黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的研究

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突变黑曲霉高产β-葡萄糖苷酶的培养基优化

文章编号：６３１８（（８Ｏ１４Ｏ１７ — ６９２Ｏ）５Ｏ２～４）
突变黑曲霉高产葡萄糖苷酶的培养基优化
许晓鹏。袁士芳刘立明 ¨ ，，
２４２；．江南大学食品学院，苏无锡２４２；．江江１１２３（．江南大学生物工程学院，１江苏无锡１１２２
１５，（．％ＮＨ４２０．，）Ｓ４２ＯＫＨ２０．，Ｔｗｅｎ８．．ｔｅｈｇｅｔｇｕｏｉａｅａｔｉＰ４Ｏ２ｅＯ０１ｈｉｈｓｌｃｓｓｃｉｔｄＶｙ
ｗｅｅａｈｅｅｔ５．６Ｕ／ｔｈｐｉｍｄｕｒｃｉｖｄａ９８ｍＬｗｉｈｔｅｏｔｍｕｍｅｉｍ．
中图分类号：Ｑ２．Ｔ９Ｏ１文献标识码：Ａ
ｏｐｔｍｉａｉｎ０ｌｕｅＭｅｕｆｒＰｒｄｃｎｉｈＧｌｃｓｄｓｉｚｔ０ｆＣｕｔｒｄｉｍ０ｏｕｉｇＨｇｕ０ｉａｅ
ｌ１２南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡２４２）
，
摘要：实验室筛选出产葡萄糖苷酶的黑曲霉进行辐射诱变处理得到高产酶突变菌株，时对同采用单因素和正交实验对黑曲霉产酶培养基进行优化研究。结果表明：经过ｘ射线辐射诱变的黑曲霉产的葡萄糖苷酶活力提高了１．６ｕ／８８ｍＬ。该菌株最适宜产酶的培养基为（质量分数）：

黑曲霉_葡萄糖苷酶的筛选_克隆及表达

15 ( 3 ): 423~426 应用与环境生物学报 2009， Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2009-06-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00423
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及表达*
唐德芳1, 2 裴小琼1 李晓璐1 胡承 2 陈军3** 吴中柳1**
1.6 bgl1基因的克隆和序列分析
将 PCR 扩增产物纯化后连接到 pMD18-T克隆载体上，转化到 E. coli DH5α 感受态细胞 . 筛选得到含bgl1基因的阳性克隆，进行酶切鉴定和送 Invitrogen公司序列测序分析. 序列已保存在 NCBI GenBank，收录号为FJ431207.
反向引物为 FTAR： 5'-TTAGTGAACAGTAGGCAGAGACG-3'. 第一步反转录反应组成为： 1 µ L 10 mmol/L dNTP、1 µ L 2.5 µ mol oligdT Primer、 1 µ L 黑曲霉 FTA-008总 RNA及 7 µ L ddH2O；混合物在 65 °C下处理 5 min后冷却到 4 °C；然后加入4 µL 5×Prime ScriptTM Buffer、 0.5 µL 40 U/µL Rnase inhibitor、 0.5 µL Rtase及 5 µL ddH 2O，混匀后在 42 °C下处理 20 min后冷却到 4 °C. 第二步 PCR反应为50 µL体系，其中含有5 µL 10×PCR buffer、2 µL dNTP (10 mmol/L each)、 10 µmol引物各 0.5 µL、 0.5 µL 5 U/µL TaKaRa Ex TaqTM HS和 5 µL反转录反应液 . 反应条件： 94 °C 30 s； 58 °C 30 s； 72 °C 3 min； 30个循环. PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并用回收试剂盒回收约 2.5 kb片段 .

黑曲霉产β-葡萄糖苷酶液体培养基研究

表明在２０ｍ５Ｌ三角瓶装２ｍ５Ｌ培养、接种种龄为１的种子培养液２５ｍ、ｄ．Ｌ３２℃ 培养５ｄ的培养条件下，其液体发酵较适
产酶培养幕为（Ｖ）：Ｗ／纤维素粉４、％硝酸钾３、％聚乙二醇０１、．％初始ｐＨ为６５这将为ｐ一葡萄精计酶液体发酵的工．，Ｉ化生产和应用提供参考价值。［中图分类号］Ｑ３９６［文献标识码］Ａ［文章编号］０１－９６２０００４１０４２（０７）４— ０９—０４
Ｉｐｉｌｃｍｐｓｔｎｏｕｔｒｄｕｆｒｅｚｍｅｓｃｅｉｎｂｉｕｄ—ｓａｅｆｒｎａｉｎｗｓｃｌｌｓｏｄｒ４，ＫＮ％，ｔｏｔｓｍａｏｏｉｏｆｃｌｅｍｅｉｍｏｎｙｅｒｔｙｌｉｉｕｏｑｔｔｅｍｅｔｔａｅｌｏｅｐｗｅ％ｏｕＯ３３
于各种微生物中，如细菌、菌等；真此外，在动物中也发现该酶的存在。ｐ一葡萄糖苷酶水解由内切葡聚糖酶（ｎｏ—Ｂ一１４一ｇｃ．ｓｓＥ．．．）ｅｄ，１ａａｅ，Ｃ３２１４和纤维二糖水解酶（ｅｏｉｙｍｌｓｓＥ．．．１产生的纤维．ｃｌｂｏｄａｅ，Ｃ３２１９）ｌｈ二糖和低分子量的纤维寡糖，生成葡萄糖，纤维素的分解过程中起重要的作用Ｊ由于内切葡聚糖酶和在。纤维二糖水解酶受纤维二糖的抑制，Ｂ一葡萄糖苷酶活力低的纤维素酶有非常弱的糖化能力。此外，含ｐ一葡萄糖苷酶也能水解其它有重要生理作用的ｐ一葡萄糖苷。因此，ｐ一葡萄糖苷酶进行研究是十分必要对的。到目前为止，对该酶的研究多以木霉为主。但木霉具有产酶慢，酶系比活力不高，普遍存在Ｂ一葡萄糖苷酶活力很低的缺陷，致使纤维二糖积累，影响了酶解效率。有人采用在木霉纤维素酶中添加曲霉的Ｂ一Ｊ葡萄糖苷酶，极大地提高了纤维素酶的降解能力ｊ。在从真菌培养液中筛选Ｂ一葡萄糖苷酶，发现来源于黑曲霉培养液的Ｂ一葡萄糖苷酶具有非常高的活性和稳定性。基于其独特的性质，Ｊ一种简单期

黑曲霉_葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质(1)

安徽农业大学学报,1998,25(3):304-309Journal of A nhui A gricultural U niversity黑曲霉Β-葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质Ξ李　平　宛晓春丁霄霖　陶文沂(安徽农业大学轻工学院,合肥230036)(无锡轻工大学)摘　要　以P-N PG为底物,通过底物浓度、反应温度、反应时间、反应pH的考察,确定了黑曲霉Β-葡萄糖苷酶酶活的最佳测定条件;并对该酶的pH稳定性、热稳定性、米氏常数等进行了研究。

关键词　黑曲霉　Β-葡萄糖苷酶　测定条件　性质分类号　T S20113Β-葡萄糖苷酶能将水果、蔬菜、茶叶等中的风味前体物质Β-糖苷[1]水解为具有浓郁天然风味的香气物质,以改良因加工、贮藏等因素造成对食品感官性状——风味的影响;同时还能协助纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖[2],具有重要的理论和实用价值。

Β-葡萄糖苷酶的测定方法很多,概括起来主要有电化法、荧光法、分光光度法等。

电化法由Gu ilbau lt和K ram er[3]设计,以扁桃苷为底物,根据所产生的氢化物,用与自发(内)电解池相联结的一对银—铂电极来测定其葡萄糖苷酶活性;Rob in son[4]使用4-甲基伞形酮的Β-D葡萄糖苷作为底物,经Β-葡萄糖苷酶作用,专一地分解为具有强烈荧光的4-甲基伞形酮,此荧光法灵敏度高且快速;分光光度法[5]可用水杨苷为底物,将水杨苷裂解为水杨醇和Β-D葡萄糖,然后对所产生的葡萄糖进行比色测定;也可用熊果苷(Β-D-葡萄苷-对苯二酚)作为底物,对产生的葡萄糖可用碘量法加以测定;另外还可用对-硝基苯基-Β-D-葡糖苷(P-N PG)为底物,对产生的对—硝基苯进行比色测定。

本试验采用P-N PG为底物的比色测定法,该法简单、快速、灵敏度高[6],且所需仪器常见。

1　材料与方法111　材料菌种:黑曲霉,来源于无锡轻工大学。

培养基:斜面保藏培养基,PDA;发酵培养基,麸皮3%,(N H4)2SO4012%,另加适量无机盐溶液。

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的活性位点和耐热结构预测

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的活性位点和耐热结构预测闫青，朱凤妹，彭利沙，王翔，张永祥，李军*（河北科技师范学院食品科技学院，河北秦皇岛 066000）摘要：以黑曲霉3.316基因组DNA 扩增得到大小为2 080 bp 的β-葡萄糖苷酶基因为研究对象，通过生物分析软件分析得出其可能含860 个氨基酸残基，存在4 个主要疏水区；其二级结构可能含有63.26%无规则卷曲、20.58% α-螺旋、16.16% β-折叠；发现其结构域具有（β/α）8 TIM 桶域和（β/α）6夹层三明治域及纤维连接蛋白的Ⅲ-like 域；根据β-葡萄糖苷酶相关结构预测其活性位点和耐热机理，发现其活性位点可能是（β/α）8 TIM 桶域的Asp280和（β/α）6 夹层三明治域的Glu509；211 个位于疏水区的氨基酸残基、48 个脯氨酸残基和α-螺旋可能与其热稳定性相关。

关键词：β-葡萄糖苷酶；活性位点；耐热结构；黑曲霉Prediction of Active Site and Thermostability-Associated Structure of β-Glucosidase from Aspergillus nigerYAN Qing, ZHU Fengmei, PENG Lisha, WANG Xiang, ZHANG Yongxiang, LI Jun *(College of Food Science and Technology, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao066000, China)Abstract: The genomic DNA extracted from Aspergillus niger 3.316 was used as template to amplify the β-glucosidase gene bgl by PCR to obtain a 2 080-bp amplicon. Bioinformatic analysis showed that the encoded protein was predicted to contain 860 amino acid residues with 4 major hydrophobic regions. Its secondary structures might contain 63.26% random coils, 20.58% α-helix, and 16.16% β-sheet. The protein consisted of (β/α)8 TIM barrel domain, (β/α)6 sandwich domain, and fibronectin Ⅲ-like domain. The active site and heat tolerance mechanism were predicted to be located in the active center of the enzyme. Its active sites might be Asp280 of (β/α)8 TIM barrel domain and Glu509 of (β/α)6 sandwich domain. The thermal stability of the glucosidase might be related to the presence of 211 amino acid residues in the hydrophobic region, 48 proline residues and α- helix.Key words: β-glucosidase; active site; thermostability-associated structure; Aspergillus niger DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706013中图分类号：TS201.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2017）06-0081-07引文格式：闫青, 朱凤妹, 彭利沙, 等. 黑曲霉β-葡萄糖苷酶的活性位点和耐热结构预测[J]. 食品科学, 2017, 38(6): 81-87. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706013. YAN Qing, ZHU Fengmei, PENG Lisha, et al. Prediction of active site and thermostability-associated structure of β-glucosidase from Aspergillus niger [J]. Food Science, 2017, 38(6): 81-87. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706013. 收稿日期：2016-06-12基金项目：国家自然科学基金面上项目（31570374；31470542）；河北省自然科学基金项目（C2015407059）作者简介：闫青（1989—），女，硕士，研究方向为食品生物学。

黑曲霉胞外耐高糖β-葡萄糖苷酶的分离纯化及部分特性研究

Ｓｐａｒｌ－０ｅｈｃｙＳ２０凝胶过滤层析等步骤，黑曲霉的发酵液中获得了凝胶电泳均一的两种一从葡萄糖
苷酶。其中一种为耐高糖的口葡萄糖苷酶，萄糖抑制系数（ｉ为４．１ｍｏＬ纯化倍数和得一葡Ｋ）１０ｌ，ｍ／
部分特性研究
赵林果，游丽金，鹏，孟余世袁
（南京林业大学化学Ｘ程学院，江苏南京２０３）－１０７盯林
Ｖ
摘
要：采用硫酸铵盐析、ｈｎｌｅｈｒｓＬ４ＰｅｙＳｐａｏｅＣ一Ｂ疏水层析、ＥＥＳｐａｏｅ阴离子交换层析、ＤＡ－ｅｈｒｓ
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第２７卷第６期２００７年１２月
与工业
ｏｒｓｒｄｃｓｆＦｏｅｔＰｏｕｔ
Ｖｏ．．１２７Ｎபைடு நூலகம் ６Ｄｅｃ２０７．０
黑曲霉胞外耐高糖一萄糖苷酶的分离纯化及葡
中图分类号：Ｑ２Ｑ５Ｔ９；８文献标识码：Ａ文章编号：２３—２１（０７００４００５４７２０）６— ０１— ６
ＳｕｙｏｕｉｃｔｎａｄＳｍｅＰｏｅｔｓｏＨｉｈｙＧｌｃｓ —ｏｅａｔｔｄｎＰｒｆａｉｎｏｒｐｒｉｆＡｇｌｕｏｅｔｌｒｎｉｏｅ
产
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ｄ
一
ＺＨＡＯｎ—ｕｏＬｉｇ
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１０￣ｏｍｉ。该酶最适反应温度６Ｃ，．８ｐｌｎｍ／０ｑ最适反应ｐＨ值为４０在６．；０ｑＣ以下及ｐＨ值３— ７范围内均能保持稳定。所

黑曲霉(As.n.XD—1)β—葡萄糖苷酶产酶条件研究

０８ｙａｔｘｒｃ，３ｔｓｏｔｒｎｔｌａｕａＨａｕ，ａｄｆｒｎａｉｎａ８ｆｒｄ．％ｅｓｔａｔｉｆｅ，ｉｉａｔｒｌｅｍｅｗａｉｎｐｖｌｅｎｍｅｔｔｔ ℃ ｏ．Ｕｎｅｅｅｅｏ２４ｄｒｈｓｔ
ｍｅｔｉｎａｅｕｔｌｗｙｆ一ｇｕｏｉａｅｒｄｃｉｎｅｅｒｏｓｆａａｓ，ｒｏｓｆｈａｂａ，ｎａｏｓｈｉｂｅａｔｗｔｓａｏ１ｌｃｓｓｏｕｔｒｐｔｎｂｇｓｅ３ｏｔｎｗｅｔｒｎ３ｄｐｏｗ２ｏｉｏｐ栀子蓝色素的技术关键。１２方法．
．．作者从森林腐木下的土样中筛选到了具有较高Ｂ一葡１２１培养条件斜面培养为３℃ 培养３０ｄ后，于 ℃保藏；酵培养时间为２ ℃ 培养４。发８ｄ萄糖苷酶活力的黑曲霉（ｓｅｇｌｓｉｅ）株，号为４Ａｐｒｉｕｎｇｒ菌ｌ编Ａ．．Ｄ一１ｓｎＸ。作者对其产酶条件进行了研究，现将研１２２粗酶液的提取产酶培养基发酵培养后，按．．究结果报道如下。
ｃｎｉｏｓｈａｔｉｆｏｄｔｎ，ｔｅｃｉｔＢ—ｇｕｏｉａｅｏｌａｈｄ２．６ｍ１ｉｖｙｏｌｃｓｄｓｃｕｄｒｃｅ３８Ｕ／．ｅ
ＫｅｒｓｙｗｏｄＡｓｅｇｌｓｉｅｐｒｉｕｇｒｌｎＢ —ｇｕｏｉａｅｌｃｓｄｓＰｏｕｅｏｄｔｎｒｄｃｄｃｎｉｏｉ

黑曲霉改良株C112产β-葡萄糖苷酶的诱导及条件优化

ｎｉｇｅｒＣ１１２ｆｏｒｌｆ＿ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ．Ｍａｎｙｆａｃｔｏｒｓａｆｅｃｔｅｄｔｈｅｆｅｍｅｒｎｔａｔｉｏｎｏｆｐ — ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ（ｔｈｅｖｉｔａｌｉｔｙｏｆ
关键词：黑曲霉；发酵Ｂ一葡萄糖苷酶；条件优化；麦芽浸粉中图分类号：￥７１８．４３；￥７１８．５２１．３文献标志码：Ａ文章编号：１６７３ — ９２３Ｘ（２０１３）１１－０１５４．０８
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｂｙ
ｓｔｒａｉｎｓ），ｉｎｏｃｕｌｕｍｃｏｎｃｅｎｒａｔｔｉｏｎ，ｙｐｔｅａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃａｒｂｏｎｎｄａｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｎｄａｉｎｉｔｉａｌ
摘要：利用单因素实验及均匀设计法研究了黑曲霉Ｃｌ１２发酵产Ｂ．葡萄糖苷酶的发酵条件。结果表明：黑曲霉

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ｔｅｙｈ３ｇｕｏｉａｅｗｓｓａｌｕｄｒ４ｉｌ．Ｔｅ／一ｌｃｓｄｓａｔｂｅｎｅ０℃ ａｄｉｈｎｉｏｍｅｔｐｖｕｆ．－．ｖｎｎｔｅｅｖｒｎｎＨａｅｏ０５０．ｌ３Ｋｅｒｓｓｅｇｌｕｉｅ；ｇｕｏｉａｅｗｈａｒｎｙｗｏｄ：Ａｐｒｉｉｓｎｇｒ口一ｌｃｓｄｓ；ｅｔａｌｂ
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ｗｓｂａｎｄｆ０ｄｙｃｌｖｔｎＴｅｐｉａｔｅａｒａｄｐａｕｆ一ｕｏｉａｅｒａｔｎｗｓ５℃ ａｄ４８ｒｓｃａｔｅｒ１ａｓｕｔａｉ．ｈｔｌｅｒｔｅｎＨｖｅｏ／ｇｃｓｓｃｏａｏｉｏｉｏｏｍｍｐｕｌ３ｌｄｅｉ６ｎ．．ｅｐ－ｅ
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第４２卷第５期
２００８年９月
生物质化学工程
ＢｉｍａｓＣｈｍｉａｇｎｅｉｇｏｓｅｃｌＥｎｉｅｒｎ
Ｖｏ．２Ｎｏ５１４．
Ｓｐ．２０８ｅ０
ａｐｒｎｅｚｍｔｒｐｒｅｆ８ｇｕｏｉａｅｗｒｖｓｇｔ．Ｗｈａｂａａｈｐｉｌｉｄｃｒｏ一ｌｃｓａｅａｏｇｐａｅｔｎｙａｉｐｏｅｔｓｏ一ｌｃｓｓｅｅｉｅｔａｄｃｉｄｎｉｅｅｔｒｎｗｓｔｏｔｎｕｅｆｇｕｏｉｓｍｎｅｍａ８ｄ
（ｏｌｅｏｈｍｃｌｎｉｅｒｇＮｍｎｏｅｔｎｅｓｙＮｍｉ１０７ｈｎ）ＣｌｇｆｅｉａＥｇｅｎ，ａｉｇＦｒｓｙＵｉｒｉ，ａｎ２０３，ＣｉａｅＣｎｉｒｖｔｇ
Ａｂｔａｔｈｆｃｓｏｕｔｒｏｄｔｎ０・ｌｃｓｄｓｒｐｒｔｎｂｓｅｇｌｓｎｒｉｕｍｅｇｄｆｒｎａｉｎａｄｔｅｓｒｃ：Ｔｅｅｆｔｆｃｌｕｅｃｎｉｏｎ０ｇｕｏｉａｅｐｅａａｉｙＡｐｒｉｕｎｓｂｒｅｅｍｅｔｔｎｈｅｉｏｌｏ
口葡萄糖苷酶的较适诱导物。黑曲霉Ｎ０一Ｌ２以４／０ｇＬ麸皮为碳源，２０ｍ在５Ｌ三角瓶中装液４，０ｍＬ接种量８％，始ｐ初Ｈ值５５３．，０℃ 、７ｍｉ１０ｒｎ下培养１，一／０ｄ卢葡萄糖苷酶活力为１．２Ｉ／。卢葡萄糖苷酶最适温度为６９１ｍＬ一ｕ５℃ ，ｏ℃ 时稳４
Ｐｅａａｉｎｏ／Ｇｌｃｓａｅｂｓｅｇ／ｓｎｇｒｉｕｍｅｇｄＦｒｎａｉｎｒｐｒｔｆ３ｕｏｉｓｙＡｐｒ／ｕ／ｅＳｂｒｅｅｍｅｔｔｏ一ｄ／ｎｏ
ＬＵＭｉ，ＵＡＧ— ａＹＮｉｎ，ＵＳｉｕｎＩｎＯＹＮＪ，ＯＧＱａｇＹｈ— ａｉｙ
一
葡萄糖苷酶（Ｃ３２１２）纤维素酶系Ｅ．．．１是
的主要组分，其在纤维素水解过程中的作用是将纤维素经内切葡聚糖酶（Ｃ３２１４）外切葡Ｅ．．．和聚糖酶（Ｃ３２１９）用产生的纤维低聚糖和Ｅ．．．１作纤维二糖水解成葡萄糖Ｊ除了纤维素糖化外，。Ｊ葡萄糖苷酶还广泛应用于食品、造、料、Ｂ一酿饲纺织、造纸和农业等领域。虽然自然界中大多数能够分泌纤维素酶的微生物也能合成Ｊ葡萄糖Ｂ一
黑曲霉液体发酵制备一萄糖苷酶的研究葡
刘敏，阳嘉，勇强欧，余世袁
（南京林业大学化学工程学院，江苏南京２０３）１０７
摘
要：究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备｜葡萄糖苷酶的影响及一研Ｂ一葡萄糖苷酶的表观酶学性质。麸皮是黑曲霉
定性较好；适ｐ值为４８在ｐ值３０～．最Ｈ．，Ｈ．５０之间稳定性较好。
关键词：曲霉；一萄糖苷酶；皮黑葡麸
中图分类号：Ｑ１Ｑ５Ｔ９；５
文献４１７５５（０８０００ｏ