碱性磷酸酶的分离提取

(3) 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的
活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才
有效。
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酶活力的分析：通常是以对-硝基苯磷酸二钠 （pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2 mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解 产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在 405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405 nm 值 的增加计算酶活力的大小。
酶活力定义为：在37℃下，以2 mmol/L pNPP为底 物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的 测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定 为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所 具有的酶活力单位数。
蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（Folin-
(8) 取出酶溶液，冷冻高速离心（0℃ 25000 r/m 30 min）。
(9) 离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入 棕色瓶于4℃冰箱保存。
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20 g牡蛎
匀浆液
加入50 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5， 含0.1 mol/L NaCl），于高速组织捣粹机匀浆1 min，于冰箱 4℃放置1 h进行抽提。
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(5) 0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸 铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入， 不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。
(6)室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。
(7) 得到沉淀物，溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测 出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。
管号
01 2 34567
pNP含量 (mol)
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
H2O (mL)
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
Na2CO3-NaHCO3 (mL)
沉淀
溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透
析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被 检测出为止
粗 比活力测定 2.2.1 对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）： 取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。
Phenol reagent）显色法
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2 操作方法 2.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 (1) 每组称取20 g牡蛎（蒸馏水洗净），加入50 mL
预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5， 含0.1 mol/L NaCl），（两组一起）于高速组织 捣粹机匀浆1 min，于冰箱4℃放置1 h进行抽提。 (2) 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液， （两组分开）并量体积。（留2 mL上清液，待 测酶的比活力。）
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2.2.2 酶活力的测定
管号
空白
1
2
3
5 mM pNPP(mL)
各0.2mL
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL
各0.50mL 混匀，37℃，5分钟
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在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变 性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点：
(1) 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开 始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。
(2) 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的 盐。
各管加入1.0 mL
20 mmol/L MgCl2 (mL)
各管加入0.2 mL
0.1 mol/L NaOH (mL)
各管加入2.0 mL
OD 405 nm
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
＝8.80×103( mol/L)-1﹒cm-1 医学PPT
(3) 在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱 和度（100 mL加入20.9 g）。缓慢加入，不断搅 拌溶解，置冰箱静置0.5 h。
(4) 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液， 并量体积。（留2 mL上清液，对0.01 mol/L TrisHCl 缓冲液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl 透析平衡， 待测酶的比活力。（不做））
室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。
上清液
缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。
0.35饱和硫酸铵上清液
加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。
实验 碱性磷酸酶的分离提取 及比活力的测定
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目的要求： 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活
测定的方法
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1.原理
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯 转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。