菠萝蛋白酶分离方法(精)
菠萝蛋白酶纯化方法总结
菠萝蛋白酶的提取方法：（1）沉淀法沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。
用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。
以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。
酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。
从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。
（2）离子交换色谱法离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。
国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。
Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。
用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。
（3）固定化金属离子亲和色谱法固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。
此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。
Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化15.4 倍，回收率达94.6%，而且不会造成任何变性。
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶是一种有机物，也称为溶菌酶或蛋白水解酶。
它的特点是可以分解蛋白质，具有较强的酸性和碱性环境适应能力，因此，广泛应用于医疗、食品、化妆品等领域中。
从菠萝中提取菠萝蛋白酶是一项艰巨的任务。
以下是一些步骤：第一步是采集新鲜的菠萝果肉。
必须选用成熟度好的金丝菠萝果肉。
应选择外皮金黄色、果肉红黄相间的菠萝果肉。
第二步是制备浸出液。
将新鲜的菠萝果肉去皮、去核，切成小块，加入适量的水，搅拌并煮沸，经过静置、过滤，即可得到浸出液。
第三步是提取菠萝蛋白酶。
将制备好的浸出液冷藏，待其沉淀，将上层的冰冷水慢慢倒出，留下沉淀。
然后，在沉淀中加入适量的酸性酶解剂，轻轻摇晃，放置几小时。
第四步是酶活测定。
将提取的菠萝蛋白酶放在适宜的酶活测定条件下，如适宜的温度和酸碱度等，测定其活性或浓度。
以上是从菠萝中提取菠萝蛋白酶的一些步骤。
菠萝蛋白酶的应用范围广泛，可用于肉制品、啤酒、乳制品、水产品等食品中。
同时，它还能被用于医疗和化妆品领域，例如用于抗肿瘤、消炎、增加皮肤弹性等。
因此，菠萝蛋白酶的提取十分重要，细节决定了酶的纯度和活性，也影响到菠萝蛋白酶在不同领域中的应用。
菠萝蛋白酶浓缩分离设备技术工艺
菠萝蛋白酶浓缩分离设备技术工艺2020年8月26日菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎中，从菠萝的果实中提取的成为果菠萝蛋白酶，从菠萝的茎中提取的成为茎菠萝蛋白酶。
菠萝蛋白酶的分子量为33kDa，是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质、肽、酯、酰胺。
它水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高10倍以上，因此有着广泛的用途。
它作为食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还可用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。
提取菠萝蛋白酶的传统工艺有3种：有机溶剂沉淀法、单宁沉淀法和高岭土吸附法。
这三种方法虽然生产工艺简单、投资少，但是工艺周期长，菠萝汁容易变质。
而且，单宁和有机溶剂会使酶变性，产品活性不高;高岭土吸附法的生产工艺和操作都很复杂，原材料消耗量大，酶的活性和总收率较低，且高岭土的产地对吸附法有着很大的影响。
超滤法提取菠萝蛋白酶的主要工艺操作包括以下几步：压榨：将菠萝下脚料洗净，用压榨机压出汁液，加入0.05%的苯甲酸钠防腐，迅速过滤除杂质。
可采用压滤法或离心法去除杂质;超滤浓缩分离：将澄清汁液在超滤设备中浓缩分离，使体积浓缩至原体积的1/5;沉淀：将浓缩液降温至0-4℃，边搅拌边加入-20℃95%的乙醇，直至混合液中的乙醇浓度为50%，静置使酶沉淀，移出上清液，即得湿酶;干燥：将湿酶在0℃下减压干燥或冷冻真空干燥即得菠萝蛋白酶精品。
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菠萝中提取菠萝蛋白酶
四、实验器材和仪器
1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（2cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管；
五、实验操作方法法和步骤 实验操作方法法和步
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： 将菠萝切碎
加柠檬酸钠，榨汁 冻存备用
菠萝汁
5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中 应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实 验没有得到这种结果。 6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上 清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。
三、实验材料和试剂 1、实验材料 、 新鲜菠萝、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂 、 维生素c 0.1%EDTA溶液 柠檬酸钠 维生素 单宁 溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化 氯化钠溶液 酪蛋白溶液 氢氧化 钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调 磷酸缓冲液（ 磷酸缓冲液 溶解磷酸二氢钾， PH至7.0） 至 ） 激活剂（ 磷酸缓冲液， 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含 ， 磷酸缓冲液 内含15mmol/L 硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用） 现配现用） 硫代硫酸钠和 现配现用
项目一
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
微生物09301班第三实验小组 成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙
一、实验目的
1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶 2、掌握对目的蛋白酶质量的检验 3、学习酶比活力的计算
二、实验基本原理
菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶， 能 分解蛋白质、酯和酞胺。 菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄 色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不 溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55 。 本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀 法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品 中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生 酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测 得菠萝蛋白酶的活力。
从菠萝中提取菠萝蛋白酶的实训
从菠萝中提取菠萝蛋白酶的实训任务一从菠萝汁中提取菠萝蛋白酶【提取工艺】1、选取70%-80%成熟度菠萝的果皮，榨汁，用四层纱布过滤得鲜果皮汁。
2、称取1kg制备好的鲜菠萝果皮汁，加5%苯甲酸钠溶液10ml，搅拌均匀。
3、4000r/min离心7min，取上清液倒入干净的烧杯中。
4、在上清液中缓缓加入0.2%的单宁溶液，边加边搅拌约15min，可见沉淀析出。
静置40min。
5、除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4000r/min离心5min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
6、把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中，加0.1%EDTA溶液100ml搅匀，再把1.5%氯化钠溶液200ml倒入烧杯中搅匀，以4000r/min离心7min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
7、将洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0.5%乙酸锌溶液20ml，搅拌均匀，静置5min；加0.06%抗坏血酸溶液30ml，搅拌均匀，静置5min；加1.5%氯化钠溶液20ml，搅拌均匀，静置5min；最后加0.5%EDTA溶液20ml，静置5min后，以4000r/min 离心7min，把上清液倒掉，得到洗涤剂II酶复合沉淀物。
8、把洗涤剂II酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0.5%硫代硫酸钠溶液20马力，搅拌均匀，静置5min；加1%L-半胱氨酸溶液10ml，搅拌均匀，以4000r/min离心7min，倒掉上清废液，最后得到蛋白酶糊。
9、把酶糊放入冰室（-12℃），低温冷冻15-20h。
取出解冻，离心得酶膏。
10、把酶膏倒入装有氯化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥6～10h，得到的是菠萝酶。
研成粉状，低温保存。
任务二质量鉴定以菠萝蛋白酶活力来标志它的质量。
1、取酶制品0.15g克加入到0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.0）定容至100mL，过滤。
此滤液为溶液酶制剂。
2、取1mL溶液酶加入0.9mL激活剂，于37℃水浴中保温。
3、保温恒定后，加入同样预热的1%酪蛋白溶液，混匀，在37℃下准确反应10min，加入8mL1mol/L氢氧化钠溶液，迅速摇匀，于室温放置半小时。
菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定
菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定15食安（1）班张凯摘要：本研究运用硫酸铵沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量，得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理，菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化，但是蛋白酶活性会损失一部分。
关键词：菠萝蛋白酶；透析法；分离纯化；酶活性；前言菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。
Marcano于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。
随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。
1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。
目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域。
随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。
[1]利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间，还可降低菠萝加工废料对环境的污染；随着市场对菠萝加工产品需求量的增大，对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要，尤其对最主要的功能成分蛋白酶的分离、纯化与性质的研究更有意义。
[2]本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取，初步分离纯化及活性测定进行了初步研究，探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素，并解决实验存在的一些问题。
1实验材料与仪器1．1实验材料与试剂新鲜菠萝，透析袋（截留相对分子质量8 000~14 000），0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），1％酪蛋白，激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)]，10％三氯乙酸(TCA)。
菠萝蛋白酶的提取和分离
菠萝蛋白酶的提取和分离朱明英 林文光(云南省热带作物科学研究所 景洪 666100) 菠萝蛋白酶,是菠萝下脚料综合利用的重要产品之一,一种新的生物化学制品。
菠萝蛋白酶有着广泛的用途,在制革、食品、饮料等生产中应用很多,在医学上用之医治炎症等多种疾病,特别对橡胶脱蛋白效果也很显著。
其水解蛋白质的活性大,适应性广。
菠萝蛋白酶的提取和分离方法主要参照文献[1—2]。
本试验在分离和提取工艺上作了一些摸索改进。
1 材料1.1原料:选70%—80%成熟度无刺卡因品种菠萝果皮,榨汁,用4层纱布过滤得鲜果皮汁。
1.2试剂:防腐剂:5%苯甲酸钠溶液。
沉淀剂:0.2%单宁溶液。
洗涤剂Ⅰ:0.1%乙二胺四乙酸二钠。
1.5%氯化钠溶溶洗涤剂Ⅱ:0.5%醋酸锌溶液、0.06%抗坏血酸溶30ml、0.15%氯化钠溶液200ml、0.5% EDT A溶液20m l洗涤剂Ⅲ:0.5%硫代酸钠溶液。
1%L—半胱氨酸溶液10m l(配制方法:称取L—半胱氨酸0.1g加水10ml,加1N盐酸溶液6—8滴助溶解,最后用6N N a OH溶液中和至pH3—4。
)2 方法和步骤2.1菠萝蛋白酶的提取称取1kg制备好的鲜果皮汁,加5%苯甲酸钠溶液10m l搅匀,以4000r/min离心7min,取上清液倒入干净烧杯中。
在上清液中缓缓加入0.2%的单宁溶液75ml,边加边拌约15min,沉淀物析出,静止40m in。
虹吸除去上清废液,把酶复合沉淀物倒入离心杯中,以4000r /min离心5min,倒掉上清废液,得到酶糊复合物。
2.2分离、洗涤和保护2.2.1洗涤Ⅰ把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中,加0.1% EDTA溶液100m l搅匀,再把0.15%氯化钠溶液200m l倒入烧杯中搅匀,以4000r/m in离心7min,倒掉上清废液,得到洗涤Ⅰ酶复合沉淀物。
2.2.2洗涤Ⅱ把洗涤Ⅰ酶复合沉淀物倒入烧杯中,加0.5%醋酸锌溶液20ml搅拌均匀,静止5min,加0.06%抗坏血酸溶液30ml搅匀,静止5min;加1.5%氯化钠溶液20m l搅匀,静止5min;最后再加0.5%EDT A溶液20ml搅匀,静止5min以4000r/min离心7m in,把上清废液倒掉,得到洗涤Ⅱ酶复合沉淀物。
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• 工艺流程如图 所示。超滤法生产工艺和操作比较 复杂，且设备一次性投资大。超滤浓缩后的浓缩 液若再用高岭土吸附法或者单宁沉淀法提取，可 大大节约其他辅助原料的用量，总生产成本减少， 且产品质量好，纯度高，酶活力高，酶活总回收 率高，经济效益明显比传统工艺好。超滤浓缩后 的浓缩液用有机溶剂沉淀法提取精酶，由于需要 低温使生产成本上升，但产品质量、纯度、酶活 都优于前者，是菠萝蛋白酶升级换代的新工艺。
菠萝蛋白酶制备方法及比较
工业生产上对菠萝蛋白酶的制备主要是从菠萝的 下脚料中提取，制备工艺有高岭土吸附法、单宁 沉淀法、盐析法和超滤法等。
• 比较:高岭土吸附法获得的菠萝蛋白酶虽然纯度较高， 酶活力在410×10 U／g以上，但工艺流程长，原料消 耗多，酶活总回收率低，会对环境有污染； • 单宁沉淀法比高岭土法简单，原料消耗少，酶活回收 率较低，产品酶活力在315×10 －410×10 U／g，会 对环境造成污染； • 盐析法获得的菠萝蛋白酶活性较低，纯度与药用要求 相差甚远
• 超滤法能有效分离提取菠萝蛋白酶。从超滤法提 取菠萝蛋白酶的工艺流程上看，其操作步骤简单， 并且该法具有无相变、低温、能耗少、活力损失 小、操作简单等特点，应用于菠萝蛋白酶的浓缩 和分离，不仅能保护其活性，降低生产成本，使 用的有机溶剂可回收再生产，基本上没有废物排 放，而且超滤透过液还可用作饮料添加剂，可以 达到清洁生产的要求；另外，超滤法分离得到的 菠萝蛋白酶质量好，纯度高，能达到医药级水平。
菠萝蛋白酶的提取：称取1 kg制备好的鲜果 皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r ／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。上 清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁， 分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、 0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。虹吸除去上清 废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r ／min。离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复 合物。分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人 烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将 1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以
菠萝下脚米 液
超滤浓缩
压 榨
汁液
去杂质
澄清
浓缩液
降温，加有机溶剂、沉淀
湿酶
减压干燥
酶制品
超滤法提取菠萝蛋白酶工艺流程图
单宁沉淀法
试剂：5％苯甲酸钠溶液； • 单宁溶液； • 0．1％EDTA溶液；0．5％EDTA溶液； • 1．5％氯化钠溶液； • 0．5％乙酸锌溶液； • 0．06％抗坏血酸溶液； • 0．5％硫代硫酸钠溶液； • 1％L一半胱氨酸溶液。
实验步骤
4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗 涤剂I酶复合沉淀物。把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入 烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀， 静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀， 静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml搅匀，静 止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀， 静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废 液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。把洗涤剂Ⅱ 酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％硫代硫酸钠溶 液20 m1，搅匀，静止5 min；加1％L一半胱氨酸 溶液10 ml，搅匀，以4 000 r／min离心7 min， 倒掉上清废液，最后得到蛋白酶糊。冷冻、干燥把 提取的酶糊放入冰室中(一12℃)，低温冷冻15～ 20 h，取出解冻，离心得酶膏，把酶膏倒人装有氯 化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥6～10 h得干酶，
菠萝蛋白酶分离方法
菠萝蛋白酶简介
• 菠萝蛋白酶，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶 或凤梨酵素。是从菠萝果茎、叶、皮提取 出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、 冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。 其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000， 等电点为9.55。品质最佳的菠萝蛋白酶是 利用菠萝的中茎加工，采用超滤方法进行 过滤浓缩，低温冷冻干燥而得的。产品已 被广泛应用于食品、医药等行业。
超滤法
超滤法提取菠萝蛋白酶的主要工艺操作包括： • ①压榨。将菠萝下脚料洗净，用压榨机压出汁液，加入0.05 ％苯甲酸钠防腐，迅速过滤除杂质。可采用压滤法或离心法去 杂质。 • ②超滤浓缩。将澄清液在管式超滤设备中进行浓缩，使体积浓 缩至原体积的1/5。 • ③沉淀。将浓缩液降温至0~4 ℃，边搅拌边加入-20 ℃的95 ％乙醇，直至混合液中乙醇浓度为50％，静置，使酶沉淀，移 出上清液，即得湿酶。 • ④干燥。将湿酶在0 ℃下减压干燥或冷冻真空干燥即得菠萝蛋 白酶精品。