实验中细胞铺板的方法
Polybrene(聚凝胺)具体使用方法及步骤
Polybrene（聚凝胺）具体使用方法及步骤
Polybrene（聚凝胺）是一类高价离子季铵盐多聚物，溶解后带正电，与细胞表面的阴离子结合，能显著提高逆转录病毒对细胞的感染效率。
一般能提高感染效率2-10 倍。
Polybrene 目前广泛用于逆转录病毒介导的哺乳动物细胞转染。
但Polybrene 对某些细胞也是存在毒性的，因此，使用之前要先对细胞进行测试。
另外Polybrene 也用于蛋白测序，小剂量的Polybrene 在自动测序分析中可明显改善多肽的降解现象。
PVDF 膜加入Polybrene 还能提高膜的亲和性。
1. 储存液（5µg/µl）
2. 实验步骤（24 孔板为例）
1)第一天按实验需要将细胞铺板。
细胞数以第2 天密度约50%为宜。
37℃
培养过夜；
2)侵染前，从-80℃冰箱取出病毒后冰浴融化，根据预实验得到的MOI 值
用新鲜完全培养基将病毒稀释成所需浓度，轻轻混匀；
3)吸去细胞原有培养基，将按照MOI 稀释好的病毒液+ Polybrene（建
议终浓度5μg/ml，）加入细胞中，轻轻混匀。
37℃培养过夜。
（建议范
围：终浓度2-10μg/ml）；
4)感染24 小时后，吸除含病毒的培养基，换为新鲜的培养基；
5)继续培养72-96 小时后，收集细胞检测目的蛋白的表达。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
细胞迁移侵袭实验操作步骤（Transwell）
细胞迁移侵袭实验操作步骤（Transwell）迁移实验（cell migration assay ）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1 材料准备：可拍照显微镜，Tran swell小室，孔径8 ^m ,没包被胶的（Coster和Corni ng公司的也较常用），Transwell 迁移实验的细胞培养板24 孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell 小室相配套，BD 公司的Matrigel ，无血清DMEM ，（1% 胎牛血清）DMEM 和1640 培养基，DMEM 完全培养基，1640 完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS ，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS 结晶紫）2 步骤和流程2.1 基质胶铺板：用BD 公司的Matrigel 1 ：8 （根据细胞产生mmp 的量来决定）稀释，包被Transwell 小室底部膜的上室面，置37 °C 30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2 制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 －24h ，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1 —2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5X105/ml。
2.3 接种细胞①取细胞悬液100卩1加入Tran swell小室。
②24孔板下室一般加入600 ^l含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
药物MTT实验步骤(贴壁细胞)
药物MTT实验步骤(贴壁细胞)----个人改进版 by sssholy （2012-10-22） 1. 边缘孔用无菌PBS充填。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为50000个/ml，每孔加入100ul细胞悬液(每孔5000个细胞)。
注：⑴每次加入细胞都使枪头贴着孔底边缘(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。孔加入顺序：可从上到下，从左到右依次加入。
⑵为了保证细胞密度均匀，最好每加3-5列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。
⑶每块96孔板加完细胞后，应拿起板子前后左右水平摇晃几下（勿旋转摇晃），使细胞均匀分散。
⑷一般设6个复孔（B-G行），对照孔非常重要，且变异大，故设2列（2，3列为对照孔），4-10或4-11列为给药孔。
⑸边缘孔用无菌PBS充填， 2-11列均可加入细胞。因为要设置调零孔（即不加细胞孔），所以可将第11列设为调零孔，也可将第12列的无菌PBS孔在第2天加药时改为调零孔。
2. 细胞放入培养箱培养，待贴壁后第二天给药（通常前一天下午或晚上铺板，第2天上午给药）。给药方法：先配好药（用EP管配好药），再拿出96孔板，弃去原有培养液（可不用PBS洗，太麻烦了），加入药物。
注：⑴MTT加药时都是先配药再弃去原培养液，最后加入药物。切勿先弃去原有培养液再配药，因为配药一般要花较长时间，若先弃去培养液再配药会导致细胞无营养液体而死亡。
⑵药物是用母液溶于无血清培养基配成工作液，事先算好对照孔，药物孔，调零孔如何配制，如何设置加药顺序。一般越靠中央的孔变异越小，故最重要的给药孔一般放在最中间，次要孔放边缘，调零孔可用第11或12列。
⑶如果某个给药孔需加入2种药物，一般需要一种药物先预处理1-2h（预处理药物可用Ep管配好后再分别加入各孔），1-2h再加入另一种药物（直接加入各孔）。
3.细胞放入培养箱培养24h（或其他指定时间）。 4. 药物作用结束后，每孔加入20ul---MTT(5mg/ml)，培养3-4h。若药物能与MTT反应，可先弃去原培养液，再加入含MTT的培养液（无血清培养液：MTT=5：1配制）。
细胞粘附实验流程
细胞粘附实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在开展细胞粘附实验之前，要进行充分的准备工作。
CCK8实验
CCK-8实验实验原理CCK8全称Cell Counting Kit-8试剂，可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
该试剂主要用途有：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验实验步骤实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：将需要测量的细胞收集后离心，并使用新鲜配液重悬、计数；2、接种到96孔板中根据合适的铺板细胞数，每孔约100 μl细胞悬液，同样的样本最好做3个及以上复孔；3、37℃培养箱中培养将接种好的细胞放入细胞37℃培养箱中培养2-4小时使细胞贴壁，如果细胞为悬浮细胞，则这一步可以省去。
4、加入10 μl CCK8每孔加入10 μl的CCK8试剂，由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
或者直接配置含10% CCK8的培养基，以换液的形式加入。
5、培养1-4小时细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。
如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。
特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
6、测定450 nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490 nm，参比波长600-650 nm。
实验二：细胞毒性分析1、制备细胞悬液将需要测量的细胞收集后离心，并使用新鲜配液重悬、计数；2、接种到96孔板中根据合适的铺板细胞数，每孔约100 μl细胞悬液，同样的样本最好做3个及以上复孔；3、37℃培养箱中培养将接种好的细胞放入细胞37℃培养箱中培养2-4小时使细胞贴壁，如果细胞为悬浮细胞，则这一步可以省去。
慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装【2 】试验的要点：1：优越的293FT细胞状况是转染成功的重要身分,细胞代数不宜超过30代;2：细胞铺板需平均,避免细胞成团,影响转染效力;尽量多的细胞转入质粒,产生的病毒就越多;3：细胞换液和共转染时,动作要轻柔避免细胞沉没.尽量少的细胞逝世亡,产生的病毒就越多;试验前要预备的试剂.耗材和仪器;试剂预备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完整造就基 ,0.25%胰酶,PBS,TRL转染试剂,包装质粒,目标质粒,无血清造就基.耗材预备：10cm细胞造就皿,6孔细胞造就板,吸头规格1ml.200ul.10ul,10ml移液管,离心管规格15ml.5ml.1.5ml,0.22um PVDF滤膜和10ml无菌打针器,试管架.仪器预备：倒置荧鲜明微镜,通俗光学倒置显微镜,电动移液器,吸引器,移液枪,二级生物安全柜,二氧化碳细胞造就箱.第一天：上午（病毒包装质粒共转染前,293FT细胞苏醒后至少让其传代两次以上,293FT 细胞能成倍的增加,肯定细胞状况好）;试验前预备：安全柜开紫外灯照30分钟;把造就基和试剂放置常温;消化细胞：从37 5%的co2细胞造就箱拿出细胞状况优越的293FT细胞,吸出原造就基,参加PBS 1ml略洗之后吸出,参加1ml胰酶消化1-2min,轻轻拍打造就皿,再参加3ml新颖造就基终止消化,将造就皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液,参加10ml PBS吹打混匀后,离心1000r /5min, 吸出上清液.细胞铺板：在10cm细胞造就皿上标记细胞名称.细胞代数.时光和操作人,将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管,再参加完整造就基至10ml充分混匀,然后把混匀的293FT细胞移入10cm造就皿）.放置造就箱中造就48h.插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后,从造就箱掏出293FT细胞,倒置显微镜不雅察,细胞密度达90%阁下; 吸出原有造就基,沿皿壁迟缓参加8ml完整造就基,放置于造就箱中,待转染. 掏出2个1.5ml的离心管,一份参加142ul的无血清造就基和58ulTRL转染试剂,吹打混匀.另一份参加包装质粒18ul.目标质粒10ul和无血清造就基总体积200ul充分混匀.将2个离心管液体吹打混匀,室温静置20分钟20分钟后,掏出造就箱中的293FT细胞,将混杂液用200ul的小枪头轻轻滴入造就皿中,避免细胞在转染进程中漂起来,然后轻轻十字混匀,放置于造就箱中造就8h.细胞造就8h后,吸出原造就基,沿皿壁迟缓参加10ml完整造就基,放入造就箱中持续造就.第四天转染24h后掏出293FT细胞,倒置荧鲜明微镜不雅察转染后果第五天转染48h后;预备好1.5ml离心管,10ml无菌打针器和0.22umPVDF滤膜;收集48h后的病毒上清;第六天转染72h后,收集72h后病毒上清.慢病毒包装完成后若何用慢病毒沾染目标细胞步骤一:沾染前一天用6孔板铺板,每孔铺5×10^5个293FT细胞,放置于造就箱中造就24h.步骤二：预备3个离心管分离参加1ml.500ul.200ul的病毒液,再依次参加1ml的完整造就基和Polybrene吹打混匀（ Polybrene终浓度为8ug/ml）.步骤三：从造就箱中掏出6孔板造就的293FT细胞,吸出原有造就基,再依次参加3个离心管中的混杂液,混匀后放入造就箱中造就24h.步骤四：24h后吸出含病毒的造就基,参加1ml完整造就基,造就箱中造就48h.步骤五：48h后,带有绿色荧光蛋白标签的病毒,经由过程倒置荧鲜明微镜不雅察沾染效力.步骤六：带Puromycin基因筛选标记的病毒,换上终浓度为1ug/ml的Puromycin的造就基,筛选稳固转导的细胞株(两至三天换一次液).72h不雅察96h不雅察。
细胞划痕实验技巧
技巧：1⃣️ 在用DPBS清洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。
2⃣️ 划痕实验为无血清或低血清(<2%)培养，否则细胞增殖不能忽略。
（无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会较慢）3⃣️ 划痕按6孔板背后划线的垂直方向，形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。
4⃣️ 划痕实验铺细胞最好使用6 孔板，以保证有相当距离的平直划痕。
5⃣️ 划痕实验适用的细胞范围较小，一般只适用于上皮细胞，纤维样细胞。
细胞划痕实验（wound healing）是简捷测定细胞迁移运动和修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养平板的单层贴壁细胞上，用微量枪头在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察周边细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。
准备：细胞基础培养基、无菌DPBS、灭菌枪头、直尺、移液枪、maker笔（操作前超净台内紫外照射30min）操作步骤：1⃣️培养板划线：首先使用marker 笔在6 孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm 一道，横穿过孔。
每孔至少穿过5 条线。
划线时注意线不要太粗。
2⃣️细胞铺板：根据细胞体积大小和生长速度调整细胞数目，接种原则为过夜后细胞融合率达到100%。
细胞划线：24h细胞贴壁后用100ul枪头，抵着直尺垂直于细胞平面，垂直于平板背面的线在细胞层上进行划痕。
3⃣️细胞清洗：划痕完成后，使用无菌DPBS洗细胞3次，洗去不贴壁的细胞，即划线时划去的细胞，使划线后留下的间隙清晰可见，然后更换新鲜无血清培养基。
4⃣️细胞培养、观察：37℃5%CO2培养箱培养。
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于侵袭、迁移等试验的细胞计数及铺板
[实验步骤]
1、准备工作用
75% 的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台。
2）将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。
2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。
贴壁加入5mlPBS液清洗一遍，四个方向晃动倒掉。
3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿，上下左右铺匀，37°消化30分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全.
4、加入4ml的含5%血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。
1000rpm,3min.
5、弃上清。
用PBS 3ml 洗细胞，吹打或涡旋混匀，洗2次，离心1000rpm,3min.弃上清。
6、配细胞稀释液（BSA 终浓度为0.1%）每种细胞需3ml稀释液,共6个样品，所以配20ml稀释液(无血培20ml+10%BSA 200ul.)
7、细胞沉淀中加3ml细胞稀释液，吹打混匀，即得稀释过的细胞悬液。
8、细胞计数板每孔加15ul悬液。
每个样品计数2次，算均值。
（8个大格总数/8=数值*104）
9、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用细胞稀释液补。
普通的细胞计数及铺板(免疫荧光，WB等不需定量)
[实验步骤]
1、准备工作用75% 的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台。
2）将
培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显
微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。
2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。
贴壁加入5mlPBS液清洗一遍，四个方向晃动倒掉。
3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿，上下左右铺匀，37°消化30分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全.
4、加入4ml的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。
1000rpm,3min.若细胞较多，则需稀释。
5、取上述1ml细胞悬液，在加1ml含血清的新鲜培养基，混匀。
6、细胞计数板每孔加15ul悬液。
每个样品对角线计数2次，算均值。
7
、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用含血清的新鲜
培养基补。
注意：
1.不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形，不规则，失去原有的特点。
2.是否污染：传代或换液24-48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。
如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。
污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞。
3.皿用20天左右，可更换。
4.分清无血培、血培的用途。
二、Transwell检测肿瘤细胞迁移实验
1.在板孔（下室）中加入600 ul/well含有10%血清培养基作为引诱剂，小室底部接触培养基。
2.轻轻的在细胞小室的上层加入140ul /well细胞悬液(若细胞密度为5 x 105 cell/ml，则上室中共加入5 x 105 cell/ml x140ul=7 x 104cell)。
37 °C孵育24小时（孵育时间根据实验调整，12-36小时）
3.孵育结束，小心取出细胞小室，用棉签轻轻擦去上室液体。
移到预先加入800 ul /well4%多聚甲醛或70%甲醇的下室中，室温固定30分钟。
4.小心取出细胞小室，用吸干上室固定液。
（可4°保存，隔日再做。
）800 ul/ wellPBS加入下室洗3次。
室温晾干。
5. 800 ul/ well0. 1%结晶紫染色30min。
6.迅速将小室浸没到ddH2O 浸泡数次，去除多余的染料。
吸去上室多余液体完全干燥小室。
7.显微镜下观察结果，随机选取3个不同的视野拍照。
8.。