碱性磷酸酶的分离纯化-袁野
碱性磷酸酶的分离提取
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碱性磷酸酶活性的鉴定
磷酸苯二钠
AKP
磷酸盐 + 酚 红色醌类衍生物
酚 + 4-氨基安替比林 铁氰化钾
AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解 磷酸基团。最适pH范围为8.8~10, 需要镁离子作为 激活剂。
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Hale Waihona Puke 2管号酶液体空白
标准
A
B
C
D
0.1
0.1
0.1
0.1
酚标准液
0.1
Tris-Mg(AC)2 0.1
3
实验目的
1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、 分光等方法，从组织中分离纯化 及鉴定特定蛋白质的技能。 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技 术及鉴定的方法
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实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二 钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶 液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与 AKP活性成正比。
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碱性磷酸酶的纯化
其余悬液中 缓慢 加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数 达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min， 取上清液丢弃沉淀。 上清液中 缓慢 加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到 50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min。 沉淀中加入 Tris-醋酸镁缓冲液 5ml，即为纯化酶液。 作为D液用于比活性测定。
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碱性磷酸酶的提取
在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅 拌 2min ，室温放置 30min ，纱布过滤，置于离心 管。
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碱性磷酸酶的纯化
滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后 3000r/min 5min。弃上清，沉淀用4ml 0.5mol/L Mg(AC)2 溶解。记录体积b 。取0.1ml作为B 液于EP 管，待测比活性用。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究董静 201131301031摘要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。
关键字：碱性磷酸酶分离纯化热稳定性酸碱稳定性碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。
此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。
它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。
药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。
它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。
临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。
因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。
本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。
此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。
碱性磷酸酶的分离纯化鉴定PPT演示课件
蒸馏水
0.1
BCA试剂
1.5
/
标准管
/ 0.1 / 1.5
50 20
AB
0.1 0.1 // // 1.5 1.5
5
1
CD
0.1 0.1 // //
1.5 1.5
37保温 30分钟 562nm 比色
蛋白含量（mg/ml） =
A样 ×0.2 ×稀释倍数 A标
蛋白标准液浓度
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计算
样品的酶活性单位 碱性磷酸酶比活性（U/mg） =
碱性磷酸酶的分离纯化
有机溶剂分步沉淀法
1
分离纯化的一般程序
选择材AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中）， AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），
3
操作
一、取材及匀浆
取兔肝2g，剪碎， 加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分 匀浆。 记录体积 （取0.1ml至一新EP管留作A液，测定时稀释25倍）
红色醌式化合物
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稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ） /
/
25 10 5
1
单位（ml）
空白管 标准管 A B C D
各阶段稀释液
/
/
酚标准液（0.1mg/ml） / 0.1
Tris-醋酸镁
0.1 /
复合底物液
3
3
0.1 0.1 0.1 0.1 //// //// 3 333
37保温 15分钟 各管加入铁氰化钾液2ml，静置15min
紫外分光光度计（200－400nm） 可见光分光光度计（400－760nm） 红外分光光度计（760－1000nm）
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2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。
分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。
本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。
材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。
方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。
结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。
同时，样品纯度也有了显著的提高。
分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。
实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。
透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。
在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。
但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。
结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。
同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。
设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案
AKP纯化程度鉴定
• 纯化程度用酶的比活性反应。
• 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
碱性磷酸酶的活性测定 磷酸笨二钠法
• 在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸 氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素 原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。
• 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。
离子交换层析法的原理
• 阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的 高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集 团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有 亲水性。 • 由于阳膜带负电荷,虽然原来的解离正离子受水分 子作用解离到水中,但在膜外我们通电通过电场作 用,带有正电荷的阳离子就可以通过阳膜,而阴离子 因为同性排斥而不能通过,所以具有选择透过性。
实验原理
1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。 2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除 去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。 3. 有机溶剂分步沉淀法纯化
有机沉淀法
• 实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性 磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和 其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心 2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L 醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。
立即混匀后使用台式低速离心机离心 5min(2000 r/min)，弃上清液。
向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液， 充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清 液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％， 混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。 向沉淀中加入4．0m1 0.0lmol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。 向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度 达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去 沉淀
赤子爱胜蚓碱性磷酸酶的分离纯化
１ 实 验 内容
（ ）材 料 １
赤子爱胜蚓（ ￣ｍ ｏ ｉ ａ ｇｇ 由西南师大蚯蚓养殖场提供 。Ｄ Ａ ． Ｅ ｅ ａＦ ｅｄ Ｓ Ｋ ｎ ） ｔａ Ｅ Ｅ纤维 素． ２ ２是 Ｗｈｔａ 产 ａ ｎ ｍ 品 ，ｅｈｄｘＧ一０ Ｇ２０是 Ｐ ａｍａｉ 品 ， Ｓｐａｅ １０， －０ ｈｒ ｃａ产 丙烯 酰 胺 、 Ｎ亚 甲基 双 丙 烯 酰 胺 是 ＢｏＲ． 品 ， 马 斯 Ｎ， 一 ｉ．ａ ｄ产 考 亮蓝 Ｒ２ ０ Ｆｕａ － 是 ｌ 产品 ， ５ ｋ 牛血清 白蛋 白是 Ｓｇ ａ ｉ 产品 ， ｍ 其它试剂均为国产分析纯或生化试剂。高速冷冻 离心机是 Ｋ １０ Ａ型（ Ｒ一 ８ Ｆ 日本 ） 冰冻干燥仪是 Ｎｈｗ Ｉ ２Ｓ型 （ 本 ） Ｌ Ｂ柱层析系统是 Ｐ ａ ａｉ ， ｉ ｏ Ｆ一 ０ 日 ，Ｋ ｈｒ ｃ ｍ ａ ３２ （ ３ 型 瑞典）７ １ ，５ Ｇ型分光光度计是上海分析仪器厂生产 ， 电泳仪是 国产 Ｄ ７ 型 。 Ｙ一 ４
文 章 编 号 ：２ ８２ ２ （ ０ ２ ０ －５ ７０ Ｏ ５ －７４ ２ ０ ）５０ ９ －４
赤 子 爱 胜 蚓 碱 性 磷 酸 酶 的 分 离 纯化
李遂 焰 李 清漪２ ，
（． １西南 交通大学 生物工程 系 ， 四川 成都 ６０３ ； ． 师范大学生命 科学学 院 ， 庆 ４０ １） １０ １ ２西南 重 ０７５
碱性磷酸酶分离纯化方案(优质版)
3.酶原料的选择
选择目的酶丰富的原料，同时考虑原料的来源、取材方便、经济因素。
4.注意分离方法的使用顺序 （1）先用低分辨率的方法 离心、沉淀、过滤等 （2）后用高分辨率方法 离子层析、膜分离、结晶 （3）昂贵、分离规模小的放最后 凝胶层析、亲和层析、HPLC等
一、总活力的回收率 总活力的回收率，反映提纯过程酶活
二、比活力提高的倍数 比活力的提高倍数则反映了纯化方法
力的损失情况；
的效率。
酶活性回收率= 样品酶活力 / 第一次总活力×100%；
纯化倍数= 样品酶比活力 /第一次比活力×100%。
纯化后比活力提高越多，总活力损失越少，则纯化效果越好
分离纯化时，测酶活力
选择阳离子交换剂还是阴离子交换剂？ 主要决定因素：酶的稳定性 目标酶在低于其pI的pH值条件下更稳定，应选用阳离子交换剂； 酶在高于其pI的pH值条件下更稳定，宜采用阴离子交换剂。
酶活力测定
方法：……………..
蛋白浓度的测定
SDS-PAGE
方法：……..
预测结果： 条带清晰且为单一条 带判断为纯蛋白
谢谢
① 防止酶变性失活。一旦酶回收率明显下降，就要考虑换一种纯 化方法； ② 计算纯化效率。通过纯度倍数（酶比活力提高比），评估纯化 效率，寻找最佳方法。
纯化倍数与回收率两者不能兼顾，从表中可看出：
纯度提高1200倍； 酶活力从原来的5000u减至1500u，产率为30%。
1000ml的粗体液，总酶活5000u，经5次纯化，最终获得4ml的纯酶，酶比活从原来的0.416u/mg至500u/mg蛋白，
Ⅲ—02碱性磷酸酶的分离纯化及鉴定
酶工程实验内容实验一碱性磷酸酶的分离纯化一、实验目的1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶简称AKP。
先用低浓度醋酸钠低渗破模作用制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性释出膜中酶过滤后以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33的丙酮或30的乙醇中溶解而在50的丙酮或60的乙酸中不溶解的性质用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
三、仪器、原料与试剂仪器移液管、量筒、玻璃勺浆器管、剪刀、离心机、新华定性滤纸。
原料新鲜兔肝试剂 1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中定容至1000 m1。
2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中定容至1000 m1 3. 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液准确吸取20mL 0.5mol/L 醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L 醋酸钠溶液混匀后定容至1000 m1。
4. Tris—HCl pH8.8缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷12.1g用蒸馏水溶解后定容至1000mL即为0.1mol/LTrls 溶液。
取100m10.1mol/LTrls 溶液加蒸馏水约780mL再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1混匀后用1冰醋酸调pH 为8.8用蒸馏水定容至l000m1。
5. 正丁醇、丙酮、95乙醇均为分析纯试剂。
四、实验操作分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下以下操作均在0-4℃进行将分离提取的碱性磷酸分装成2ml瓶冰冻干燥保存或液体保存也可但均置于-60℃低温冰箱保存。
应用时稀释5—7倍测其Km值。
实验二碱性磷酸酶的动力学鉴定——Km测定一、原理当温度、PH及酶浓度恒定的条件下酶促反应的初速度随作用物浓度S增大而增大但增大到一定限度时作用物浓度再增加则反应速度不再增加。
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5. (1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%
（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上 清于离心管，弃沉淀。 (2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60% （0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清， 沉淀用3ml 0.5M Mg(AC)2溶解,记录体积c。取 0.1ml作为C液于EP管,待测比活性用。
影响有机溶剂沉析的主要因素
• 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率 （溶解度下降）；
• 搅拌速度：散热 • 溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的
电荷，防止共沉现象。（pI） • 离子强度:离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L • 样品浓度: 0.5~2%
稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 • 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+
管号
空白
酶液体
蛋白标准液
Tris-Mg(AC)2 0.1
BCA试剂
1.5
标准 A
B
CD
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
2. 混匀后37℃水浴30min, 562nm比色（小比色杯）
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）酶活性测定
管号
空白
标准 A
B
CD
酶液体
AKP纯化程度鉴定
• AKP纯化程度用酶的比活性反映。 • 酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
(三)碱性磷酸酶的蛋白含量测定
BCA法测定AKP蛋白浓度
BCA (bicinchoninic acid, 二喹啉甲酸)
Protein + Cu2+ OH-
BCA 试剂
Cu+
紫色复合物
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）
碱性磷酸酶
实验目的:
从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验， 培养同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分 光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋 白质的技能。
实验原理：
采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱 性磷酸酶。
AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP 和其他蛋白分离，从而得到纯化。
6.
（1）其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分
数达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min， 取上清（弃沉淀）
（2）上清中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到
50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min，弃上 清 （3）沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶 液。作为D液用于比活性测定。
• 用于活性测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将 A液稀释25倍、B液稀释10倍、 C液稀释5倍，D
液不稀释。 • 用于含量测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将
A液稀释50倍、B液稀释20倍、 C液稀释5倍，D 液不稀释。
(二)碱性磷酸酶的活性测定
实验原理： AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适
酚标准液
Tris-Mg(AC)2 0.1
复合底物
3.0
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
2. 取试管6支编号（体积单位为ml）酶蛋白含量测定
管号
空白
反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度 的AKP。
有机溶剂沉淀
• 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的 有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。
• 原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电
引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的
浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低 了亲水性，导致脱水凝聚。
pH范围为8.8~10, 需要镁离子作为激活剂。 血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
酶的活性通常是在一定条件下（最适温度、最适的pH、必要的激动剂 等），一定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物的 生成量来确定。
AKP
磷酸苯二钠
磷酸盐 + 酚
铁氰化钾 酚 + 4-氨基安替比林
3.滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇， 混匀后3000r/min 5min。弃上清，沉淀 用4ml 0.5M Mg(AC)2溶解。记录体积b。 取0.1ml作为B液于EP管，待测比活性用。
4. (1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%
（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上 清于另一离心管。 (2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60% （0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清， 沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。
常用的有机溶剂沉析剂
• 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋 白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；
• 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用 范围不广；
• 特点：
– 介电常数小: 60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22
– 容易获取
有机溶剂沉析的特点
• 分辨率高； • 溶剂容易分离，并可回收使用； • 产品洁净； • 容易使蛋白质等生物大分子失活； • 应注意在低温下操作；
红色醌类衍生物
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）
管号
空白
酶液体
酚标准液
Tris-Mg(AC)2 0.1
复合底物
3.0
标准 A
B
0.1 0.1 0.1
3.0 3.0 3.0
CD 0.1 0.1
3.0 3.0
2. 加入底物后, 立即混匀, 37 ℃ 准确15 min 后加入0.5%铁氰化钾2.0 ml终止反应, 混匀, 静 置15 min , 510 nm比色（大比色杯）
1.称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合 液4ml, 进行匀浆。转入离心管，并加2ml 0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合 液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积a， 取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。
2.在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇， 玻璃棒搅拌 2min，室温放置30min，纱 布过滤，置于离心管。