平板划线法分离菌种
平板划线法知识讲解
平板划线法实验三菌种的分离纯化技术——平板划线法实验目的了解平板划线分离纯种的原理，并熟练掌握该操作法。
实验内容1．培养基平板的制备。
2．用平板划线分离法分离混菌。
实验原理平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D 区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。
为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。
实验器材大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合菌悬液牛肉膏蛋白胨培养基无菌培养皿，水浴锅，接种环等。
实验步骤1．融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
2．倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。
如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。
左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
3．作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。
各区之间的交角应为120℃左右（平板转动一定角度约60℃），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。
目的：检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致，并检查是否染有杂菌。
原理：将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养，以检查菌落形态以及是否染有杂菌。
内容：1 材料1．1 材料1．1．1 菌种：PBV888/DH5α，来源于主种子批或工作种子批。
1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。
1．1．3 药品氯化钠 NaCl 分析纯琼脂粉分析纯酵母粉蛋白胨无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯1．1．4 器皿平皿、三角烧瓶（3L）、量筒（1L）、玻棒、试剂瓶。
1．1．5 其它材料线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。
1．2 仪器设备生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂扭力天平 TN-100B型上海第二天平厂2 方法2．1 准备工作2．1．1 生产环境：在十万级洁净间进行。
场地摘下“清场合格”标志牌，挂“使用中”标志牌。
2．1．2 器皿的洁净要求玻璃器皿经洗刷组处理完毕后，用硫酸纸及牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃60分钟）。
脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，高压灭菌121.3℃60分钟。
2．1．3 调试仪器设备2．1．3．1确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。
2．1．3．2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。
2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。
2．2 溶液的配制2．2．1 LB琼脂培养基的配制1000ml摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。
用扭力天平称取酵母粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，琼脂粉20克，倒入三角烧瓶中，加注射用水1000ml，用玻棒搅匀，分别用硫酸纸、牛皮纸包口，用线绳扎紧，标明名称、配制时间， 115.6℃30分高压灭菌。
细菌的分离培养
细菌的分离培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37°C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37C温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
不同类型的细菌的分离
不同类型的细菌的分离
不同类型的细菌的分离方法可能有所不同，以下是几种常见的分离方法：
1.平板划线分离培养法：适用于混有多种细菌的情况，通过划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。
2.液体培养基分离纯化法：对于一些无法在固体培养基上生长的微生物，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，需要使用液体培养基分离法。
常用的方法是稀释法，在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数表现为不生长，以获得纯培养。
3.单细胞（孢子）分离法：在自然界中，很多微生物都是混杂在群体中的少数种类。
此时可以通过显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。
这种方法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。
请注意，以上方法仅供参考，具体操作请根据实际情况和需求进行选择和调整。
微生物培养与分离方法
微生物培养与分离方法大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。
只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。
一、接种与分离方法根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。
1．平板划线分离培养法对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。
临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。
平板划线分离法通常有两种方法：（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。
先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的1/4）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。
每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。
一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。
（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。
方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。
琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。
用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。
生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。
3．穿刺接种法此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。
接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。
微生物中——平板接种的详解
微生物中——平板接种的详解
平板接种即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上的方法，然后培养。
平板接种的目的是为了观察菌落形态，分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验。
1、划线法，斜面接平板，无菌操作，自斜面用接种环直接取出少量菌体，或先制成菌悬液，接种在平板边缘的一处，烧去多余菌体，再从接种有菌的部位在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线，注意勿划破培养基。
经培养后在沿划线处长出菌落，以便观察或挑取单一菌落。
2、点种法，看了一般用于观察霉菌的菌落。
在无菌操作下,用接种针从斜面或孢子悬液中取少许孢子，轻轻点种于平板培养基上，一般以三点(..)的形式接种，霉菌的孢子易飞散，用孢子悬液点种效果好。
3、液体接平板，即用无菌移液管或者滴管吸取一定体积的菌液移至平板培
养基上，然后用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布在整个平板上。
4、或者将菌液加人培养皿中，然后再倾人融化并冷至45~50C的固体培养
基，轻轻摇勻，进行平置，凝固后倒置培养，分离菌种时常用。
5、平板接斜面，般是将在平板培养基上经分离培养得到的单菌落，在无菌操作下分别接种到斜面培养基上，以便作进一步扩大培养或保存之用。
接种前先选择好平板上的单菌落，并做好标记。
6、左手拿平板，右手拿接种环，在火焰旁操作，灼烧接种环后将按种环在容白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻，此时左手将平板放下，拿起斜面培养基，技斜面技种法按种。
平板划线法操作要点docx
平板划线法操作要点 .docx 平板划线法是一种常用的微生物分离纯化方法，用于将一个菌种的单个菌落进行分离、纯化和繁殖。
下面是平板划线法的操作要点：
1.准备所需材料：平皿、接种环、酒精灯、无菌棉签、镊子、培养基等。
2.将培养基倒入平皿中，用无菌棉签均匀涂布在培养基表面。
3.用镊子取出一块无菌滤纸，将其在酒精灯上灼烧后冷却，然后将其放置在培
养基表面。
4.用接种环取少量待分离的菌液，在滤纸上划线，注意不要将线划得过细或过
粗，以避免影响分离效果。
5.将平皿放置在适宜的温度下培养，观察菌落的生长情况。
如果需要，可以进
行第二次划线，以进一步纯化菌落。
6.当菌落长成后，用镊子将单个菌落取出，并将其接种到新的培养基上，以进
行下一步的实验或保存。
注意事项：
1.整个操作过程中，必须保证无菌操作，以避免污染。
2.在划线时，要注意力度和角度，以避免菌液过多或过少。
3.在培养过程中，要保持适宜的温度和湿度，以促进菌落的生长。
4.在取出单个菌落时，要用镊子轻轻夹住菌落，避免将其周围的培养基弄碎。
5.在进行下一步实验或保存之前，要对菌落进行最后的检查，以确保其纯度和
质量。
平板划线法是一种简单而有效的微生物分离纯化方法，但需要一定的操作技巧和经验。
通过不断实践和总结经验，可以逐步提高操作水平和实验效果。
平板划线法与稀释涂布平板法的区别
个人收集整理-ZQ
平板划线法与稀释涂布平板法地区别
一、平板划线分离法
由接种环以菌操作沾取少许待分离地材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式地连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数地增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜地话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落.
用途：一般多用于从菌种地纯化；
优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；
缺点：不能计数；
二、稀释涂布平板法：
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成地单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计地计数方法，即一个菌落代表一个单细胞.计数时，首先将待测样品制成均匀地系列稀释液，尽量使样品中地微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量地稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中地培养基内.经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中地含菌数.此法所计算地菌数是培养基上长出来地菌落数，故又称活菌计数.一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源地污染程度地检验.
用途：一般多用于筛选菌株.一般用于平板培养基地回收率计数.
优点：可以计数，可以观察菌落特征.
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延.如果菌液密度大地话，长不出单菌落.
1 / 1。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验六平板划线法分离菌种
一、实验目的
1、了解平板划线法分离菌种的基本原理
2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术
二、实验原理
平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。
一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。
通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。
实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。
平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。
具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。
由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。
鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。
这样的培养基称之为鉴别培养基。
例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。
（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数）
其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。
伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。
在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。
三、材料和器皿
1、菌种：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的混合培养斜面菌种。
2、培养基：伊红美蓝琼脂培养基。
3、器皿：无菌培养皿，水浴锅，接种环，培养箱等。
四、实验步骤
1、融化培养基
将装有伊红美蓝琼脂培养基的三角瓶放入热水浴中加热至沸，直至充分融化。
2、倒平板
待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝。
操作方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用右手手掌和小指将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一条稍大于瓶口的缝隙，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
3、作分区标志（操作熟练后此步骤可省略）
在皿底用记号划分成4个不同面积的区域，使A<B<C<D，且各区的夹角应为120°左右，以便使D区与A区所划出的线条相平行、美观。
（图1）
图1 平板分区、线条和划线操作示范示意图
4、划线操作
1)挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。
2)先划A区：将平板倒置于酒精灯火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰。
右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划3~4条连续的平行线当作初步稀释的菌源。
烧去接种环上的残余菌样。
3)划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区(菌源区)而移至B区，随即在B区轻巧地划上6~7条致密的平行线，接
着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线，并使D区的线条与A区平行(但不能与A区或B区的线条接触！)，最后，将左手所持皿底放回皿盖中。
烧去接种环上的残菌。
5、恒温培养
将划线后的平板至37℃倒置培养2~3天。
6、挑单菌落
良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落。
然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。
7、清洗培养皿
将废弃的带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、晾干。
五、注意事项
1、平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。
为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。
2、用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。
3、用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。
4、为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟试验熟练操作和掌握划线要领后，再正式进行平板划线。
六、思考题
1、用平板划线法进行纯种分离的原理是什么？有何优点？
2、要防止平板被划破应采取哪些措施？
3、为什么在划完A区后要将环上的残菌烧死？划后面几区时是否也要经过同样的处理？。