枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化
枯草杆菌溶栓酶的液体发酵工艺和分离纯化研究
枯草杆菌溶栓酶的液体发酵工艺和分离纯化研究
胡淳罡;刘常金;周平;肖丽梅
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2008(000)010
【摘要】以产溶栓酶的枯草芽孢杆菌SBS为出发菌株,采用单因子试验和正交试验研究了液体发酵培养条件和培养基组成对酶活性的影响.发酵液经硫酸铵分段盐析、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等手段得到了电泳纯级别的溶血栓酶.结果表明,产溶
栓酶的最佳液体培养基组成为:10g/L米糠、25g/L大豆分离蛋白、0.2g/L CaCl2;最佳发酵培养条件为37℃,初始pH 8.0,15L发酵罐,发酵时间为70h,酶活性达到542U/mL,SDS-PAGE测得其分子量为32kDa.
【总页数】4页(P32-35)
【作者】胡淳罡;刘常金;周平;肖丽梅
【作者单位】天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457;天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457;天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457;天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-3
【相关文献】
1.60Coγ-DES复合诱变选育高产中性蛋白酶枯草杆菌及其发酵工艺研究 [J], 张新国;刘英娟;陈文洁;张春生;曹心张
2.枯草杆菌溶栓酶的分离纯化研究 [J], 韩润林;张小勇;张建安;李佐虎
3.枯草杆菌6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的分离纯化及部分性质研究 [J], 秦岭;刘克武;莫宏春;江琰;国锦林;刘祝君;喻东
4.1株诱变的枯草杆菌溶栓酶体内外溶栓性质初探 [J], 余蓉;祁晖;张涛;吴梧桐
5.产纤溶酶枯草杆菌液体发酵工艺优化研究 [J], 刘常金;赵彦丽;曹卫忠
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枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化
枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化李洪康;李由然;李赢;顾正华;丁重阳;石贵阳;张梁【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2016(042)005【摘要】对1株枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵培养基以及发酵条件进行了优化,最终确定了摇瓶最佳发酵培养基为:甘油40 g/L、豆粕粉30 g/L、麸皮10 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L.摇床最佳发酵条件为:温度30℃、转速250 r/min、接种量体积分数6％,在此发酵条件下,酶活达到6 082.7 U/mL,发酵强度为56 U/(mL·h).在15 L发酵罐进行了初步验证,通过流加甘油分批发酵,在第25h酶活达到最大值,为11 871 U/mL.【总页数】6页(P102-107)【作者】李洪康;李由然;李赢;顾正华;丁重阳;石贵阳;张梁【作者单位】江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文【相关文献】1.枯草芽孢杆菌J-4菌株产抑菌物质发酵条件优化 [J], 翟玉洁;邓祖丽颖;姜军坡;王世英2.枯草芽孢杆菌8-32产抗真菌物质发酵条件优化 [J], 贾田惠;杨可欣;时向哲;王欢;刘雪娇;高同国;朱宝成3.枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶发酵条件优化 [J], 卢超;陈景鲜;王国霞;陈刚;李春阁;王会鱼4.枯草芽孢杆菌S-16产抗菌蛋白发酵条件优化及蛋白分离纯化 [J], 路妍;杨鑫;吴文庆;连紫倩;扈景晗;周洪友5.枯草芽孢杆菌SX3411产抑菌物质的发酵条件优化 [J], 丰磊;魏伟群;付鸣佳;肖世平;叶德晓;钟雪晴;黄紫妍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化
枯草芽孢杆菌的培养、筛选分离和鉴别
03
枯草芽孢杆菌的筛选分离
枯草芽孢杆菌的分离纯化
制样品稀释液
取得土壤样g，放入盛 1 有99ml的无菌水锥形
瓶中，充分振荡。
培养
用移液枪将各个浓度梯度的一 3 定量稀释液接种到开始时制作 好的培养基上，用无菌刮铲涂 匀。37℃下倒置培养24小时。
加热筛选能形成芽孢的 细菌
在超净工作台中，将装有锥形瓶 2 的菌悬液加塞、包扎、摇匀后放
3
高压灭菌：将分装包扎的培养基放入 高压蒸汽灭菌锅中进行高压蒸汽霉菌， 用0.075MPa灭菌30分钟。（使用高 压蒸汽灭菌锅要注意放完冷气。灭菌 结束后等到气压降到“0”时才能打 开放气阀。）
培养基 制备
2
精确称取蔗糖30g、磷酸二氢钾4.5g、 硫酸铵2.5g、蛋白胨10g、碳酸钙 2g、酵母膏5g和琼脂20g，然后在 1000ml水中充分溶解。
道中的游离氧，造成肠道
2
低氧，促进有益厌氧菌生
长，间接抑制其它致病菌
生长。
4.
枯草芽孢杆菌菌体自身合成α -
4
淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤
维素酶等酶类，在消化道中与
动物体(人体)内的消化酶类一
同发挥作用。
3.
3
刺激动物(人体)免疫器官
的生长发育，激活T、B
淋巴细胞，提高免疫球
蛋白和抗体水平，增强
细胞免疫和体液免疫功
能，提高群体免疫力。
生物科学 进入人体，能100%到达大小肠，抑
制致病菌，促进有益厌氧菌生长，并产生 乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑 制其它致病菌生长。提高免疫球蛋白和抗 体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能， 提高群体免疫力。合成α -淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与 动物体(人体)内的消化酶类一同发挥作用。
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
——土壤中微生物的分离纯 化、培养观察及保藏
实验流程
土 壤 分样 离品 纯中 化微 生 物 的
细菌 酵母菌 放线菌 霉菌
形态结构观察
生理生化反应
nisin效价测定
生长曲线测定
菌
种
形态观察
保
直接计数
藏
死活细胞鉴定
形态结构观察
土壤中微生物的分离、纯化 和培养
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后 者在强碱环境下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二 乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+） 反应。
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 1
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 2
细菌细胞的生理生化反应
其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件如营养成分酸碱度温度和氧等或加入某种抑制剂在平板上培养微生物当平板上长出单菌落后挑取得到纯种的微生物土壤中微生物的分离纯化培养观察及保藏试剂与器材1材料含大肠杆菌枯草芽孢杆菌乳酸乳球菌黑曲霉根霉青霉和放线菌的土壤样品牛肉膏蛋白胨培养基斜面液体半固体马丁氏培养基查氏培养基等2试剂10酚4水琼脂3器材盛9ml无菌水的试管盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶涂布器无菌吸管接种环酒精灯无菌培养皿显微镜细胞计数板等
细菌的革兰氏染色
试剂与器材
1、材料
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
2、试剂
结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。
3、器材
显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内 装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。
Procedures of Gram Staining
产酶益生素
• 技术创新性之一：优越的菌株产酶性能
• 产酶是产酶益生素的基本特征。这八株有益菌在动 物肠道内可代谢产生中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋 白酶；α-淀粉酶、糖苷酶；脂肪酶；NSP酶等多种消化 酶类和非淀 粉多糖酶类，可以提高蛋白质和能量的消化吸收利用率 达5％左右。 1.产酶益生素中的枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn）N9-1-35，其产中性蛋白 酶的能力由起始菌株的45个国际单位，到2007年的 1000个国际单位，目前则达到1500个国际单位，快速 产酶期提前4小时。产酶性能可以提高动物对饲料尤其 是蛋白的消化能力，提高饲料转化率。
•
• • • •
+ 产酶益生素的主导成分及含量：
经过十年的连续选育和反复试验，产酶益生素最终确定了2株枯草芽孢杆 菌、1株地衣芽孢杆菌、4株乳酸菌和1株丁酸梭菌为主导成分的菌种组成。 活菌总数：浓缩精品为1.5×109CFU/克 非浓缩品为2.0×108CFU/克 由以上八株有益菌及其代谢产物组成，在机体代谢可产生多种消化酶，B 族维生素、有机酸和抗菌物质，还可生成多种未知促生长因子等。
产酶益生素 仔猪专用
仔猪专用型：适用于乳猪、仔 猪等哺乳动物的 幼龄阶段。 添加比例：0.2-0.4% 包装规格：25kg/桶 20kg/袋 本品适用于预混料厂、全价 料厂、规模养猪场。
产酶益生素 精品
• • • • • 精 品 型：适用于各种动 物 添加比例：0.01-0.02% 包装规格：桶装25kg(内 销) 桶装20Kg(外销) 本品适用于大型饲料厂、 预混料厂、大型养殖集团。 • • • • •
菌酶协同发酵生产蛋白饲料的研究进展及应用
菌酶协同发酵生产蛋白饲料的研究进展及应用。
随着我国蛋白资源短缺问题的出现，寻找其他原料弥补优质蛋白资源匮乏成为目前需要解决的问题。
我国非常规饲料原料来源广泛，富含维生素、蛋白质等营养成分，但存在抗营养因子和有毒物质且适口性差以及营养成分不平衡、差异大等缺点。
菌酶协同发酵是在微生物发酵工艺的处理下添加一定量的酶进行协同发酵，兼具酶解法和微生物发酵法的优点，能将原料中的抗营养因子降解，调节饲料苦味，改善饲料适口性，弥补单一微生物发酵产酶不足和酶解口味不佳等问题，促进动物采食，提高饲料转化率和营养价值。
因此，菌酶协同发酵饲料原料生产蛋白饲料能够充分利用我国非常规饲料资源，有效缓解我国蛋白饲料不足的压力，促进养殖业发展。
1菌酶协同发酵生产蛋白饲料的研究1.1菌酶协同发酵常用的菌种和酶菌酶协同发酵常用的菌种主要包括芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌以及霉菌。
芽孢杆菌类主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌等，能降解抗营养因子和有毒物质，分泌纤维素酶和蛋白酶将纤维素和大分子蛋白降解，调节动物肠道健康。
酵母菌类主要有酿酒酵母、产阮假丝酵母和啤酒酵母等，能使发酵饲料产生酒香味，改善饲料适口性，提升饲料风味，且因其本身是菌体蛋白，可增加蛋白产量，增加饲料利用率。
乳酸菌类主要有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸杆菌和乳酸片球菌等，能产生多种有机酸和细菌素进而降低饲料pH值，抑制有害菌生长，提升饲料营养品质，促进动物采食，增强动物免疫力。
霉菌类主要有米曲霉、根霉、木霉、黑曲霉和青霉等，霉菌类菌株能分泌胞外酶，如蛋白酶、半纤维素酶和纤维素酶等来分解原料中的淀粉和蛋白来提升发酵效果和增加饲料利用率。
常用酶主要是非淀粉多糖酶和蛋白酶。
非淀粉多糖酶主要是纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和甘露糖酶等，可将饲料原料中的纤维破坏使营养物质得以释放，且可将原料中碳水化合物分解为葡萄糖和氨基酸等小分子物质为菌群提供能源，促进动物吸收消化。
枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化
枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化刘颖;张彬彬;孙冰玉;刘琳琳;邹丽宏;石彦国【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2014(035)013【摘要】通过单因素试验和正交试验对枯草芽孢杆菌10075菌株发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化,达到提高菌株中性蛋白酶产量的目的.结果表明,发酵培养基的最佳组分:添加麦芽糖8.0％、蛋白胨4.0％、MgSO4 0.08％;最适发酵条件为发酵温度37℃、初始pH 7.0、发酵时间42 h,酶活力由最初的98.36 U/mL提高到353.45 U/mL.【总页数】5页(P166-170)【作者】刘颖;张彬彬;孙冰玉;刘琳琳;邹丽宏;石彦国【作者单位】哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076【正文语种】中文【中图分类】Q939.97;TS201.3【相关文献】1.枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化 [J], 李洪康;李由然;李赢;顾正华;丁重阳;石贵阳;张梁2.枯草芽孢杆菌ZC 1发酵产中性蛋白酶的条件优化 [J], 黄达明;宋庆春;管国强;张志才;李倩3.枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化 [J], LIU Wenlong;WANG Xingji;WANG Kefen;WANG Shuai4.枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶发酵条件优化 [J], 卢超;陈景鲜;王国霞;陈刚;李春阁;王会鱼5.蜡样芽孢杆菌高产新型中性蛋白酶发酵条件的优化 [J], 于平;吴赟婷;杨柳贞;贺敏;胡淳玉;刘航;易明花因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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武汉工商学院酶工程技术实训论文学院：环境与生物工程学院专业：生物工程年级：2014级学生：学号: 指导教师：职称：题目：枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化2017年6月18日目录摘要 (1)关键词 (1)Abstract (1)Keywords (1)1 中性蛋白酶 (2)1.1 中性蛋白酶的来源 (2)1.2 中性蛋白酶的意义 (2)1.3 枯草芽孢杆菌 (2)1.4 枯草芽孢杆菌的产酶特征 (2)1.5 枯草芽胞杆菌的形态特征 (3)1.6 研究目的 (3)2 实验材料与方法 (3)2.1 仪器设备和耗材 (3)2.1.1 仪器 (3)2.1.2 耗材 (3)2.2 枯草芽孢杆菌的筛选 (4)2.3 粗酶液的制备 (4)2.4 酶的分离纯化 (4)2.4.1 硫酸铵饱和度的选择 (4)2.4.2 蛋白酶活力测定 (5)2.4.3 透析及层析 (5)2.4.4 蛋白酶性质的测定 (5)3 结果与分析 (6)3.1 蛋白酶活力测定 (6)3.2 透析除盐 (7)3.3 柱层析分析 (7)3.4 酶作用的最适 pH (8)3.5 金属离子对酶活的影响 (9)3.6 化学试剂对酶活的影响 (9)4 结论与讨论 (10)参考文献 (11)枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化摘要中性蛋白酶作为一种生物催化剂已广泛用于食品、酿造、医药、纺织、制革等行业,本文对枯草芽孢杆菌的发酵产酶的提取质量条件进行了研究。
利用硫酸铵分级盐析，葡聚糖层析纯化后蛋白酶总活力为38694U，蛋白酶比活力为4960.8U/mg。
该酶的活力受到EDTA、异丙醇、乙醇抑制。
钙离子、镁离子对该酶有较好的保护作用关键词：枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶；葡聚糖层析；分级盐析Extraction quality analysis of producing neutralprotease from Bacillus subtilisAbstractNeutral protease as a biological catalyst has widely for food, and brewing, and medicine, and textile, and leather, industry, will enzyme technology application to seafood condiment, hydrolyzed of production in the, can formed enzyme method processing of unique advantages, makes fermentation products production cycle greatly shortened, and improve protein using, for, I on Bacillus subtilis spore Bacillus (Bacillus Substilis) of fermentation produced enzyme of extraction quality conditions for has research.Keywords:Bacillus subtilis; neutral protease; Dextran chromatography;fractionation; salting out1中性蛋白酶1.1中性蛋白酶的来源蛋白酶是一类催化蛋白质肽键，生成蛋白胨、蛋白肽及氨基酸等产物的水解酶，其广泛分布于自然界的植物、动物和微生物中。
例如木瓜蛋白酶主要来自于植物木瓜，胰蛋白酶来自动物的胰腺，来自微生物的蛋白酶没有特定名称，例如有来自AS1.398枯草芽孢杆菌的蛋白酶，有来自宇佐美曲霉的蛋白酶等等，其中微生物来源的蛋白酶数量与种类最多，也最具研究、开发与生产价值。
随着水解条件之一的pH值的升高，蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，这也同时划分了它们应用的领域有所不同。
1.2中性蛋白酶的意义中性蛋白酶是指最适作用pＨ介于6.0～7.5之间的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。
中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于生产的，由于其具有催化反应速度快，无工业污染，催化反应条件适应性宽等性质和优点，被广泛地应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业错误!未找到引用源。
~[2]。
生产中性蛋白酶可以从动植物组织中提取，以植物作为蛋白酶的来源会受到一些诸如气候条件、可利用土地面积的大小等因素的影响，而以动物作为蛋白酶的来源，其产量的大小主要依赖于可被屠宰牲畜的数量。
由于从植物和动物中生产蛋白酶具有局限性，为了满足当今世界市场的需要，人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上。
本试验所采用的产中性蛋白酶菌株为枯草芽孢杆菌错误!未找到引用源。
1.3枯草芽孢杆菌枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产a-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1.4枯草芽孢杆菌的产酶特征利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
1.5枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
1.6研究目的本次课题研究了枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的分离提取过程中的因素影响。
2实验材料与方法2.1仪器设备和耗材2.1.1仪器全温振荡培养箱（HZQ-Q 东联电子有限公司）、全温振荡培养箱（HZQ-Q 东联电子有限公司）、超净工作台（SW-CJ-IF 杭州净化设备公司）、电热压力蒸汽灭菌锅（LDZX-40SBI 上海申安医疗器械厂）、pH测量仪（PHSJ-4A 上海精密仪器厂）、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱（上海宝曼生物科技有限公司）、SephadexG-100离子交换柱（上海宝曼生物科技有限公司）、低温离心机（LG10-2.4A 北京医用离心机厂）、电子分析天平（FC204 上海精密仪器厂）、100ml锥形瓶、接种铲、小刀、棉塞、报纸、橡皮筋、拇指管、移液枪、500ml烧杯、培养皿。
2.1.2耗材（1）固体培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂粉20.0g、水1000mL、121Mpa灭菌20min，备用。
（2）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中加入最终质量浓度1.5%的牛奶。
脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（0.06Mpa,30min）,铺平板前再与加热融化的肉汤蛋白胨培养基混合。
（按照1:1混合）（3）液体培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、、水1000mL、121Mpa灭菌20min，备用。
（4）发酵培养基玉米粉4%，黄豆饼粉3%，磷酸二氢钠0.4%，磷酸二氢钾0.03%,3mol/L氢氧化钠，调节PH到9.0,0.1Mpa灭菌20min。
250ml三角瓶的装瓶量为50ml。
注意事项：玉米粉和黄豆粉不溶于水，培养基的配置过程中加热煮沸、PH调节及分装到三角瓶等环节注意用玻璃棒不断搅拌，保证培养基均匀一致。
筛选培养基：牛肉膏0.3g，NaCl 0.5g，酪素1.0g，琼脂2.0g，水100mL，pH7.6~8.0，0.1MPa 灭菌30min[1]。
2.2枯草芽孢杆菌的筛选培养：把活化后的枯草芽孢杆菌液在拇指管中分别稀释10-5、10-6、10-7三个浓度，分别用移液枪吸取10μL到平板上，并用涂布棒涂均匀。
放在37℃的恒温培养箱中培养24h。
初筛：挑选出能在牛奶筛选培养基上产生水解圈的单菌落接种到斜面培养基上，放入冰箱冷藏。
复筛：从冰箱中取出初筛得到的菌株,转接试管斜面活化,37℃下恒温培养24h.各取1环，接种到装液量为20mL基础培养基的50mL三角瓶中,在37℃条件下摇床培养24h.分别取各菌株发酵液10μL滴加在牛奶筛选平板中的滤纸片上(直径为12mm),然后将培养皿放入37℃的培养箱中培养24h ,取出后测量水解圈直径与菌落直径.重复此过程3次,取平均值,选取水解圈直径与菌落直径差值最大的菌落为实验菌种，接种到斜面培养基上备用错误!未找到引用源。
2.3粗酶液的制备将斜面30℃摇床培养48h后，按照2%接种量接入发酵培养基中，30℃、180r/min摇床培养于30℃培养48h。
将发酵液8000r/min冷冻4℃离心后取上清。
即为粗酶液，放入冰箱备用错误!未找到引用源。
2.4酶的分离纯化2.4.1硫酸铵饱和度的选择我们采用盐析法或有机溶液沉淀法来浓缩酶液，同时对酶有提纯作用。
取7只25ml锥形瓶分别加入处理好的酶液20ml，根据硫酸铵溶液饱和度计算表[5]，在粗酶液添加硫酸铵，分别使终浓度分别为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。
摇匀在4℃条件下静置过夜，等蛋白析出后用冷冻离心机12000r/min 离心20min ，经缓冲液透析后测上清液活力绘制硫酸铵盐析曲线错误!未找到引用源。
表 2-1硫酸铵盐析标准曲线L -酪氨酸浓度0 10 20 30 40 50 60 吸光度A 0 0.050 0.123 0.192 0.261 0.331 0.4062.4.2 蛋白酶活力测定 按部颁行业标准QB1805.3-93，采用Folin 法则测定错误!未找到引用源。
1ml 酶液在一定温度和pH 条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的量为一个酶活力单位，以U 表示。
2.4.3 透析及层析收集盐析沉淀，用缓冲溶液稀释，然后在透析袋中低温透析，不断更换缓冲液，透析过程在低温下进行，一方面防止样品降解或变性，一方面也可以防止微生物的生长。
每隔10h 换一次溶剂，新的溶剂也要冷却。
避免样品变性。
用处理好的葡聚糖凝胶层析柱层析，并用凝胶处理液洗脱，绘制层析曲线，根据曲线收集各个峰，检测峰蛋白有无蛋白酶活性。