碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探
蛋白酶的分离纯化原理
蛋白酶的分离纯化原理蛋白酶是一类能够对蛋白质进行水解的酶，其在生物体内起着重要的调节和催化作用。
蛋白酶的分离纯化是研究蛋白酶的功能和特性的基础，也是生物医学研究和工业应用的重要环节之一。
蛋白酶的分离纯化的原理主要基于蛋白酶的特性以及其与其他分子间的相互作用。
下面将从多个方面详细讨论蛋白酶的分离纯化原理。
1. 选择性沉淀：蛋白酶的分离纯化常常以选择性沉淀为起点。
选择性沉淀通过改变蛋白酶溶液的pH 值、温度和添加特定试剂或溶剂等方法，使蛋白酶发生变性、沉淀或与其他蛋白质结合，利用这些特性差异实现蛋白酶的分离。
例如，可以通过调节溶液pH 值使蛋白酶发生电荷改变，导致其溶液中的部分蛋白酶发生离子态变化而沉淀出来。
此外，还可以利用特定的有机溶剂如乙醇、异丙醇或氯仿等，将蛋白酶从溶液中沉淀出来。
2. 胶束层析：胶束层析是一种常用的蛋白酶分离纯化方法，其原理是根据蛋白酶与胶束的亲和性差异实现分离。
胶束层析常使用表面活性剂如SDS（十二烷基硫酸钠）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等形成胶束，利用胶束与蛋白酶形成复合物，通过调节胶束与蛋白酶之间的亲和力，实现蛋白酶的分离。
例如，可以通过改变溶液中SDS 的浓度，控制蛋白酶与SDS之间的作用力，从而实现不同蛋白酶的分离。
3. 电泳分离：电泳是一种利用电场将蛋白质分离的方法，通过对蛋白酶溶液进行电泳，可以根据蛋白酶的电荷、大小和形状的差异实现蛋白酶的分离。
电泳分离常用的方法有凝胶电泳和等电点聚焦电泳。
在凝胶电泳中，蛋白酶在电场中迁移，根据蛋白质的分子量和电荷差异，将蛋白酶从溶液中分离出来。
在等电点聚焦电泳中，蛋白酶在具有梯度pH值的凝胶中迁移，直到达到等电点位置停止迁移，实现蛋白酶的分离。
4. 亲和层析：亲和层析是一种基于蛋白质与亲和配体之间的高度特异性结合作用实现蛋白质的富集和纯化的方法。
蛋白酶亲和层析可以利用蛋白酶与特定亲和配体的结合实现蛋白酶的富集和分离。
常见的亲和配体有抗体、亲和柱和亲和分子等。
地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶分离纯化研究
地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶分离纯化研究作者：席云静来源：《科技创新导报》2011年第04期摘要:对产自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的碱性蛋白酶通过乙醇沉淀、盐析、DEAE阴离子交换层析、凝胶层析4步纯化。
以酶比活力为指标,对碱性蛋白酶分离纯化条件进行了优化。
结果发现:提纯酶的比活力达62098U/mg,纯化倍数为23.7,活性回收率为15.7%。
关键词:碱性蛋白酶提纯分离中图分类号:O814 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)02(a)-0015-01Study on separation and purification of alkaline protease from B.licheniformisXU Yun-jing(School of Sciences & Biotechnology,Harbin Normal University,China,150025)Abstract:On the production from Bacillus licheniformis(B.licheniformis)of alkaline protease by ethanol precipitation,salt precipitation,DEAE anion exchange chromatography,gel filtration purification step 4.The enzyme activity as an index of the alkaline protease purification conditions were optimized.The results showed that:purified enzyme specific activity 62098U/mg,purification factor of 23.7,15.7% activity recovery.Key Words:alkaline protease;purification;separation酶是一种具有特殊催化功能的高效生物催化剂,它不仅催化生物体内化学反应,而且催化非体内的化学反应,并且能够催化化学方法难以完成的反应。
碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探
碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:1.国内外研究现状碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。
1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。
碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。
由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。
研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。
海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。
迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。
海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。
相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。
综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。
首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。
其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。
2.选题依据及意义此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。
大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。
最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。
本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究董静 201131301031摘要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。
关键字：碱性磷酸酶分离纯化热稳定性酸碱稳定性碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。
此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。
它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。
药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。
它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。
临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。
因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。
本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。
此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。
碱性蛋白酶菌株的分离鉴定
产碱性蛋白酶菌株的分离鉴定摘要：碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。
本文综述了产碱性蛋白酶菌株的研究现状，包括生产菌株的来源、菌株的分离方法以及菌株的鉴定方法，并对其前景进行展望。
关键词：碱性蛋白酶、菌株、分离、鉴定Isolation and Identification of Alkaline Protease-producing StrainsWensi Hou(Yanshan university , Liren college , Hebei 066004)Abstract：Alkaline protease is a group of important industrial enzyme and has been widely applied in food industry, medical treatment, detergent industry, leather producing, brewing and other fields. This paper reviews the research status of alkaline protease producing strains, including the methods of isolated strains, strain sources and methods of identified strains. This paper also discusses its prospect.Key words:Alkaline protease ; strains ; isolation ; identification1．碱性蛋白酶1.1简介碱性蛋白酶(alkaline protease) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类, 是一类非常重要的工业用酶,广泛存在于动、植物及微生物生物体中, 在猪的胰脏中最早被发现。
耐热碱性蛋白酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究的开题报告
耐热碱性蛋白酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究的开题报告一、研究背景及意义耐热碱性蛋白酶是一种有重要应用价值的酶，广泛应用于医药、食品、皮革、环境保护等行业中。
其特点是能在高温高碱环境下稳定地存在和发挥作用，因此受到了广泛关注。
目前，已经有许多研究针对耐热碱性蛋白酶的产生菌株、分离鉴定及酶学特性进行了探究，但在实际应用中，仍存在一些问题需要解决，如酶的稳定性、效率和产量等方面，因此有必要进一步深入研究。
二、研究内容和方法本研究旨在分离鉴定耐热碱性蛋白酶产生菌株，并研究其基本酶学性质，为酶的进一步研发应用提供参考。
具体研究内容如下：1. 采集多种自然环境中的样品，如土壤、水、植物、动物等，通过培养分离的方式筛选产生耐热碱性蛋白酶的菌株；2. 对所得到的菌株进行形态学特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法进行鉴定，筛选出优良的菌株；3. 通过固体和液体发酵的方法大量制备菌株产生的耐热碱性蛋白酶；4. 研究酶的基本酶学性质，包括最适温度、最适pH值、热稳定性、抑制剂对酶的影响等；5. 对酶的酶动力学特性进行研究，包括酶的动力学常数、Michaelis-Menten方程、反应速率等。
三、预期结果本研究将分离鉴定出优良的耐热碱性蛋白酶产生菌株，并对酶的基本酶学性质和酶动力学特性进行研究，预计能够得到以下结果：1. 获得产生耐热碱性蛋白酶的优良菌株，为耐热碱性蛋白酶的基础研究和产业应用提供了可靠的物质基础；2. 揭示耐热碱性蛋白酶的基本酶学性质和酶动力学特性，为其进一步应用提供理论支持；3. 为该领域的后续研究提供实验方法和实验结果的参考，推动本领域的发展。
四、研究难点及解决思路本研究面临的主要难点在于如何获得稳定、高效率和高产量的耐热碱性蛋白酶，以及如何解决酶在产业应用中的稳定性问题。
针对这些问题，我们将采取以下解决思路：1. 进行大量的筛选和优化实验，从多个样品中挑选最适合的菌株进行培养和发酵；2. 通过改变培养条件、添加助剂等方法，优化酶的产量和活性，使其符合产业应用的需求；3. 在产业应用中，注意酶的保护和稳定性，避免不必要的失活和损失。
短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的提纯与性质研究
（ ．Ｃｏ ｌｇ ｆＦ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ Ｇａ ｓ ｒ ｕ ｔ ｒ ｌＵｎ ｖ ｒ ｉ ， ｎ ｈ ｕ ７ ０ ７ Ｃｈ ｎ ； １ ｌ ｅｏ ｏ ｄ Ｓ ｉｎ ｅ ａ ｄ Ｅｎ ｉ ｅ ｒ ， ｎ ｕ Ａｇ ｉ ｌ ａ ｉ ｅ ｓｔ Ｌａ ｚ ｏ ３ ０ ０， ｉ ａ ｅ ｎ ｃ ｕ ｙ
Ｐｕ ｉ ｃ ｔｏ ｎ ａ ｔａ ｒ ｐ ｒｉｓ ｏ ｌ ａ ｉ ｅ ｐ ｏ ｅ ｓ ｒｆ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｐ ｒｉ ｌ ｏ ｅ ｔ ｆａ ｋ ｌ ｒ ｔ ａ ｅ ｉ ｐ ｅ ｎ
Ｚ ｕ ２ ２ ４ ｆ ｏ Ｂａ ｉｌ ｓ ｍｉｕ ｋ ｄ ０ ． ｒ ｍ ｃ ｌｕ ． ｐｕ ｌ ｓ
ｆ ｄ ｐ ｏ ｅｎ ｓ ｓｄ ｍｏ ｓｒ ｔｄ ｔ ｅｈ ａ ｔｂ ｅａ ｄｓ ｉ ｂｅｉ ｌａｉｅ Ｔｈ ｌａｉ ｅｐ ｏ ｅ ｓ ｆ ｌｃｒ — ｉ ｒ ｔｉａ ｅｗａ ｅ ｎ ｔａ ｅ ｏ ｂ ｅ ｔ ａ ｌ ｎ ｕｔ ｌ ｎａｋ ｌ ． ｅａｋ ｌ ｒ ｔａ ｅｏ ｅ ｔｏ ｅ ｓ ａ ｎ ｎ ｅ ｐ ｏ ｅｉ ｏ ｇ ｎ ｉｙｂ ＤＳ ＰＡＧＥ ｓ ｏ ｄｔ ｅｐ ｏ ｕ ｔｗａ ｒ ｔ ｉ ｔ ｌｃ ｌｒｗｅｇ ｔｏ ． ｕ ｈ ｒ ｔ ｈ ｍｏ ｅ ｅｔ ｙＳ — ｃ ｈ ｗｅ ｈ ｒ ｄ ｃ ｓａｐ ｏ ｅｎ ｗｉｈａｍｏ ｅ ｕａ ｉｈ ｆ２ ５ｋ ．
较 高 的热 稳 定 性 和 耐碱 性 ． Ｓ ＳＰ Ｅ测 定 ， 分 子 质量 约 为 ２ ５ｋ ． ． Ｄ － ＡＧ 经 其 ． ｕ
关键 词 ： 小 芽 孢 杆 菌 ； 性 蛋 白酶 ； 取 纯 化 ； 质 短 碱 提 性 中 图分 类 号 ： ９ ９９ Ｑ ３ ． 文 献 标识 码 ：Ａ 文章 编 号 ： ０ ３４ １ （０ ８ ０—１ ６０ １ ０ —３ ５ ２ ０ ）６０６ —４
碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究
碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究碱性蛋白酶(alkaline protease)是一类最适pH为碱性的蛋白酶,是一种非常重要的水解酶类,在医药、饲料、食品等领域中都有广泛应用。
本论文以Cellulomonas bogoriensis sp.nov为出发菌株,对其产酶条件、碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质等方面进行了研究,并得到以下结论:利用单因素法和响应面Box-Behnken组合设计方法对菌株产碱性蛋白酶的发酵条件进行了优化,得出菌株最佳产酶条件为:培养温度30℃,培养基初始pH 10.5,装液量75/250 mL,1.5%(w/v)蔗糖为碳源、1.5%(w/v)的牛肉膏酵母浸粉(1:1)为混合氮源、NaCl 含量为2.67%(w/v),培养时间120 h。
经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow柱层析纯化得到一个相对分子质量约为18.3 kDa的碱性蛋白酶,纯化倍数为10.83,回收率为25.79%。
酶的最适反应温度70℃,最适pH为11.0。
在4-60℃、pH3.0-12.0范围内酶活力稳定;1 mM的Mg2+、Fe2+会增加蛋白酶活力;而1 mM的Ba2+、Mn2+、Ca2+对蛋白酶活力几乎没有影响,但在10mM时会明显抑制蛋白酶的活力。
EDTA浓度为10m M时,碱性蛋白酶的酶活力仍能达到77%。
抑制剂PMSF,TPCK对酶有强烈的抑制作用,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶家族中的胰凝乳蛋白酶。
酶对甲醇、乙醇、甘油等有机溶剂具有较强的耐受能力,Triton X-100强烈抑制酶活力。
该蛋白酶最佳作用底物为酪蛋白,可以水解血红蛋白和牛血清白蛋白,不能水解明胶和胶原蛋白,米氏常数Km为19.2μg/mL,Vmax为2000μg/min。
该蛋白酶与市售的洗涤剂均有良好的相容性,具有良好的脱毛效果、处理血污的能力和耐盐性。
测定了该酶的N端序列,为FDVIGGNAYT。
本论文纯化的碱性蛋白酶具有耐碱性、耐高温、耐盐及耐有机溶剂等优良的特性,在皮革、洗涤等工业生产中具有应用前景。
19-酶的分离纯化及酶学性质研究
酶的分离纯化---介绍酶分离纯化的步骤、原则和评价方法⏹酶的分离提纯●酶分离纯化的目的：研究酶的性质、作用、反应动力学、结构与功能的关系、阐明代谢途径；作为生化试剂和药物。
●酶提纯主要包括：酶制剂的浓缩；杂蛋白和杂质的去除●分离纯化方法的衡量指标总活力回收；比活力提高的倍数。
材料处理抽提分离纯化鉴定机械、化学，组织/细胞破碎,蛋白质释放缓冲液、离子浓度pH，蛋白质溶解到缓冲液，盐析、有机溶剂、等电点、吸附、超滤，缩小体积离心离心离子交换、凝胶过滤、疏水层析、亲和层析、高效液相、快速蛋白质液相层析、电泳、结晶电泳、结晶、溶解度、高效液相，二种以上分子量、等电点、活性酶总活力比活力回收率纯化倍数酶总活力比活力酶总活力比活力酶总活力比活力酶总活力比活力酶的分离提纯过程⏹评价指标●总活力=活力单位数/ml×总体积（ml）●比活力=活力单位数/ mg蛋白（氮）=总活力单位数/ 总蛋白（氮）mg ●纯化倍数=每次比活力/第一次比活力●回收率=每次总活力/第一次总活力某科研人员在对酶分离纯化过程中得到以下实验结果：请根据上述实验结果回答以下问题：⑴在六部分离纯化过程中，哪一步（A）分离效果最好，哪一步（B）分离效果最差？依据是什么？⑵上述A和B步骤分离纯化方法的原理是什么？⑶该酶是否已经纯化？还可以用什么方法确定其纯度？分离步骤总蛋白质含量(mg) 活力单位数1 粗分离20 000 4 000 0002 盐析 5 0003 000 0003 等电点分离4 000 1 000 0004 离子交换200 900 0005 亲和层析50 750 0006 分子筛层析45 675 000分离步骤总蛋白含量mg 活力单位数比活力回收率纯化倍数1粗分离20 000 4 000 00020010012盐析 5 000 3 000 0006007533等电点分离 4 000 1 000 00025025 1.254离子交换200900 000450022.522.55亲和层析50750 0001500018.75756分子筛层析45675 0001500016.8875回收率=100*每一步的活力单位数/第一步的活力单位数纯化倍数=每一步的比活力/第一步的比活力取XXmL 酶液测定其中蛋白质的含量，换算总蛋白含量取XXmL 酶液测定其中酶活力单位数，换算活力单位数总活力数/总蛋白含量宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化纯化步骤总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀21 2980 141 2.64 694、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶0.12 130 1072 19.70 3。
海藻酸钠固定化碱性蛋白酶制备及酶学性质的研究
海藻酸钠固定化碱性蛋白酶制备及酶学性质的研究王胜男1，江连洲1，2，李杨1，2，李丹丹1，王中江1，齐宝坤1，刘琪1，王梅1收稿日期：2012－02－02作者简介：王胜男（1988—），女，在读硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程通讯作者：江连洲基金项目：黑龙江省攻关项目（GA09B401－6）；农业部现代农业产业技术体系建设项目（nycytx －004）原文出处：《食品工业科技》，2012Vol.33No.17（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030； 2.国家大豆工程技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：对采用海藻酸钠固定化碱性蛋白酶的方法和酶学性质进行了研究。
在单因素实验基础上，采用响应面优化方法确定固定化的最优条件，得到的最佳条件为：海藻酸钠浓度3.1%，pH 9.4，CaCl 2浓度3.0%，游离酶添加量10000U /g ，时间1.8h ，固定化酶活力可达5518U /g 。
固定化酶的最适pH 为10，最适温度为60ħ，制得的固定化酶的热力学稳定性和操作稳定性较好。
此外，固定化酶重复利用5个循环后酶活力仅降低40%。
关键词：海藻酸钠；碱性蛋白酶；固定化酶；酶学性质中图分类号：Q814.2文献标识码：A文章编号：1002－0306（2012）17－0166－06Preparation and enzymatic properties ofalkaline protease immobilized with sodium alginateWang Shengnan 1，Jiang Lianzhou 1，2，Li Yang 1，2，Li Dandan 1，Wang Zhongjiang 1，Qi Baokun 1，Liu Qi 1，Wang Mei 1（1.Food Science College of Northeast Agricultural University ，Harbin 150030，China ；2.The National Ｒesearch Center of Soybean Engineering and Technology ，Harbin 150030，China ）Abstract ：Preparation and enzymatic properties of alkaline protease immobilized with sodium alginate were studied．Based on single factor experiments ，response surface optimization method was used to determine the optimal conditions for immobilization．The results showed that optimum conditions were ：concentration of sodium alginate 3.1%，concentration of CaCl 23.0%，pH 9.4，amount of free enzyme 10000U /g ，time 1.8h ，enzyme activity up to 5518U /g．The optimum pH was 10，optimum temperature was 60ħ，the thermal stability and operational stability of the immobilized enzyme was better．Furthermore ，the enzyme activity of immobilized enzyme was only reduced by 40%after used five cycles．Key words ：sodium alginate ；alkaline protease ；immobilized enzyme ；enzymatic properties 目前，酶固定化技术已在食品工业、医药、化工等领域广泛应用，随着人们对天然高分子载体的不断挖掘和探究，对其进行改性，或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶，同时，开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化和生产能力是固定化酶技术发展的趋势［1－4］。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:1.国内外研究现状碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。
1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。
碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。
由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。
研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。
海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。
迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。
海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。
相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。
综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。
首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。
其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。
2.选题依据及意义此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。
大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。
最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。
本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。
这种积极采用微生物代替化学法的探究，有利于开发现代生物新产品的工业化生产技术研究，有利于加快现代生物领域产业的发展。
二、研究的基本内容，拟解决的主要问题1.海水中碱性蛋白酶高产菌株的筛选；2.发酵液中碱性蛋白酶的分离提纯（主要目标）；3.目标碱性蛋白酶的性质初探（初步预计目标碱性蛋白酶的科研价值）；4. 结果分析（得出结论，为下一步科研工作打下基础）。
三、研究步骤、方法及措施1. 实验材料1.1菌种: 燕山大学生物实验室筛选产碱性蛋白酶海洋菌株。
1.2分离纯化材料考马斯亮蓝，南京建成生物工程公司；葡聚糖凝胶层析柱，SDS分析纯，中药集团上海化学试剂公司；等等。
2. 实验方法2.1生物量测定用722 型分光光度计测定发酵液的OD值作为生物量指标。
2.2蛋白酶活力测定先将1 % 酪蛋白放入40 ℃恒温水浴中，预热 5 min；取适当稀释的酶液 1.0 mL，加预热后的酪蛋白1.0 mL 摇匀，并在40 ℃下保温10 分钟：加0.4 mol / L 三氯乙酸2.0 mL 摇匀，取出静止10 min，过滤；取l.0 mL 滤液，于40 ℃下加0.4 mol / L 碳酸钠溶液 5.0 mL，接着加福林试剂使用液 1.0 mL 并保温20 min。
在680 nm 波长下比色，测其吸光度[8,9]。
酶活计算方法：X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n式中：X，样品的酶活力（μ/g或μ/mL）；A，样品平行实验的平均吸光度；n，稀释倍数。
K，吸光常数，K=95.3（说明：测定空白时，加酪蛋白与三氯乙酸的顺序相反）2.3分离提纯工艺流程2.3.1粗酶液制备发酵液经10000r/ min低温离心10min, 取其上清液作为粗酶液2.3.2 酶的盐析取9 个容量瓶分别加入发酵上清液20 mL，搅拌下加入硫酸铵，使其饱和度分别为0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，在20 ℃水浴中保温2 小时，滤纸过滤后，分别测定滤液的碱性蛋白酶活力。
根据测定结果，以硫酸铵饱和度为横坐标，酶活为纵坐标，绘出该酶的盐析曲线。
确定除杂蛋白和沉淀碱性蛋白酶的A饱和度和B饱和度硫酸铵[10,11]。
2.3.3酶的丙酮沉淀酶液中加入不同体积的丙酮（20 ℃），放置 2 ~ 3 h，离心收集酶沉淀。
同时测定不同丙酮加入量下的上清与沉淀中碱性蛋白酶的活力，得到使沉淀蛋白的酶活力最大的丙酮加入量，并记录数据，同盐析沉淀对比。
2.3.4 酶的分子量测定取部分沉淀，进行电泳，初步测定分子量，根据数据选择合适孔径。
2.3.5 酶的分离层析发酵上清液中加入最适体积的丙酮或硫酸盐（20 ℃），放置 2 ~ 3 h，1000 rpm离心5 min 得到沉淀，冷冻干燥。
冻干的酶粉溶解于50 mM pH 10.0 的甘氨酸-NaOH 缓冲液中，不能溶解的部分可以离心除去。
此溶液在相同缓冲液中透析。
1 mL 透析的酶液上葡聚糖凝胶过滤柱（合适孔径），用50 mM pH 10.0 的甘氨酸-NaOH 缓冲液进行洗脱，流速调节为15 mL / h。
收集活性峰，于- 20 ℃下进行储存[12]，进行酶学性质的实验和下一步的纯化。
2.3.6碱性蛋白酶的活力测定方法同2.2。
2.3.7蛋白质含量的检测采用Lowry 法进行测定。
酶的分离纯化过程中，采用280 nm 紫外检测。
2.3.8 SDS-PAGE 电泳利用SDS-PAGE 凝胶电泳测定碱性蛋白酶的纯度及分子量。
酶液与样品缓冲液在100 ℃下加热 5 min 变性。
电泳在40 mA 下进行，蛋白带用考马斯亮兰R-250 进行现色[13]。
2.4 酶学性质的研究2.4.1 pH对酶的影响pH的影响分别从对酶的稳定性与活性这两个方面研究。
酪蛋白底物溶解于不同的缓冲液体系中：Tris-HCl pH（7.0 ~ 8.0），50 mM 甘氨酸-NaOH 溶液（pH 9.0 ~ 13.0）。
检测酶反应的最适pH 值，以最适反应pH 下测定的最大酶活为100 % 酶活力。
将纯化的储存酶溶解于上述缓冲液中，30 ℃下保存l h，检测残余活性。
2.4.2 温度对酶活性的影响温度的影响也分别从对酶的稳定性与活性这两个方面研究。
将纯化的储存酶溶解于50 mM pH 10.0 甘氨酸-NaOH 缓冲液，置于封闭的Eppendorf 管中，在不同温度水浴中保温不同时间，测定残余酶活力。
于10 ~ 80 ℃范围内检测碱性蛋白酶的活性，确定酶反应的最适温度。
2.4.3 酶动力学曲线及米氏常数的测定配制不同浓度的酪蛋白底物（最适pH），测定最适温度下不同底物浓度下酶反应的初速度。
用双倒数作图法（Lineweaver –Burk），以初速度的倒数对底物的倒数作图，求得最大酶反应速度Vmax 和米氏常数Km 值[14,15]。
2.4.4 金属离子对酶活的影响将纯化的储存酶溶解于50 mM最适pH的甘氨酸-NaOH 缓冲液中，与不同离子在最适温度下共同保存l h，后测定残余活性。
2.4.5 有机溶剂对酶活的影响材料为实验室所有有机溶剂如苯、甲苯、二甲苯、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇、环己烷、正庚烷、无水乙醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃等。
经过有机溶剂处理过的酶，在37℃下进行酶促反应10min，测定转化后的A280（与酪蛋白浓度成正比）。
2.4.6 碱性蛋白酶的稳定性将无细胞发酵液与精制酶（适量丙酮对无细胞发酵原液进行沉淀，沉淀的酶蛋白溶于50 mM 最适pH的甘氨酸-NaOH 缓冲液中）分别于室温与 4 ℃下贮藏，每15 天分别测定发酵液与精制酶的活力，考查其稳定性。
四、研究工作进度1-3周查阅相关文献资料，设计试验方案，写开题报告，任务书和文献综述；4-8周配制试剂、菌种筛选，进行试验；9-14周碱性蛋白酶的分离纯化，性质实验测定，数据处理等；15-16周结果分析；撰写毕业论文；17周论文评阅、答辩。
五、主要参考文献[1] 冯静, 谢慧君, 马桂荣. 一株海洋细菌产碱性蛋白酶的研究. 生物技术, 2001, 11(3):11-13.[2] 李丹, 陈丽, 李富超等. 一株产低温碱性蛋白酶海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407的筛选与生长特性. 食品与生物技术学报, 2007, 26(6): 74-80. [3] 孙谧, 王跃军, 张云波等. 一株产低温碱性蛋白酶嗜冷海洋细菌YS-9412-130的分离和培养条件研究. 海洋水产研究,2000,21(4): 1-5.[4] 吕明生, 陈静, 王淑军等. 海洋细菌产低温碱性蛋白酶菌株的筛选研究. 江苏食品与发酵, 2004, (1): 7-10.[5] 韩斌, 张林丰. 现代生物化工中酶工程技术研究与应用. 北京农业, 2008, (33): 37-39.[6] HAO Jian—Hua, W ANG Yue—Jun, LIU Jun ,et al. Cloning and Characterization of Marine Bacterium QD80 Cold Alkaline Protease. Chinese Journal of Bioehemistry and Molecular Biology, 2005, 21(4): 465-470.[7] 邓菊云. 微生物碱性蛋白酶研究进展. 现代食品科技, 2008, 24 (3): 293-296.[8] 荆谷, 谢慧君, 孔健. 海洋细菌Pseudomonas sp. 7211产碱性蛋白酶的研究. 山东大学学报(理学版), 2002, 7(3): 264-267.[9] 路炳声, 黄志强, 林白雪等. 海洋氧化短杆菌15E产碱性蛋白酶的发酵条件. 福建农林大学学报(自然科学版), 2007, 36(6): 591-594.[10]Rai SK ,Mukheljee AK. Ecological significance and some biotechnological application of an organic solvent stable alkaline serine protease from Bacillus subtilis strain DM-04. Bioresource Technology , 2009, 100 (9): 55-59.[11]Chaganti Subba Rao,Thadikamala Sathish,Pendyala Brahamaiah,et al. Development of a mathematical model for Bacillus circulans growth and alkaline protease production kinetics. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2008, 84 (2): 112-116.[12]龙敏南, 苏文金, 张凤章等. 光合细菌Chromatium vinosum可溶性氢酶的分离提纯及特性. 中国生物化学与分子生物学报, 2000, 16(6): 710-715.[13]肖云晓, 庞辉肖. 螺旋藻激酶分离提纯方法初探.时珍国医国药, 2001,22(6):1399-1400.[14]喇文军. 蛋白质、蛋白酶以及短肽类的分离提纯技术及应用. 食品工程,2008,(1):15-29.[15]顾艳丽, 刘赛男, 张慧等. 菌株I13产碱性蛋白酶的酶学性质研究. 安徽农业科学,2010, 39 (13): 7574-7575.六、导师意见指导教师（签字）年月日七、审核意见：审查结果： 1、通过； 2、完善后通过；3、未通过负责人（签字）：年月日。