葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法

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银杏叶中α-葡萄糖苷酶抑制剂的超滤质谱筛选

技发展计划重点项目（批准号：２０１１０９２８）资助．
联系人简介：刘志强，男，博士，研究员，博士生导师，主要从事天然产物质谱及中药活性成分筛选方面的研究．
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｚｑ＠ｃｉａｃ．ｊｌ＿ｃｎ
０６５７．６３文献标志码Ａ中图分类号
一
葡萄糖苷酶抑制剂是２０世纪７０年代开发的一类新型口服降血糖药物，能竞争性抑制小肠内
一
葡萄糖＝奇酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道内的吸收，有效降低餐后高血糖，已被广泛用于糖尿黄酮类化合物因具有广泛的药理活性，已成为药物化学研究的热点与重点．黄酮类化合物发挥抗
Ｖｏ１．３４
高等学校化学学报
ＣＨＥＭＩＣＡＬＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＨＩＮＥＳＥＵＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ
Ｎｏ．４
８１３～８ｌ８
２０１３年４月
ｄｏｉ：１０．７５０３／ｃｊｃｕ２０１２１０９８
质谱联用技术对结合的未知小分子进行分离和鉴别．该方法具有快速、灵敏和高通量的特点．本研究选择一葡萄糖苷酶作为药物靶点，利用体外酶活性测定方法对富含黄酮类成分的５种中药（刺五加叶、黄芩、葛根、甘草和银杏叶）提取物的一葡萄糖苷酶抑制活性进行了测定．采用超滤质谱技术从活性最强的银杏叶提取物中筛选潜在的一葡萄糖苷酶抑制剂，并利用ＬＣ — ＭＳ技术对筛选出的活性成分进行结构鉴定，共筛选得到４种一葡萄糖苷酶抑制剂，经结构鉴定分别为槲皮素、芹菜素、山奈酚和异鼠李素．

α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法

参考文献
[1]Ma C M, Hattori M, Daneshtalab M, et al. Chlorogenic acid derivatives with alkyl chains of different lengths and orientations: potent alpha-glucosidase inhibitors[J]. J Med Chem, 2008,51(19):6188-6194.
（6）0.2mol/L的Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。
2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制
精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的标准溶液。取100μl上述标准液，各加入150μL 0.2mol/L的Na2CO3，混匀1 min，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程：y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中y为浓度，x为吸光值。
2.2.1.3α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
测定方法参照Masao Hattori等试验条件，并做调整。实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。按表依次加入PBS缓冲液、抑制剂溶液和底物，混合均匀，于37℃水浴保温10min，结束后，取出，加入37℃水浴的酶溶液，充分混匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入150μL 0.2mol/L的Na2CO3溶液中止反应。由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，PNP在405nm处有最大吸收，其测定其吸光度，根据公式便可计算出各样品α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50值。

α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展

α2葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展厦门市第一医院(361003)　张文婷　综述　方青枝　审校【中图分类号】R97711+5　【文献标识码】A　【文章编号】100222600(2009)022******* 糖尿病是一种多病因引起、以高血糖为特征的内分泌代谢紊乱性疾病。

高血糖是由胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗,或二者共同存在而引起。

世界上,糖尿病患者已超过117亿,已成为继心血管疾病和肿瘤之后第三大严重威胁人类健康的非传染性疾病[1]。

临床上,根据糖尿病发病机制不同,主要分为1型糖尿病(胰岛素依赖型)和2型糖尿病(非胰岛素依赖型),我国以2型居多。

治疗2型糖尿病的药物主要分为:(1)胰岛素及类似物:如赖脯胰岛素等;(2)促胰岛素分泌剂:如磺酰脲类;(3)胰岛素增敏剂:如噻唑烷类衍生物;(4)α2葡萄糖苷酶抑制剂:如阿卡波糖等。

本文就α2葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展作一综述。

1　α2葡萄糖苷酶抑制剂的作用机制α2葡萄糖苷酶主要由唾液和胰液中α2淀粉酶及小肠刷状缘上皮细胞上的麦芽糖酶、异麦芽糖酶、α2临界糊精酶、蔗糖酶和乳糖酶等组成。

食物中的碳水化合物,如淀粉先经α2淀粉酶水解成麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖和α2临界糊精等,食物在口腔中停留时间短,所以该过程主要在小肠内进行。

而后,寡糖经小肠刷状缘上皮细胞上各种酶的作用生成葡萄糖及其他单糖,经小肠黏膜细胞吸收而被机体利用。

2型糖尿病患者因胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或二者的共同作用,血液中的葡萄糖进入肝、肌肉和脂肪等组织细胞及在细胞内的氧化利用发生障碍,同时,肝糖输出增多导致高血糖。

由于血糖水平超过肾小管吸收葡萄糖的能力,部分血糖随尿排出而形成糖尿病。

因此,可以通过降低α2葡萄糖苷酶活性,限制或延缓碳水化合物在消化道内分解,达到预防和治疗这类疾病[2]。

α2葡萄糖苷酶抑制剂的结构类似寡糖,能够在寡糖与α2葡萄糖苷酶的结合位点和α2葡萄糖苷酶竞争性结合,抑制酶的活性,减少寡糖分解,从而延缓肠道对单糖特别是葡萄糖吸收,避免了餐后可能发生的血糖过高。

11101054α-葡萄糖苷酶抑制剂

血糖浓度高时刺激胰岛素分泌，但在低血糖期则不会，可以使葡萄糖水平和餐后胰岛素反应正常化，其缺点是必须注射，而长期皮下注射可降低体重。
药物类别
作用机理
药物效果与副作用
噻唑烷二酮类化合
本类药因能增强胰岛素的作用，纠正糖及物，如曲格脂质代谢异常，降低列酮、罗格空腹及餐后血糖井能改善高糖毒性，治疗列酮时不引起体
1.糖尿病及其治疗
1.1 糖尿病的分类 • 胰岛素依赖型糖尿病(I型) 约占糖尿病患者的10% • 非胰岛素依赖型糖尿病(Ⅱ型) 约占90%
1.2 糖尿病的治疗 • I型糖尿病是由于胰岛受损或先天缺陷引起的，对这类患者只能通过补充胰岛素（如肌肉注射或口服）的方式加以治疗，但久用此类药物会加速胰岛组织的老化，损害身体各种器官，诱发并发症。 • Ⅱ型糖尿病(NIDDM）治疗的长期目标是长期稳定血糖使其处于正常水平，防止各种并发症。理想的血糖水平是3.35.6mmol/L，餐后血糖水平不超过10mmol/L[6]。目前常用食疗，口服降糖药或胰岛索治疗，见表1。
•
基于上述优点,第二代酶-抑制剂筛选模型是一种行之有效的筛选方法。虽然早已有从人胰腺和唾液中成功分离纯化出α-淀粉酶的报道,但由于其材料来源有限,无法形成规模化生产,价格极其昂贵。因此,近年来的以淀粉、蔗糖、麦芽糖为底物的酶-抑制剂筛选模型所使用的α-淀粉酶大多为猪胰型酶,蔗糖酶、麦芽糖酶等,其他α-葡萄糖苷酶大多来源于酵母。猪、酵母的遗传型存在的差异造成它们所表达的酶也必然有差异。这一事实使该筛选模型无法做到与糖尿病患者体内情况完全一致,也无法直接评价α-GI的体内药效,最终还需要高血糖动物做药理试验研究。
高血糖动物筛选模型
• 思路:首先构建高血糖动物模型,然后将待筛样品注射或灌胃该动物模型,通过观察动物血糖浓度的变化评价该样品的药效作用大小,最后进行作用机制和作用靶位的研究。其主要包括四氧嘧啶、肾上腺素、氨基葡萄糖等所致的动物高血糖模型和原发性糖尿病小鼠(NOD小鼠)模型。 • 采用该筛选模型筛选药物的突出困难是:实验周期长,耗资大[15]、化合物用量大、难度大,无法做到同时进行上百种中草药或其成分筛选, 更不能阐明其作用的有效成分及作用特定靶点。但具有检测方法比较深入细致、结果相对可靠等优点。因此基于高血糖动物模型的方法不太适合大量筛选的要求,但可用于进一步的生物活性验证。

α-葡萄糖苷酶抑制剂产生菌的分离鉴定及其生物活性研究

一
葡萄糖苷酶抑制剂（—ｌｃｓａｅｉｈｂｔｒ是ｇｕｏｉｓｎｉｉ）ｄｏ
ｃ葡萄糖苷酶抑制剂主要来源于微生物代谢产ｃ一
一
种糖苷水解酶抑制剂，它能够抑制人体小肠上皮
物［ｌｚ、天然产物［］化学合成产物【。但由于其化－５６和．ｓ９】
中国抗生素杂志２１年１月第３卷第１期００１５１
８ｌ３
文章编号：１０ —６９２１）１８１００１８８（００１－３ —４０
．葡萄糖苷酶抑制剂产生菌的分离鉴定及其生物活性研究］Ｅ．
杨明琰１田稼２马瑜２黄继红２ａｍｂｅｆＳｔｅｏｒｏｒｐｔｍｙｃｓＣｏｎｌｉｎＴｈｓｓｒｅｎｇｍｅｈｏＳｓｍｐｌｎｅｉｂｌ，ｎｄｓａｎＤ００ｅ．ｅｕｓｏｉｃｅｎｉｔｄｉｉｅａｄｒｌａｅａｔｉ４６ｒｍａｈａｅｈｇｔｎｔａｈｒａｅｉａｌｐａｉｎｓＳｆｅｉｇｆｏｄａｔｓｙｖｉｈｐｏｅｉｌａｍｃｕｔｃｌｕｅｉｐｖａｎｔｅｔＵｒｎｍｉｂｅｅ．ｒＫｅｒｓ０ａｖｗｏｄ【ｍｙｌｓｈｉｉｏ；ｃｕｏｓｄｓｎｉｉｏ；ＳｒｅｎＩｎｉｃｔｏＳｒｐｔｍｙｃｓ一ａｅｉｂｔｒｃ．ｃｉａｅｉｂｔｒｃｅｎｉｇ；ｄｅｔｆａｉｎ；ｔｅｏｎｇｌｈｉｅ

中药中a-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选及其抑制动力学研究的开题报告

中药中a-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选及其抑制动力学研究的开题报告一、选题背景和意义a-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）是在消化系统中参与糖类分解与吸收的一种重要酶类，在人体内发挥着重要的作用。

过量的α-葡萄糖苷酶活性会导致血糖升高，出现糖尿病等代谢性疾病。

因此，寻找植物中的a-葡萄糖苷酶抑制剂，能有效抑制糖类的吸收，降低人体血糖含量，对预防和治疗糖尿病等相关疾病具有潜在的治疗价值。

中药中的化学成分种类多样，其中一部分化合物被发现有能够抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。

为了寻找中草药中的a-葡萄糖苷酶抑制剂，本研究将从中草药中筛选可能具有抑制α-葡萄糖苷酶活性化合物，探讨其抑制动力学，为中草药的开发利用提供理论依据。

二、研究内容和方法本研究将从中草药中筛选可能具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的化合物，利用体外酶活测定方法对其抑制活性进行评价。

抑制活性强的化合物将进行进一步的抑制动力学研究，包括计算抑制常数（Ki）、测定酶活性对抑制剂浓度的响应曲线和半最大抑制浓度（IC50）等实验。

研究方法如下：1. 筛选活性化合物：选用常见的中草药材，按照常规提取方法制备中药提取物，利用体外酶活测定方法对其抑制α-葡萄糖苷酶的活性进行筛选。

2. 抑制动力学研究：确定活性化合物的IC50值，测定其对酶活性的影响曲线，计算Ki值，探讨其抑制动力学特性。

三、预期结果本研究预计通过对中药提取物进行筛选，得到数种具有较强抑制α-葡萄糖苷酶活性的化合物。

通过实验确定这些化合物的抑制动力学特性，包括IC50、Ki等参数，为进一步开发和利用这些化合物提供理论依据。

同时，本研究将从中草药提取物中筛选出具有降低血糖作用的化合物，为糖尿病等代谢性疾病的治疗提供科学依据。

四、研究进度安排第一年：1. 确定实验方案，搜集相关文献，制定实验计划；2. 提取中药提取物，进行a-葡萄糖苷酶体外酶活测定，并初步筛选出具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的化合物；3. 将抑制活性较强的化合物选择出来，并进行抑制动力学研究。

α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选方法的研究

Ｄａｉｎ１１０３ＬｉｏｉｇＣｈｎ；．ｔｔｙＬｂｒｔｒｆｗ—ｔｃｒＣｈｎｓｅｉｉｅＰａｍａｅｔｃｌｏｅｓｌａ６４，ａｎｎｉａ３ＳａｅＫｅａｏａｏｏｙＮｅｅｈｆｉｅｅＭｄｃｎｈｒｃｕｉａｃｓ．ｏＰｒ
食品研究与开发
生物工程
ＦｏｄＲｅｅｒｈＡｎｖｌｏｎｏｓａｃｄＤｅｅｏｍｅｔ
２１０２年８月
第３卷第８ｌ３期７１
一
葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选方法的研究
朱文佳１寇自农２曦付绍平朱靖博ｌ，萧伟，，张，，Ｉ，ｌ４
Ａｂｔａｔｓｒｃ：Ａｏｅｃｅｎｎｔｏｒｅ－ｇｕｏｉａｅｉｈｂｔｒａｅｎｅｔｂｉｈｄｂｎｖｌｓｒｅｉｇｍｅｈｄｆ￣ｌｃｓｄｓｎｉｉｏｓｈｓｂｅｓａｌｓｅｙＨＰＬｎｖｔｏＴｈｏＣｉｉ．ｅｒｅｚｍａｉｃｉｉｉｓｏ－ｌｃｓｄｓｒｅｅｍｉｅｙｍｏｉｒｎｈｅｅｓｆＰＮＰｆｏｔｅｓｂｔａｅｎｙｔａｔｖｔｅｆｃｇｕｏｉａｅｗｅｅｄｔｒｎｄｂｎｔｉｇｔｅｒｌａｅｏｏｒｍｈｕｓｒｔＰＮＰＧ．Ｉｏｄｒｏｍｐｏｅｔｅｅｅｔｏｓｎｉｖｔ，ｔｅｏｄｔｎｏｎｙｅ— ａａｙｅｒａｔｎ．ｎｒｅｔｉｒｖｈｄｔｃｉｎｅｓｔｉｙｈｃｎｉｉｓｆｅｚｍｉｏｃｔｌｚｄｅｃｉｗｅｅｏｒｏｔｚｄｐｉｅ．ＡｃｒｏｅｗａｓｄｔａｉａｅｔｅｅｔｂｉｈｄｍｅｈｄＴｅｒｓｌｓｓｏｄｔａｈＣ５ｖｌｅｆ — ｍｉａｂｓｓｕｅｏｖｌｄｔｈｓａｌｓｅｔｏ．ｈｅｕｔｈｗｅｈｔｔｅＩ０ａｕｓｏｇｕｏｉａｅｉｈｂｔｒｃｉｉｅｆＡｃｒｏｅｗａ．７ｍｇｍＬ．Ｗｈｃｓｃｏｅｏｔｅｅｐｒｍｅｔｌｄｔｌｃｓｄｓｎｉｉｏｓａｔｔｓｏａｂｓｓ２０／ｖｉｉｈｗａｌｓｄｔｈｘｅｉｎａａｅｒｐｒｅｎｌｔｒｔｒｓＳｈｓｍｅｈｄｃｕｄｂｓｄａｎａｔｒａｉｅｏａｉｏａｔｏｆｒｍｂｙ，ｎｔｅｏｔｄｉｉａｕｅ．ｏｔｉｔｏｏｌｅｕｅｓａｌｅｎｔｆｔｄｔｎｌｅｖｒｉｍｅｈｄｏＴｅｌａｄｉｃｕｄｂｓｄｉｅｈｇ —ｔｒｕｈｐｔｓｒｅｉｇｏ一ｌｃｓｄｓｎｉｉｒ．ｏｌｅｕｅｔｉｈｈｏｇｕｃｅｎｎｆｇｕｏｉａｅｉｈｂｔｓｎｈｏＫｅｒ：０一ｌｃｓｄｓｎｉｉｏｓＨＰＬｓｒｅｉｇｍｏｅ；ｉｂｔｓｍｅｌｔｓｅｚｍｅｋｎｔｃｙｗｏｄｓ【ｇｕｏｉａｅｉｈｂｔｒ；Ｃ；ｃｅｎｎｄｌｄａｅｅｌｉ；ｎｙｉｅｉｓｕ

山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制活性因子的筛选(Ⅱ)

ＭＡＱｎ —ｉ，ＣＮＬ—ｕ，ＹＡＮＧＨａ－ａｉｇｙＨＥｉａ，ｈｉｎ，ＷＡｎ－ｎｙＮＧＱｉｇｌｇｉ
（．ｏｌｇｆｏｄａｄＢｏｏｉａＥｇｅｒｇＺｅｇｈｕＩｓｔｔｏｉｈｄｓｙＺｅｇｈｕ１ｌｅｏｏｉｌｇｃｌｎｉｅｉ，ｈｎｚｏｔｕｅｆｇｔｎｕｔ，ｈｎｚｏＣｅＦｎｎｎｎｉＬＩｒ２ＣｌｇｆｈｍｓｙａｄｈｍｃｎｉｅｒｇＰｎｄｎｓａｉｅｓｙＰｎｄｎｓａ．ｏｅｅｅｉｔｅａＥｇｎｅｉ，ｉｇｉｇｈｎｌｏＣｒｎＣｉｌｎＵｎｖｒｔ，ｉｇｉｇｈｎｉ４００，ｈｎ；５０２Ｃｉａ４７０，ｈｎ）６００Ｃｉａ
玉米的深加工和Ｓ０Ｄ应用奠定了基础。
关键词：山茱萸；ｃ葡萄糖苷酶抑制剂；皂甙；鞣质；非竞争性；竞争性ｃ一
ｎ口
寸＿
Ｓｒｅｉｇｏ【ｕｏｉａｅＩｈｂｔｒｏＣｒｎｆｃａｉ（Ｉｃｅｎｎｆ０一ｃｓｓｉｉｓｒｍｏｕｓｏｉｌＩ）Ｇｌｄｎｏｆｆｎｓｉ
摘要：山茱萸皂甙和鞣质的酶抑制动力学反应结果表明，皂甙和鞣质对ｃ葡萄糖苷酶有良好的抑制活性，皂ｃ一
甙的Ｉ５和ｌｉＣｏ（分别为０４２／和１５ｍｇｍｌ．８ｍｇｍｌ．ｌ／，而鞣质的ＩｏＫｉ０Ｃ５和分别为０２０／和０１８／，皂甙对热．２ｍｇｍｌ．４ｍｇｍｌ稳定，属于非竞争性抑制剂，鞣质对热不稳定且属于竞争性抑制剂。

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葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法
α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。

其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。

α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。

经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。

吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。

设不加样品时，测得的吸光度为c0, 加样品后测的吸光度为c1. 那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。

一实验试剂：
α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖) 均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等, 均为分析纯。

水为超纯水。

苦瓜提取物。

二实验器材：
Bio Tek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器
三实验方法：
（一）试剂配制
（1）pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液
分别配制0.1 mol/L Na2HPO4和KH2PO4(13.6 g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH 值至6.8即得0.1 mol/L磷酸缓冲液
（2）用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制0.26 U/mlα-Glucosidase
（3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml) （4）反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3。

（5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml 的浓度。

（二）实验方法
1. 各浓度药液按每孔50 μL加入酶标板，每浓度设三复孔。

另设一药物对照孔、空白反应孔及空白对照孔。

然后向药物反应孔和空白反应孔加入50 μL 0.26 U/mL的 -葡萄糖苷酶，其他组加50 μL 磷酸缓冲液，经此步骤后，各孔的组成为：
药物反应孔：50 μL药液+ 50 μL酶
药物对照孔：50 μL药液+ 50 μL磷酸缓冲液
空白反应孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL酶
空白对照孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL磷酸缓冲液
上述反应体系在微型振荡器上震荡30秒，置于恒温37 o C水浴中孵育10min。

2. 每孔加100μl底物（5mmol/L的PNPG, 15mg 配成10ml）后，在微型振荡器上震荡30s，在恒温水浴锅中37℃孵育20min。

3. 每孔加入100μl 0.2 mol/L Na2CO3终止反应(1.06 g 配成50 ml)。

在酶标仪405nm处测定OD值。

4. 计算公式：抑制率（%）=[1- (药物反应孔OD值-药物对照孔OD值)/（空白反应OD值-空白对照OD值）]×100
每个样品活性测试三次，活性结果去平均值，并计算相对标准偏差。

通过相对标准偏差来反应实验的重复性和精密度，偏差越小，说明实验重复性和精确度越好。