素作用于实验动 物，诱发其产生与人类疾病相似的症状或病理改 变。
感染性动物模型
选用人类疾病的致病微生物感染实验动物，建立 与人类疾病相似的感染性动物模型。
3
转基因或基因敲除动物模型
通过基因工程技术，将外源基因导入实验动物基 因组或敲除某个特定基因，建立与人类遗传性疾 病相似的动物模型。
结果解释
对统计结果进行解释，评估实验结果 的统计学意义和生物学意义。
结果展示及论文撰写技巧
结果展示
兽医生物制品学.doc
兽医生物制品学：是以预防兽医学和生物工程学理论为基础，研究动物传染病和寄生虫病的免疫预防、诊断和治疗用生物行制品的制造理论和技术、生产工艺、制品质量检验与控制及保藏和使用方法，以增强动物机体特异性和非特异性免疫力，及时准确诊断动物疫病，并给予特异性治疗，防止疫病传播的综合性应用学科。
兽医生物制品：是根据免疫学原理，利用微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质，专供相应的疫病诊断、治疗或预防之用。
疫苗：凡接种动物后能产生自动免疫和预防疾病的一类生物制剂均称为疫苗，包含细菌性疫苗、病毒性疫苗和寄生虫行疫苗。
兽医生物制品学的应用：免疫预防；诊断；治疗生物制品安性质分类：疫苗、类毒素、诊断制品、抗病血清、微生物制剂、副免疫制品。
疫苗安抗原的性质和制备工艺分为：活疫苗、死疫苗、基因疫苗活疫苗与死疫苗的优缺点比较：活疫苗可以在免疫动物体内繁殖，能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应；免疫力持久，有利于清除局部野毒；产量高，生产成本低。
但是该类疫苗残毒在自然界动物群体内持续传递后有毒力增强和返祖危险；有不同抗原的干扰现象；要求在低温、冷暗的条件下运输和储存。
死疫苗不能在免疫动物体内繁殖，比较安全，不发生全身性副作用，无毒力返祖现象；有利于多价或多联等混合疫苗；制备稳定，受外界环境影响小，有利于保存和运输。
但该类疫苗生产成本高，需多次免疫。
而且一般只能诱导机体产生体液免疫和免疫记忆，故常需用佐剂或携带系统来增强其免疫效果。
灭活：指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性。
或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。
用于灭活微生物的化学试剂或药物。
微生物致弱：是指通过各种方法使病原微生物的致病性降低或丧失，但其它生物学活性以及免疫原性并未发生本质性改变。
灭活剂：用于灭活微生物的化学试剂或药物灭活剂的种类：1.甲醛溶液2.常用烷化剂：3.苯酚：4.结晶紫甲基青莲甲紫5.β-丙酰内酯影响灭活作用的因素（1）灭活剂特异性（2）微生物种类与特性（3）灭活剂浓度（4）灭活剂温度（5）灭活时间（灭活时间与灭活剂浓度和作用温度密切相关）（6）酸碱度（在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好；碱性时灭活速度快，担抗原性易受破坏（7）有机物存在。
动物实验基础知识
2.
a. b. c. d. e.
屏障环境
空气必须经初、中、高效过滤器进入动物饲养室或实验室。 利用空调送风系统形成清洁走廊、动物饲养间、非清洁走廊、室外的静压差梯度，各 梯度差不低于20Pa。 空气、人流、物流均采用单向流通路线。 人流、物流分开，所有物品应采用严格灭菌控制。 空气洁净度为10000级。
3、 气流与风速
气流速度控制在0.1~0.2m/s，换气次数10~20次/小时 风速是除了温度、湿度以外与体热发散有关的环境因素。
1)
实验动物单位体重的体表面积比人大，气流对实验动物的影响也较大。
2)
3) 4)
气流速度过小，空气流通不良，有害气体浓度升高，散热困难，易造 成呼吸道疾病的传播。
气流速度过大，动物体表散热量增加，同样危及动物的健康，影响动 物实验结果。 合理的气流组织和风速能调节温度和湿度，有效降低室内粉尘和有害 气体，控制传染病的流行，有利于实验动物和工作人员的健康。
4、杂交一代动物（F1）
杂交一代动物（F1）：两个不同近交系杂交所生的第一代动物称为杂交一 代动物或F1代。 不是一个品系或品种，不具有育种能力，不能自群繁殖成与杂交F1代相 同基因型动物，需进一步交配得到F2出现遗传分离基因重组，个体间的 一致性也随之消失。
特点： a.个体间遗传均一：个体间遗传变异与近交系一样很小，其基因位点均 为杂合型（近交系为纯合型），因此能取得一致的实验结果。 b.表现双亲的显性性状 c.环境适应性强 d.具有杂种优势，如体质健壮、生长快、易于饲养管理、发育均匀、手 术后恢复快等优点。 小鼠F1代如： Nga：(C57BL/6×DBA/2)F1、LAF1：(C57BL/J×A/HJ)F1等。
3、突变系
突变系：育种过程中，出于单个基因的突变，或将某个基因导入， 或通 过多次回交“留种”，而建立一个同类突变品系（mutational strain）， 扩大数量，定向培育而成。可以以基因符号来表示基因型，或能保持特 定遗传性状的品系动物。 此类个体具有同样遗传缺陷或病态，如肥胖症、侏儒症、肌萎缩、白内 障、视网膜退化、无毛等等，现己培养成的自然具有某些病的 突变系有： 白血病鼠、糖尿病鼠、肿瘤鼠、贫血鼠、高血压鼠和裸鼠(无胸腺无毛) 等等，这些品系的动物对于研究相应疾病的防治具有很重要的价值。