长牡蛎_Crassostreagigas_微卫星克隆快速分离及特性分析
长牡蛎(Crassostrea gigas)野生与选育群体的微卫星遗传多样性分析
长牡蛎(Crassostrea gigas)野生与选育群体的微卫星遗传多样性分析李妍;姚健涛;张恩烁;孙泽轩;孙国华;李彬;杨建敏;冯艳微;王卫军【期刊名称】《海洋与湖沼》【年(卷),期】2024(55)2【摘要】为了评估长牡蛎(Crassostrea gigas)2个壳长性状(掌心形)快速生长选育群体(LY2-K4、LY2-K7)、1个壳高性状(速生型)快速生长选育群体(LY2-K11)和6个野生群体(QHD、LS、HD、ZH、WD、KTD)的遗传多样性和遗传结构,用21对多态性丰富的微卫星引物对9个长牡蛎群体的269个个体进行了遗传分析。
结果显示:21个微卫星位点共检测出了460个等位基因(Na),平均等位基因数为21.905;21个微卫星位点的多态信息含量(PIC)均大于0.5,具有高度遗传多态性;选育群体LY2-K11的遗传多样性最低(Na=13,I=2.128,He=0.831,PIC=0.825),野生群体KTD的遗传多样性最高(Na=29,I=3.112,He=0.941,PIC=0.938);189个群体位点组合有66%偏离哈代-温伯格平衡,表明这些群体存在一定程度的杂合子缺失;9个群体间的遗传分化指数(F_(st))为0.012~0.064,处于较低的遗传分化水平;AMOVA分析显示遗传变异主要来自于个体内;PCoA分析结果与UPGMA聚类树一致,LY2-K11群体单独聚为一类,QHD和HD群体聚为一类,其他6个群体聚为一类。
综上所述,长牡蛎3个选育群体和6个野生群体遗传多样性均较高,遗传分化水平较低;选育群体LY2-K11多样性略有下降,选育过程中应保证亲本的数量及质量,防止因近交衰退造成遗传多样性降低,苗种抗逆性变差。
该结果将为长牡蛎新品种的选育和野生种质资源的保护提供科学指导。
【总页数】9页(P462-470)【作者】李妍;姚健涛;张恩烁;孙泽轩;孙国华;李彬;杨建敏;冯艳微;王卫军【作者单位】鲁东大学农学院;牡蛎种质创制与高效养殖山东省工程研究中心;烟台市崆峒岛实业有限公司;烟台市海育海洋科技有限公司【正文语种】中文【中图分类】Q789;S968.3;S931【相关文献】1.长牡蛎(Crassostrea gigas)三个选育群体完全双列杂交后代生长性状分析2.香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)与长牡蛎(Crassostrea gigas)种间杂种遗传力评估3.长牡蛎(Crassostrea gigas)微卫星克隆快速分离及特性分析4.长牡蛎（Crassostrea gigas）壳宽快速生长选育群体遗传多样性及遗传结构的微卫星标记分析5.利用微卫星荧光多重PCR技术分析壳白长牡蛎3代人工选育群体的遗传多样性因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于RNA-seq数据分析长牡蛎(Crassostrea gigas)天然免疫的可变剪接事件
基于RNA-seq数据分析长牡蛎(Crassostrea gigas)天然免疫的可变剪接事件李若晖;张琳琳【期刊名称】《海洋与湖沼》【年(卷),期】2024(55)1【摘要】大部分无脊椎动物缺乏基于经典抗体和记忆细胞的适应性免疫,因而天然免疫在无脊椎动物免疫防御中发挥不可或缺的作用。
可变剪接正是产生天然免疫多样性和特异性的重要途径。
牡蛎(Crassostrea)是全球范围内的大宗养殖贝类和我国产量最高的海水养殖贝类,理解其天然免疫系统的多样性和特异性对牡蛎病害防治和养殖业健康可持续发展至关重要。
通过对不同病原诱导以及诱导后不同时间的转录组进行生物信息分析,系统地研究了长牡蛎天然免疫应激反应的可变剪接事件。
发现在弧菌诱导下可变剪接事件的总数显著增加,表明弧菌的感染会诱导长牡蛎可变剪接事件的产生。
对病原诱导后可变剪接体的组成类型及表达量显著变化的基因的功能富集分析,表明免疫系统相关功能被显著富集,病原感染不同阶段以及不同病原感染后可变剪接体的组成类型和表达量均不一致,表明长牡蛎免疫系统可通过可变剪接产生免疫响应的特异性和多样性。
研究结果为长牡蛎等无脊椎动物天然免疫多样性和特异性提供了典型实例,也为长牡蛎病害防御提供了理论支撑。
【总页数】11页(P182-192)【作者】李若晖;张琳琳【作者单位】中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室;青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室;中国科学院大学【正文语种】中文【中图分类】Q789;S944.3;S968.3【相关文献】1.香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)与长牡蛎(Crassostrea gigas)种间杂种遗传力评估2.长牡蛎(Crassostrea gigas)与熊本牡蛎(C.sikamea)杂交的受精细胞学观察及子一代的生长比较3.基于UF、GFC及RP-HPLC的长牡蛎(Crassostrea gigas)蛋白抗衰老小分子活性肽(Zel'ner)的纯化及结构解析4.基于RNA-seq数据分析玉米抗虫响应基因的可变剪接事件5.长牡蛎(Crassostrea gigas)黑色壳表面微生物多样性的研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于微卫星标记整合长牡蛎遗传图谱
基于微卫星标记整合长牡蛎遗传图谱郭香;李琪;孔令锋;于红【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2013(037)006【摘要】为了提高长牡蛎遗传图谱上的微卫星标记密度,实验采用6个家系图谱间的共有微卫星标记作为锚定标记,构建了长牡蛎的整合图谱.该整合图谱共有161个微卫星标记,覆盖10个连锁群,图谱长度和平均间距分别为615.4和3.8 cM.各连锁群的标记数介于10 ～ 24个之间,连锁群长度为47.3～73.3 cM,是目前密度最高的长牡蛎微卫星图谱.不同作图家系连锁群上的标记分组保持一致,但标记顺序出现差异,可能与长牡蛎自然群体中存在大量的染色体重排现象有关.结果表明,该图谱可以为今后长牡蛎的遗传育种研究提供新的遗传工具.%In order to improve the density of microsatellite markers,a consensus map of C.gigas was constructed based on common microsatellite markers among six mapping populations.The consensus map contained 161 microsatellite markers,spanning 10 linkage groups.The map length and average genetic distance is 615.4 cM and 3.8 cM respectively.The number of loci on linkage group ranged from 10 to 24 and the genetic length of linkage group varied from 47.3 to 73.3 cM.At present,this consensus map is the densest SSR-based map of C.gigas.Among different mapping populations,the grouping of markers is consistent;however,the order of markers is a little different,which is likely attributed to polymorphism for chromosomal rearrangements in the natural population of Pacific oysters.The resultsshow that the consensus map will provide a new reference tool for genetics and breeding of C.gigas in the future.【总页数】7页(P823-829)【作者】郭香;李琪;孔令锋;于红【作者单位】中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛 266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛 266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛 266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛 266003【正文语种】中文【中图分类】Q785;S917.4【相关文献】1.牙鲆微卫星标记遗传连锁图谱的构建 [J], 宋文涛;梁卓;田永胜;陈松林;张潇峮;廖小林;邵长伟;王磊;庞仁谊;牛余泽;赵永伟;李文龙2.利用BAC、BIBAC文库整合构建陆地棉遗传标准系TM 1全基因组的遗传、物理图谱：BAC及BIBAC文库构建，SSR标记开发和物理/遗传图谱整合 [J], John Z. YU;Russell J. KOHEL;Hong-bin ZHANG;Jian-min DONG;Shu-kuSUN;Nicole L. STEELE3.绒山羊X染色体7个微卫星标记的遗传连锁图谱的构建 [J], 徐磊;王敏;呼都特;孟克格日乐;姚继广;杨子森;赖双英;张文广;李金泉;吴萍;王志新;乔峰4.长牡蛎（Crassostrea gigas）壳宽快速生长选育群体遗传多样性及遗传结构的微卫星标记分析 [J], 张荣良;王卫军;冯艳微;杨建敏;唐海田;纪仁平5.半滑舌鳎微卫星标记遗传连锁图谱的构建 [J], 赵永伟;宋文涛;廖小林;牛余泽;庞仁谊;高峰涛;沙珍霞;陈松林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
长牡蛎出肉率与壳形性状的QTL定位分析
长牡蛎出肉率与壳形性状的QTL定位分析仲晓晓;李琪;孔令锋;于红;郭香【摘要】本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)F1全同胞家系为作图群体,在已构建的基于120个微卫星和66个SNP标记的长牡蛎性别平均连锁图谱上,利用PROC QTL 2.0软件对出肉率和壳形(壳宽和壳深)性状进行QTL定位分析.结果表明,共检测到13个相关的QTL,分布在3个连锁群上;其中,与出肉率相关的4个QTL定位在1号和3号连锁群上(LG1和LG3),表型解释率为0.25％～47.53％;与壳宽相关的3个QTL定位在10号连锁群上(LG10),表型解释率为0.71％～45.39％;与壳深相关的6个QTL也定位在LG10,表型解释率为3.37％～24.78％.根据QTL连锁群分析和性状相关性分析结果可以推测,出肉率与糖原含量性状以及壳宽与壳深性状分别具有相近的遗传特征,利用与相关性状共同关联的分子标记可以同时对出肉率与糖原含量性状、壳宽与壳深性状进行遗传改良.本研究结果为今后长牡蛎相关性状候选基因克隆和分子标记辅助育种提供了参考.【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2015(022)003【总页数】6页(P574-579)【关键词】长牡蛎;QTL;出肉率;壳宽;壳深【作者】仲晓晓;李琪;孔令锋;于红;郭香【作者单位】中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛266003【正文语种】中文【中图分类】S917长牡蛎（Crassostrea gigas），又称太平洋牡蛎，原产于中国、日本及韩国地区，具有环境适应强、生长快、营养丰富等优点，是世界上养殖范围最广、产量最高的经济贝类。
人工诱导长牡蛎Crassostrea gigas(Thunberg)三倍体发生的初探
人工诱导长牡蛎Crassostrea gigas(Thunberg)三倍体发生
的初探
林位琅
【期刊名称】《渔业信息与战略》
【年(卷),期】2001(016)005
【摘要】用细胞松弛素B(C.B),抑制长牡蛎第二极体释放,药物诱导产生三倍体,对药物处理的浓度、时间、操作方法进行初步探讨.
【总页数】2页(P18-19)
【作者】林位琅
【作者单位】福建省连江县海洋与水产局,中国福建省连江县凤城镇丹凤路南
侧,350500
【正文语种】中文
【中图分类】S968.31
【相关文献】
1.雄性四倍体与雌性二倍体杂交培育全三倍体长牡蛎(Crassostrea gigas)的研究[J], 阙华勇;张国范;刘晓;郭希明;张福绥
2.人工诱导长牡蛎三倍体发生技术 [J], 林位琅
3.长牡蛎Crassostrea gigas（Thunberg）人工育苗技术要点 [J], 李松泉
4.三倍体长牡蛎(Crassostrea gigas)不育性研究 [J], 林琪;吴建绍;于子长
5.大官坂垦区水体长牡蛎Crassostrea gigas(Thunberg)半人工采苗试验报告 [J], 陈梅英
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长牡蛎‘海大1号’生长性状的遗传参数评估
中国水产科学 2018年9月, 25(5): 998-1003 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2017-12-09; 修订日期: 2018-03-01.基金项目: 国家自然科学基金项目(31772843); 青岛市产业培育计划项目(17-3-3-64-nsh); 山东省科技发展计划项目(2016ZDJ-S06A06).作者简介: 张景晓(1990−), 男, 博士研究生, 从事贝类遗传育种研究. E-mail: jingxiao2000@ 通信作者: 李琪, 教授. E-mail: qili66@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17438长牡蛎‘海大1号’生长性状的遗传参数评估张景晓, 李琪, 徐成勋中国海洋大学 海水养殖教育部重点实验室, 山东 青岛 266003摘要: 分别以长牡蛎(Crassostrea gigas )‘海大1号’第8代和第9代选育群体中的个体为亲本, 采用巢式设计的交配方法, 于2016年和2017年分别获得41个和38个全同胞家系。
根据各家系长牡蛎330日龄的壳高、壳长、壳宽和体重等表型参数, 通过建立多性状动物模型, 利用ASReml 软件中的限制性极大似然法估算各表型变量的方差组分, 对‘海大1号’连续两代选育群体生长性状的遗传参数进行评估。
结果表明, 两个选育世代的‘海大1号’生长性状均具有较高的变异水平, 变异系数为20.74%~55.14%, 各生长性状仍具有遗传改良潜力。
‘海大1号’各生长性状间的表型相关均为正相关, 相关系数大小存在差异。
3个壳型性状与体重的遗传相关均为正相关, 且处于较高水平(0.40~0.66)。
除壳宽性状的遗传力较低外, 壳高、壳长与体重的遗传力在0.16~0.37, 均属中高等遗传力水平, 表明‘海大1号’经过多代选育后, 生长性状仍具有较大的加性遗传效应, 可根据个体表型值大小, 继续通过群体选育获得遗传进展。
基于微卫星标记整合长牡蛎遗传图谱_郭香
水
产
学
报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol． 37 ，No． 6 June， 2013
文章编号： 1000 － 0615 （ 2013 ） 06 － 0823 － 07
DOI： 10． 3724 / SP． J． 1231． 2013． 38423
http： ∥www． scxuebao． cn
824
水
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报
37 卷
［13 ］ 产动 物， 如罗非鱼 ， 草 鱼 （ Ctenopharyngodon ［14 ］ ［15 ］ ， idella） 斑节对虾 （ Penaeus monodon ） 等也
长牡蛎图谱构建研究， 另外 5 个作图家系的微卫 ［7 ］ ［16 ］ 星标记数据分别取自 Hubert 等 和 Plough 等 的 研 究 结 果，并 由 美 国 南 加 州 大 学 Dennis Hedgecock 教授提供微卫星分离原始数据。6 个 作图家系用于该整合图谱的构建 ： （ 1 ） 3 个作图家
［7 ］ 系来自 Hubert 等 的 F2 群体， 分析的个体数量 94 和 188 个体； （ 2 ） 1 个作图家系为 分别为 188 ，
构建了整合图谱。 为了获得密度更高， 覆盖率更大， 通用性更好 的长牡蛎图谱， 实验通过整合目前已有的 6 个作 图家系的微卫星基因型数据， 构建了长牡蛎基于 微卫星标记的整合图谱。
表 2 构建太平洋牡蛎整合图谱的六个家系连锁图谱信息 Statistics of six component maps used to construct the consensus map of C． gigas
5种壳色长牡蛎不同组织常规营养成分分析与评价
中国水产科学 2018年3月, 25(2): 354-360 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2017-05-31; 修订日期: 2017-08-05.基金项目: 泰山学者种业计划专家项目; 山东省重点研发计划项目(2016ZDJS06A06); 山东省良种工程. 作者简介: 朱怡静(1991–), 女, 硕士研究生, 主要从事贝类遗传育种研究. E-mail: m178********@ 通信作者: 李琪, 教授. E-mail: qili66@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.171985种壳色长牡蛎不同组织常规营养成分分析与评价朱怡静, 李琪, 张景晓, 于红, 孔令峰中国海洋大学 海水养殖教育部重点实验室, 山东 青岛 266003摘要: 对壳黑、壳紫、壳橙、壳金和壳白5种壳色长牡蛎(Crassostrea gigas )不同组织包括闭壳肌、外套膜、鳃、性腺-内脏团的营养成分(水分、总蛋白质、总脂肪、糖原、灰分)进行检测分析, 比较它们与普通养殖群体营养成分的差异以及5种壳色长牡蛎各组织间营养成分的差异。
结果表明, 在闭壳肌中, 壳紫长牡蛎的总脂肪含量显著高于壳橙长牡蛎(P <0.05), 其他组分在6个群体中未表现出显著性差异(P >0.05); 在外套膜中, 壳金长牡蛎总脂肪含量显著高于壳黑、壳橙和普通养殖群体(P <0.05), 壳白长牡蛎的灰分含量显著高于普通养殖群体(P <0.05), 其他组分在各群体之间未表现出显著性差异(P >0.05); 在鳃中, 长牡蛎壳橙、壳紫、壳白选育群体的糖原含量显著低于对照组(P <0.05), 其他组分在6个群体之间没有显著性差异(P >0.05)。
长牡蛎5种壳色选育群体和普通养殖群体的性腺-内脏团在水分、总蛋白质、总脂肪、糖原和灰分中均无显著性差异(P >0.05)。
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*国家自然科学基金资助项目,30170735号;教育部留学回国人员科研启动基金资助。
李琪,教授,博士生导师,E -mail:qili66@mail ouc edu cn长牡蛎(Crassostrea gigas )微卫星克隆快速分离及特性分析*李 琪 木岛明博(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室 青岛 266003)(日本东北大学农学部 仙台 981-8555)提要 采用磁珠杂交选择和PC R 筛选法,从长牡蛎DNA 选择片段文库中,快速分离含有微卫星序列的阳性克隆。
结果表明,在筛选的200个白色菌落中,56个克隆含有重复次数5以上的微卫星序列,其中41个(20 5%)有随机侧翼区,可以进行引物设计,12个缺乏足够的侧翼序列,3个为中断的微卫星序列。
此外,还获得两个小卫星克隆。
在获得的微卫星序列中,完全的占54 7%,不完全的占20 8%,复合的占24 5%。
除探针中使用的CA 重复单元外,还观察到C T 、AC T 、C GC A 、C AC T 、GAC T 、GC AC 、CC TTA 和CC TC A 的重复序列。
微卫星重复次数主要集中在5 30次之间,占71 7%,最高为60次。
本研究中构建的长牡蛎(CA)n 富集微卫星文库将为以后开发未知微卫星标记提供帮助。
关键词 长牡蛎,微卫星,快速分离,特性分析中图分类号 Q75微卫星标记,亦称为STR(short tande m repeat,短串联重复)标记,是原核生物和真核生物基因组中普遍存在的2 6个核苷酸的简单串联重复序列(Zane et al ,2002)。
由于微卫星均匀分布于基因组中,并具有多态性丰富、遵循孟德尔分离定律、共显性遗传、易于PCR 扩增等特点,目前已广泛应用于各种生物资源的家系分析、基因连锁分析、遗传图谱构建、遗传多样性分析等许多研究领域(Knapik et al ,1998;Hall et al ,1992;Holland,2001;Li et al ,2003,2004)。
长牡蛎(Crassostrea gigas ),亦称太平洋牡蛎,是世界上养殖范围最广、产量最高的海洋贝类。
为了进行分子标记辅助育种和种群多样性研究,近年来国外学者采用传统的直接杂交筛选方法对长牡蛎微卫星进行了分离(Ma goulas et al ,1998;Huvet et al ,2000;McGoldrick et al,2000)。
这种方法主要是将内切酶处理后的DNA 片段重组入质粒载体中,建立小片段基因组文库,再用含不同重复序列的寡核苷酸探针进行筛选克隆。
该方法存在效率低、成本高的缺点,对于那些基因组中含量不是很丰富的微卫星序列,用这种方法进行分离很困难。
由于构建精密微卫星连锁图谱,开展基因连锁分析需要大数量的微卫星标记,因此迫切需要开发容易获得大量阳性克隆的微卫星高效分离方法。
近年来,国外报道了引物伸长法(Os -trander et al,1992;Takahashi et al ,1996)和杂交选择法(Kijas et al,1994;Refseth et al ,1997)两种微卫星富集技术。
为确立长牡蛎微卫星快速分离方法,作者采用磁珠杂交选择法分离长牡蛎C A 重复微卫星序列,并对微卫星序列的特性进行了分析。
1 材料与方法1 1 长牡蛎DNA 的提取DNA 从采自日本宫城县女川湾的1只长牡蛎第35卷 第4期海 洋 与 湖 沼Vol.35,No.42004年7月OCE ANOLOGIA E T LIMNOLOGIA SINIC AJuly,2004成贝提取。
剪取100mg肌肉组织,研磨后置于0 7ml的抽提缓冲液(6mol/L urea,10mmol/L Tris-HCl,125mmol/L NaCl,1%SDS,10mmol/L EDTA, pH=7 5)中,加入35 l的蛋白酶K(20mg/ml), 37 消化一夜。
用苯酚 氯仿(1 1)抽提反应物,异丙醇进行沉淀,然后溶解于TE(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH=8 0)中。
用RNase (20 g/ml)37 处理DNA样品1h,然后用苯酚/氯仿提取液进行DNA纯化。
1 2 DNA消化、片段分离和衔接头连接用Hae 和Dra (各150U)消化DNA50 g。
酶切产物在2 5%NuSieve GTG琼脂糖凝胶(美国FMC Bioproducts公司)中电泳,切下含300 1000bp DNA片段的凝胶,用DNA回收试剂盒(QI-Aquick Gel E xtraction Kit,德国Qiagen公司)回收。
用DNA连接试剂盒(日本宝生物公司)将DNA片段(1 g)与EcoR -Not -Bam H 衔接头(日本宝生物公司)连接,然后用乙醇沉淀法收集DNA片段,并重新溶于20 l纯水中。
1 3 目标序列分离和衔接头PCR将0 6ml MagneSphere 链霉亲和素顺磁颗粒(Streptavidin Paramagnetic particles,美国普洛麦格公司)重悬浮于300 l的5 SSC(1 SSC= 150mmol/L NaCl,158mmol/L柠檬酸钠)中,并加入300pmol生物素标记的寡核苷酸探针: 5 -(CA)12GC TTGA-biotin。
磁珠和探针在室温下放置5min后,用5 SSC冲洗3次,并移入56 100 l 的杂交溶液(0 5mol/L NaCl,4%聚乙二醇8000)。
DNA片段(20 l)与80 l的杂交溶液混合,于95 加热5min使其变性后,迅速添加至磁珠悬液,并于56 温育20min,然后在室温用200 l2 SSC 冲洗磁珠4次,30 200 l1 SSC冲洗4次。
室温下加入50 l0 15mol/L Na OH,放置20min,从磁珠上洗脱固定的DNA片段。
除去磁珠,加入5 5 l10 TE、3 25 l1 25mol/L乙酸中和上清液。
用PC R产物纯化试剂盒(QIAquick PC R purif-i cation kit,德国Qiagen公司)纯化DNA,并溶于50 l TE缓冲液中。
PC R体系50 l,含5 l DNA,1 25U Ampli T aq Gold,5 l GeneAmp10 PCR缓冲液(美国PE公司),0 2mmol/L dNTP,1 5mmol/L MgCl2,GATCC-3 )。
95 变性11min,然后94 1min, 63 1min,72 1min,共进行35个循环,最后72 延伸5min。
PC R产物用PCR纯化试剂盒进行纯化。
1 4 PCR扩增片段的克隆已纯化的PC R产物经Not 消化后,插入到pBluescript SK(+)载体(美国Stratagene公司),然后重组入XL1-Blue MRF 超感受态细胞(美国Stratagene公司)。
将已转化的感受态细胞涂布于添加IP TG(100 l10mmol/L溶液)和X-Gal(100 l 2%溶液)的氨苄青霉素(100(g/ml)LB平板上, 37 培养过夜。
1 5 含有微卫星序列阳性克隆的PC R筛选用无菌牙签挑取白色菌落,转入10 l的10mmol/L Tris-HCl(pH=8 5)中,95 加热10min,然后于4 低温保存用作PCR反应中的模板。
使用1 l摸板,两个载体引物(T3和T7)和一个无生物素标记的(CA)12引物进行PC R扩增。
PC R体系10 l,含0 25U AmpliTaq Gold、1 PCR buffer、0 2mmol/L dNTP、1 5m mol/L MgCl2,引物各0 2 mol/L。
95 变性11min后进行35个扩增循环,每一循环包括94 1min、57 1min、72 1min,最后在72 延伸5min。
PCR产物用1 5%琼脂糖凝胶进行电泳,产生两条或两条以上扩增带的插入片段可以推测为含有微卫星序列的阳性克隆。
阳性克隆DNA用Qiaprep spin c olumns(德国Qiagen公司)纯化,然后用ThermoSequenase cycle sequencing kit(英国安马西亚公司)在岛津DSQ-2000L DNA测序仪(日本岛津公司)上进行双向测序。
2 结果2 1 微卫星序列富集原理图1表示用磁珠杂交选择法分离长牡蛎微卫星序列的基本原理。
基因组DNA经内切酶消化、片段分取后,连入衔接头。
将含有微卫星重复序列的生物素标记寡核苷酸探针同链霉亲和素磁珠结合,然后再与热变性后的DNA片段混合,使探针与微卫星序列杂交。
采用两级严格度洗脱非互补序列和多余探针,然后加入Na OH释放固定在磁珠上的目标片段。
醋酸中和目标片段溶4期李 琪等:长牡蛎(Crassostrea gigas)微卫星克隆快速分离及特性分析365图1 磁珠杂交选择法富集微卫星序列的基本原理Fi g 1 The basic pri nciple of microsatellite seq uence enrichment using magnetic bead h ybridization selecti on链,并将PCR 产物插入载体。
PC R 法筛选出现两条或两条以上扩增带的阳性克隆,然后提取阳性克隆DNA 确定序列。
2 2 长牡蛎微卫星克隆的分离及特性利用PC R 法筛选了(C A)n 富集文库中200个白色菌落,其中67个克隆(33 5%)产生了两条或两条以上扩增带,表明可能含有CA 重复序列;对这67个克隆进行测序,结果表明41个克隆(占筛选白色菌落数的20 5%)含有重复次数大于5的重复序列,且在重复序列两端有随机序列,可以进行引物开发(表1);12个克隆虽具有重复次数大于5的重复序列,但在重复序列的侧翼区缺乏足够的随机序列,无法进行引物设计;3个克隆的微卫星序列出现中断;2个克隆分别含有重复单元为26和17个核苷酸的串联重复序列,即小卫星序列(表1);9个克隆的重复次数都在6以下,缺乏明显的微卫星序列。
依据Weber(1990)提出的微卫星序列分类标准,可以把微卫星序列划分为完全的(Perfect)、不完全的(Imperfect)和复合的(Compound)3类。
完全的微卫星是指没有中断的重复序列,不完全的微卫星指具有1个或多个中断的重复序列,复合的微卫星则指不同种重复序列被3个以下的非重复碱基间隔。
在得到的53个微卫星完整序列中,完全的微卫星共29个,占54 7%;不完全的11个,占20 8%;复合的13个,占24 5%(表1)。
在表1 长牡蛎(CA)n 富集文库中微卫星克隆特性Tab.1 Characterization of microsatellite clones from the (CA)n -enriched library in the Paci fic oyster克隆 核心重复序列(5 3 )分类(Weber,1990)GenBank 注册号Cg127(CA)17AA(CA)3AA(CA)5Imperfect AB114042Cg136(CA)20Perfect AB114043Cg152(GC)5(C A )28TA(CA)4Compound AB114044Cg211(CA)44Perfect AB114045Cg229(CA)12C(C A)12(GA)28Compound AB114046Cg236(CA)26CGCA)3(GA)2(CGCA)2(CA)8Perfect AB114047Cg248(CA)44CG(CA)8Imperfect AB114048Cg411(CAC T)39(GAC T )8Compound AB114049Cg429(CT)20(CA)12Compound AB114050Cg431(CA)8(C T )10(CA)6CC(C T )8Compound AB114051Cg436(CA)54Perfect AB114051Cg459(CA)42Perfect AB114052Cg52(CA)9AA(CA)60Imperfect AB114153Cg87(CA)28PerfectAB114154366 海 洋 与 湖 沼35卷续表克隆 核心重复序列(5 3 )分类(Weber,1990)GenBank 注册号Cg829(CA)18Perfect AB114155Cg958(CT)19Perfect AB114156Cg160(CA)6(CGCA)5TA(CGCA)7Compound AB114157Cg172(CA)37Perfect AB1141580C g173(CCTTA)15(CCACA)3TC(TC GCC)4Compound AB114159Cg337(CA)28Perfect AB114160Cg47(CA)11Perfect AB114161Cg419(CA)7Perfect AB114162Cg511(CA)15Perfect AB114163Cg614(CA)20Perfect AB114164Cg659(CA)10Perfect AB114165Cg79(CG)3(C A )19TA(CA)27Compound AB114166Cg710(CA)30Perfect AB114167Cg751(GC AC)10A(CA)5C G(CA)4Compound AB114168Cg92(GT)29G(GC T )3Compound AB114169Cg935(CA)53Perfect AB114170Cg945(CA)7CG(CA)3TA(CA)35Imperfect AB114171Cg344(CA)50Perfect AB114172Cg612(CA)5CG(CA)9C(CA)6C(CA)23TAT (CA)5Imperfect AB114735Cg625(CA)20Perfect AB114174Cg247(CA)6Perfect AB114175Cg647(CA)11Perfect AB114176Cg247(CA)6Perfect AB114177Cg521(CA)18(CGCA)8Compound AB084072Cg326(CA)36Perfect AB084073Cg428(CA)27TA(CA)22CG(CA)4CG(C A)9Imperfect AB084074Cg433(CA)32CG(CA)11GC(CA)4GC(CA)3Imperfect AB084075Cg552(CA)6Perfect Cg623(CA)16C T (CA)6GA(C A )22Imperfect Cg538(CA)35TAT (CA)7Imperfect Cg319(CA)36Perfect Cg919(CA)26TA(CACG)3Compound Cg632(CA)38Perfect Cg337(CA)28Perfect Cg338(CA)6Perfect Cg126(CA)28TA(CA)23CG(CA)6Imperfect Cg168(CA)9Perfect Cg414(CA)24AA(CA)5AA(CA)14AA(CA)9Imperfect Cg817(CA)22(CGCA)4(CG)3Compound Cg628(CA)n Interrupted Cg196(CA)n Interrupted Cg421(CA)nInterruptedCg818(CCCCAGCGTATATGTC TGTGTGACAG)6Cg556(AC ACAACACACACAACT)64期李 琪等:长牡蛎(Crassostrea gigas )微卫星克隆快速分离及特性分析367这些微卫星克隆中,重复单元除CA 外,还观察到CT 、ACT 、CGCA 、C AC T 、GACT 、GCAC 、CC TTA 和CCTC A 的重复序列。