菌种的分离与培养
细菌的分离培养
细菌的分离培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37°C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37C温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
分离培养的操作方法
分离培养的操作方法分离培养是一种常用的微生物学实验技术，它可以将混合菌群中的不同菌种分离出来，单独培养，以便于对不同菌种进行研究和鉴定。
本文将介绍分离培养的操作方法。
一、准备工作1.准备培养基：根据需要分离的菌种选择适当的培养基，如营养琼脂、血琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂等。
2.准备培养器具：培养皿、移液器、灭菌器、无菌吸管、无菌匀板器等。
3.准备消毒液：如70%乙醇、84消毒液等。
4.准备样品：从需要分离的样品中取一定量的菌落或液体悬浮液。
二、分离操作1.表面分离法：将样品涂布在培养基表面，用无菌匀板器均匀涂布，然后在培养皿中培养。
此法适用于分离菌落较大的菌种。
2.液体分离法：将样品加入到含有适当营养物质的液体培养基中，摇晃培养，使菌落分散在培养基中，然后取适量的液体培养基接种到新的培养基中，重复操作数次，直到分离出单一菌种。
3.稀释分离法：将样品加入到含有适当营养物质的液体培养基中，进行逐级稀释，然后取适量的液体培养基接种到新的培养基中，重复操作数次，直到分离出单一菌种。
4.过滤分离法：将样品过滤，将过滤液接种到含有适当营养物质的液体培养基中，摇晃培养，然后取适量的液体培养基接种到新的培养基中，重复操作数次，直到分离出单一菌种。
三、培养条件1.温度：根据菌种的生长特性选择适当的温度，如常温、37℃等。
2.气氛：根据菌种的生长特性选择适当的气氛，如需氧气、需二氧化碳等。
3.时间：根据菌种的生长速度选择适当的培养时间，如24小时、48小时等。
四、鉴定分离菌株1.形态学鉴定：观察菌落形态、大小、颜色等特征。
2.生理生化鉴定：通过菌株的代谢特性、生长条件等进行鉴定。
3.分子生物学鉴定：通过PCR、DNA测序等技术进行鉴定。
分离培养是一种重要的微生物学实验技术，可以将混合菌群中的不同菌种分离出来，单独培养，以便于对不同菌种进行研究和鉴定。
在进行分离培养时，需要注意无菌操作，选择适当的培养基和培养条件，以及对分离出的菌株进行鉴定。
实验菌种的分离
一、菌种的来源 • 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂
或菌种保藏部门索取或购买； • 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
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二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
• 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特 性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温 度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工 艺等。
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（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作
过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主， 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵 母和霉菌较多，如一些野果生长区和果 园内。采样的对象也可以是植物，腐败 物品，某些水域等。
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Байду номын сангаас
从自然界筛选
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• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去
表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
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2．植物体采集方法
• 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、 安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一 小块，并注意不要损伤周围边缘。
• 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在 一片叶上的取样部位。
• 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法 相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时， 一般与根际土样一起保存。
微生物菌种的分离和纯化方法
微生物菌种的分离和纯化方法1.空气平板法空气平板法是一种常用的微生物菌种分离方法。
将待分离的微生物样品进行适当的稀释并均匀涂布在含有经过固化的琼脂平板上，然后放置在适宜的温度下进行培养。
微生物在平板上呈现为单个菌落，每个菌落都代表一个来自单一细胞的微生物。
通过挑取单个菌落，将其再次传代培养，最终可以得到纯净的菌种。
2.稀释平板法稀释平板法也是一种常用的微生物菌种分离方法，在空气平板法的基础上进行了改进。
先将待分离的微生物样品按一定比例稀释，然后将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上。
由于稀释后的样品中菌落之间的距离更远，因此每个菌落代表的是来自更少数的微生物细胞，得到纯净的菌种的几率更高。
3.前体菌种法前体菌种法是一种通过选择性培养基将目标微生物分离出来的方法。
选择性培养基可以通过添加特定的抗生素、酸碱度调节和特定营养物等来抑制其他微生物的生长而促进目标微生物的生长。
将待分离的微生物样品进行适当的稀释后接种在选择性培养基上，利用培养基的选择性促使目标微生物生长并抑制其他微生物的生长，最终得到纯净的菌种。
4.形态学分离法形态学分离法是一种根据微生物在形态和结构上的差异进行分离的方法。
先选择合适的培养基和培养条件，将待分离的微生物样品进行培养。
在培养过程中，观察并挑选出形态和结构上有明显差异的微生物，然后将其进行单菌维持培养，并通过形态特征进一步分离和纯化菌种。
5.生理生化特性分离法生理生化特性分离法是一种根据不同微生物菌株在代谢和物质转化方面的差异进行分离的方法。
根据微生物菌株的生理生化特性，如生长速度、氨基酸利用能力、产酸产气等，将微生物菌株进行初步分离，然后通过进一步的生化鉴定和特性测试，最终得到纯净的菌种。
总结起来，微生物菌种的分离和纯化方法有很多种类，选择合适的方法依赖于待分离的微生物特性和研究目的。
这些方法在微生物学的研究中起到了关键作用，为了获得纯净的微生物菌种提供了有效的手段。
菌类的分离和培养技术
菌类的分离和培养技术菌类（Fungi）是一类生物体，包括真菌（True Fungi）和微生物（Microfungi）两个大的类群。
菌类在生物圈中具有广泛的分布和重要的生态功能。
为了研究和利用菌类，科学家们开发了一系列分离和培养技术，以便从自然环境中获取纯种菌株以及大规模培养和应用特定的菌株。
本文将介绍菌类的分离和培养技术的基本原理和常用方法。
一、菌类的分离技术菌类的分离是指从混合菌群中获得纯种菌株的过程。
分离技术的关键是保持菌种的纯度和活力。
下面介绍几种常用的菌类分离技术。
1. 表层分离法表层分离法是最常用的菌类分离技术之一。
它适用于土壤、水域等含大量微生物的环境。
具体操作步骤为：取样→稀释→接种→均匀涂布→培养。
通过稀释操作可以使菌落分布在培养基表面，然后进行培养。
最后通过单菌落转接到新的培养基中得到纯种菌株。
2. 筛选法筛选法适用于需要寻找特定菌株的情况，例如寻找产生特殊代谢产物、拥有特定生态功能的菌株等。
筛选方法一般包括抗生素筛选、生理代谢筛选或染色筛选等。
在培养基中添加适当浓度的抗生素或其他化合物，只有目标菌株具有耐受能力，才能生长并形成菌落。
3. 寄主种菌法寄主种菌法是一种利用特定寄主与菌株共生的技术。
例如，某些菌株只通过与某种植物的根系共生才能生长。
通过将寄主植物的根系或其他寄主组织接种到含有该菌株的培养基上，就可以分离出特定的菌株。
二、菌类的培养技术菌类的培养是指将分离得到的纯种菌株在合适的环境条件下进行大规模的培养和繁殖。
下面介绍几种常用的菌类培养技术。
1. 液体培养法液体培养法是最常用的菌类培养方法之一。
通过将纯种菌株接种到含有营养物质的液体培养基中，利用摇床或震荡培养箱等设备进行培养。
液体培养法适用于大量培养、产生菌体、代谢产物等应用。
2. 固体培养法固体培养法是将菌株接种到固体培养基上，培养出菌落后进行培养的方法，常用的固体培养基有琼脂培养基等。
固体培养法主要用于分离和筛选菌株。
菌种分离与培养
菌种分离与培养（1）人们采取无菌操作的方法，把某种食用菌从混杂的微生物中，单独地分离开来，这个过程叫做菌种分离。
从分离过程中得到的菌丝体纯化后，就是纯菌种。
在实验室条件下，以人工使纯菌种大量生长和繁殖的方法，叫做培养。
一、母种培养(一)菌种分离菌种分离通常采用的方法有孢子分离法、组织分离法和寄主分离三种方法，三种方法各有特点，可根据不同的菌类和生产条件选择使用。
1.孢子分离法孢子分离法，是利用成熟子实体的有性孢子能自动从子实体层中弹射出来的特性，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，而获得纯种的一种方法。
(1)孢子的采集①种菇的选择用作分离菌种的种菇，应选择出菇早、朵型好、个体肥大、生长健壮、无病虫害、八成熟的菇体。
一进入出菇期，就要注意观察选择，并作好标记。
不同的食用菌选择的具体要求是：香菇菇型圆整，菇体肥大，柄细而短，菌盖呈深褐色，出菇早，无病虫害，一般为八成熟的子实体。
双孢蘑菇菇型圆整，光滑直立，颜色洁白，柄粗盖厚，无病虫害，生长快而健壮的单生菇。
草菇菇型端正，肥大健壮，包被未破，无病虫害的单生菇。
平菇出菇早，菌盖厚实，重叠丛生，菌柄粗短，色泽鲜亮，尚未散发孢子，八成熟而无病虫害的子实体。
木耳选朵大、耳片厚、色黑、生长健壮、褶皱多、无病虫害的春耳。
银耳朵大肉肥、色泽洁白、展片良好、朵型美观、八成熟、无病虫害的子实体。
猴头形状正常、颜色洁白、出菇早、生长健壮、菌刺丰满、无病虫害的子实体。
金针菇出菇早而均匀、生长健壮、朵型正常、菌柄长短适中、无病虫害的子实体。
②种菇的消毒子实体采回后要及时切除基部，并进行表面消毒。
对子实体层未外露的种菇(如蘑菇等)，可浸入0.1%升汞溶液中消毒约1分钟，用镊子捏出后经无菌水冲洗数次，再用无菌纱布将表面水吸干；对于子实层裸露的种菇(如香菇等)，只能用75%酒精揩擦菌盖及菌柄表面；而对于银耳、木耳类子实体，却千万不能接触消毒剂，只能置于烧杯中用无菌水洗涤，然后捏起再经无菌水冲洗数次，同样用无菌纱布吸干表面水。
细菌的分离、培养和鉴定
② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质 （如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E）
③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】
④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养
基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，
能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；
从而达到区分不同的微生物.。（TCBS）
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ❖ 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
水可直接涂布平板
• 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h，观察细菌生
长状况
（注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭
台面，保持操作台的整洁）
.
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二、细菌的培养
培养基：培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物 培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。
培养基的种类
① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物 质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂）
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生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
菌种分离4种常用方法介绍
菌种分离4种常用方法介绍1、纯种分离从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
纯种分离的目的是将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养如果样品没有经增殖培养而直接进行分离，那么要得到具有某一特性的纯种，就更该细致、谨慎的操作。
2、纯种分离的常用方法有4种：倾注平板分离法、涂布平板分离法、平板划线分离法和组织分离法。
（1）倾注平板分离法：培养后，在培养基内部及表面形成单菌落。
倾注平板法:将无自生理盐水稀释后的样品加入无茵培养基混合均匀。
待凝固后倒置培养，内部及表面形成单自落。
（2）涂布平板分离法：培养后，在培养基表面形成单菌落。
因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途：一般多用于菌种的纯化；优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；缺点：不能计数；控制每个平板中微生物的菌落数在一定的范围可获得理想的分离效果，对于细菌和酵母，以每平板10~200菌落为佳，对于丝状菌，则应控制每平板菌落数30~50或更少。
如果分离菌丝呈蔓延性生长的丝状菌如根霉、毛霉等，则可以在培养基中添加0.1%左右的去氧胆酸钠（去氧胆酸钠在低PH下灭菌过程中易形成絮状沉淀，可以通过分别灭菌、倾注平板前混合的方法避免）或山梨糖（在察氏培养基中加山梨糖0.1%，蔗糖0.01%），这样可防止菌丝蔓延，便于挑取。
3、平板划线分离法：能达到纯种分离的目的。
经培养后会得到呈分散状态的单菌落纯培养。
最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
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菌种的分离与培养在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。
所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。
菌种分母种、原种、栽培种。
(一）母种的分离培养食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。
1.孢子分离法孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。
这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。
（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。
蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。
单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。
（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。
具体操作方法，有以下几种：①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。
在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。
培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。
形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。
用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。
待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。
还可用孢子采集器收集孢子。
方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。
随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。
并在纱布上倒少许升汞或无菌水。
移入20℃左右恒温箱培养。
②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。
③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培养基或四周瓶壁。
置适宜温度下培养、转接即可。
④贴附法：按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块，用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。
经6～12小时的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。
孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮，当母种定植一星期左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管，进而转管扩大，一般到栽培种，转管不宜超过5次。
孢子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。
一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分离法获得母种。
现就银耳孢子分离略述于下：按无菌操作获取种耳后，悬挂种耳的三角瓶经12小时培养后，瓶底培养基表面就有'孢子印'。
取出种耳，置20℃—25℃温箱培养2～3天，培养基表面会出现乳白色透明的糊状小菌落，就是银耳的酵母状分生孢子形成的少量银耳菌丝。
此时移接入试管斜面培养基上，待长满斜面后，再移接入营养丰富，且表面比较干燥的培养基上。
经30天左右，菌落长出白色菌丝。
银耳的酵母状分生孢子、菌丝只有与羽毛状菌丝的子囊菌（香灰菌丝）混合培养时，由后者帮助分解木材及其他一些纤维物质，提供营养，才能利于银耳孢子萌发，菌丝的定植和子实体的形成。
在两种菌丝交会时，先选出两种纯菌丝。
羽毛状菌丝要纯化选育，一般要选取生长迅速，爬壁力强的试管斜面或种瓶，取先端菌丝，转管移接，置25℃—28℃上培养，重复转管几次即可得到优良纯种。
银耳菌丝的特点，菌丝生长缓慢，担孢子也不易萌发。
在进行两菌混合时，先取经8～IO天培养的银耳菌丝斜面，按无菌操作方法在该斜面上距银耳菌丝约0.5厘米处接入一小块羽毛状菌丝。
置25℃下培养1周即得到混合好的银耳母种。
2．组织分离培养法利用子实体内部组织，进行无性繁殖而获得母种的简便方法，即组织分离。
该法操作简便，菌丝生长发育快，品种特性易保存下来，特别是杂交育种后，优良菌株用组织分离法能使遗传特性稳定下来。
常采用以下分离方法。
（l）子实体分离：种菇要选朵大盖厚，柄短，八九分成熟的优良品种。
切去菇两基部，在无菌箱内以0.1％的升汞水浸几分钟，再用无菌水冲洗并揩干或用75％酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次，进行表面消毒。
接种时，只要将种菇撕开，在萌盖和菌柄交界处或菌褶处，挑取一小块组织；移接到PDA培养基上。
置25℃左右温度下培养3-5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。
如香菇、平菇等可以用此方法。
（2）菌核分离：茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集。
而常见的是它贮藏营养的菌核。
用菌核分离，同样可以获得菌种。
方法是将菌核表面洗净，用酒精或升汞消毒后，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA 培养基斜面上，保温培养。
应注意的是，菌核是贮藏器官，大部分是多糖类物质，只含有少量的菌丝，因此挑取的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分出菌种。
（3）菌素分离：有一部分子实体不易找到，也没有菌核，可以用菌素进行分离。
如蜜环菌、假蜜环菌。
其操作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭2～3次，然后去掉黑色外皮层（菌鞘），抽出白色菌髓部分；用无菌剪刀将菌髓剪一小段，接种在培养基上，保温培养，即得该菌菌种。
菌素分离要注意：因菌素比较细小，分离素也比较细小，分离时极易污染杂菌，所以要严格操作。
3．基内菌丝分离培养法利用食用菌生育的基质作为分离材料，来得到纯菌种的一种方法，叫基内菌丝分离法。
此种分离方法是适宜只有在特定的季节才出现，而且是朝生暮死，不易采得的子实体。
基内分离法与组织分离法不同之点是，干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。
接种后有时并不立刻恢复生长。
因此，有必要保留较长的时间（约1个月），以断定菌丝是否能成活。
基内菌丝分离法又可分为，材中菌丝分离（即菇木或耳木分离法）及土中菌丝分离法等。
（1）材中菌丝分离法：就是菇木或耳木分离法，为了减少杂菌的感染，菇（耳）木在分离之前，必须进行无菌处理。
可以把菇（耳）水表面用酒精灯火焰轻轻烧过，以烧死霉菌的孢子，或再用0.1％的升汞水浸孢几分钟，然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干。
接种块切取时应注意。
接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取。
所以，菌丝生长缓慢的种类应浅取；菌种生长快的种类可以深取。
同时。
还应根据菇菌的种类、木材质地、菇（耳）木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围。
然后用一把利刀进行切取。
接种块应尽量小些，以减少杂菌感染机会，提离菌种的纯度。
接种块移到培养基上，就应该放到适合菌丝生长的22℃～26℃ 的温室或温箱中培养，使菌丝恢复生长。
（2）土中菌丝分离：食用菌种类很多，许多土生的食用菌；孢子不易萌发。
组织分离也不易成功，用土中菌丝分离获得纯种的方法，叫土中菌丝分离。
土中菌丝分离时要注意，由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物，因此分离时必须尽可能避开这些微生物的干扰，尽可能批取清洁菌丝素的尖端、不带杂物的菌丝接种，反复用无菌水冲洗，在培养基中加入一些抑制细菌生长的药物，如40微克／升的链霉素或金霉素。
如发现感染细菌，可以把菌落边缘的菌丝挑出来，接种到木屑培养基中。
因细菌没有分解木质素的能力，因此在木屑培养基中不易扩展；只局限于接种处。
待菌丝长出感染区后，就可以再进行扩大提纯了。
（3）子实体基部分离：从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基部分离出新菌丝的方法，叫子实体基部分离，现以袋栽银耳为例说明：从出耳早、出耳率离、无病虫害的栽培室中；选择生活力最强的幼耳5袋，移到气候温和，有散射光的野外场所进行后期培养，以增强菌丝体的生活力。
经培养7～10天后，待子实体直径达4～5厘米时便可取回，作为分离的母体。
再从中筛选最理想的一朵，用利刀割掉银耳子实体，放置于0℃的冰箱或有敌敌畏的容器中过夜，以便杀死瓶中的害虫。
然后用75％酒精或升汞擦洗耳基和袋子外边的杂质，连同接种工具、接种培养基等移进无菌室。
经灭菌后，用接种刀把袋口上部约15毫米厚的老菌根挖除，并进行培养。
待袋口露出白色菌丝时，用接种针挑取一块半粒米大的白色菌结体，迅速移入母种试管培养基的中央，轻轻地脱去接种针，塞上棉塞。
为了能够获得较多的母种，一次接种量要有100—200支试管，以便从中选择。
分离后应及时移入22℃—24℃恒温箱或温室中培养。
由于培养基内水分较多，菌丝恢复要比耳木分离得快。
经2-3天后，分离物的边缘就可看到白色菌丝。
每天要至少观察两次，以便提纯。
观察、提纯方法与耳木分离法担同。
经适温培养10-15天后，当接种块扭结团出现红、黄色水珠时，即可扩大原种。
（二）原种和栽培种的接种培养母种获得以后，为了满足菌种生产的需要。
应选出优良、纯度高的母种进一步扩大为原种。
原种培养基一般采用棉籽壳、木屑、草类等培养基。
瓶装或袋装的原种培养基灭菌后，可送入灭过菌的接种箱内，待瓶中的培养基冷至30℃以下，可按照无菌操作程序进行接种。
菌种瓶（袋）放入培养室时，要经常进行检查，一经发现杂菌污染，立即取出。
培养成的原种，菌丝体必须健壮有力，紧贴瓶壁而不干缩，颜色纯正，具有一定清香味，生活力强，扩制成栽培种时吃料快。
栽培种就是将原种进一步扩大培养成三级种，它和原种的接种及培养相同。
一般香菇、平菇、冬菇、猴头、木耳、银耳的栽培种多用锯木、棉皮作培养基。
蘑菇多用粪草做培养料。
栽培种要求料块不脱水干缩。
菌丝体健壮有力、颜色纯正，有清香味，无老化现象，无杂菌污染，有的种许可有少量原基，接入栽培料后，发菌快，长势好，生活力强。
原种在接栽培种时，原种瓶口的一层菌丝体应挖去不用。
（三）液体种的简单培养目前，用液体深层发酵法生产菌种，具有生产量大、周期短、菌龄整齐、成本低廉、接种方便等特点，是实现食用菌工厂化生产的目标。
现将液体种培育过程简述于后，供参考。
简言之就是将纯正优良的菌种，接入液体培养基（固体培养基不加凝固剂），使菌丝繁殖形成大量小菌球，然后将这种培养基拌入木屑或棉籽皮料内，制成菌块、培养其形成子实体。
还可用于制原种、栽培种。
培养液体菌种，可将培养液装入三角瓶中，约占空瓶的五分之一重量。
用摇瓶机（也称摇床）来培养。
摇瓶机有旋转式和往复式两种，一般多用往复式。
液体培养基可用马铃薯汁（加糖），麦芽汁配制，也可用玉米粉、豆饼粉、糖、无机盐等配制。
可以混合培养基，因适用于多种食用菌和药用菌的培养，均有好效果。