鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF基因的分子克隆、生物信息学与免疫原性分析
嗜水气单胞菌孔蛋白OmpF重组表达及其免疫原性分析
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2019, 35(9):23组表达及其免疫原性 分析
高云山 刘丹丹 徐俊林 桑雨浓 梁夏夏 刘建欣 王文彬
（1. 江苏海洋大学海洋生命与水产学院，连云港 222005 ；2. 江苏海洋大学江苏省海洋生物技术重点实验室，连云港 222005）
关键词 ： 嗜水气单胞菌 ；外膜蛋白 OmpF ；重组表达 ；免疫原性 DOI ：10.13560/ki.biotech.bull.1985.2019-0628
Recombinant Expression and Immunogenicity Analysis of the Porin Protein OmpF of Aeromonas hydrophila
Abstract: Outer membrane protein（Omp）F in Aeromonas spp. is β-barrel like porin，and involves in the adaption of osmotic pressure and is highly conservative in this common pathogen for human and fish，thus poses a promising research value as immune-detection target. The A. hydrophila OmpF fragment published in GenBank was synthesized，and inserted into plasmid pET-28a（+）. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21（DE3）and induced by isopropy-β-D-thiogalactoside（IPTG）. The molecular size of the expressed protein was about 40 kD，which mainly expressed as inclusion bodies after optimization of inducing temperatures and IPTG concentrations. BALB/c mice were immunized with purified OmpF inclusion bodies. The results of ELISA showed that the immunized mice serum cross-reacted with 10 of 11 boiled and deactivated strains of Aeromonas spp.，the serum titers were around 1∶81 000. However，the mice serum did not react with Vibrio cholerae，Bacillus licheniformis，V. parahaemolyticus，V. vulnificus，and V. anguillarum. The above results indicate that the protein OmpF is immunogenic，conserved and was promising in developing Aeromonas cross-reactive antibodies.
羊布鲁菌外膜蛋白omp2b的克隆原核表达及纯化
羊布鲁菌外膜蛋白omp2b的克隆原核表达及纯化张蕾;徐志凯;张芳琳;张亮;于澜;白文涛;应旗康;李凯;程林峰;叶伟;吴兴安【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2011(011)035【摘要】研究羊布鲁菌外膜蛋白omp2b基因的克隆,原核表达,以及纯化.根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白omp2b蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为1 130 bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-omp2b.在大肠埃希菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化.用Western-blot分析方法鉴定纯化蛋白.结果成功构建了pGEX-4T-1 -omp2b原核表达载体并在大肠埃希菌中表达了omp2b基因,纯化后所获得的蛋白与目的蛋白大小一致且与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应,说明其为布鲁菌omp2b蛋白.本研究成功构建了pGEX-4T-1 -omp2b原核表达载体,并且在大肠埃希菌中进行表达,纯化的omp2b 蛋白具有良好的免疫原性.%To clone, express and purify B. Melitensis outer membrane protein omp2b. An 1 130 bp gene was amplified from B. Melitensis with PCR method, and then the PCR product was subcloned into vector pGEX-4T-l and expressed in E. Coli. It was purified via affinity chromatography purification system. The purified protein was detected by Western-blot. According to the SDS-PAGE and Western-blot analysis, the recombinant plasmid pGEX-4T-l-omp2b could be expressed successfully in E. Coli and the purified protein could react with serum from Brucella infected rabbit. The ompib gene was constructed and purified successfullyand the good immunogenicity of the protein with high efficiency of expression was demonstrated.【总页数】6页(P8705-8710)【作者】张蕾;徐志凯;张芳琳;张亮;于澜;白文涛;应旗康;李凯;程林峰;叶伟;吴兴安【作者单位】第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032;第四军医大学微生物学教研室,西安710032【正文语种】中文【中图分类】R378.5【相关文献】1.羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d的原核表达、鉴定及纯化 [J], 张蕾;张芳琳;张亮;王海涛;胡刚;吴兴安;徐志凯;白文涛2.羊布鲁菌外膜蛋白Omp22的原核表达及鉴定 [J], 张亮;张蕾;张芳琳;李璞媛;李凯;吴兴安;徐志凯;白文涛3.羊布鲁菌外膜蛋白Bp-26基因的克隆及其原核表达 [J], 史巧芸;荣辉;郭莳雨;贾晓晓;张珈宁;朱华培;杜丽;成鹰;焦寒伟4.布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析 [J], 徐杰;陈泽良;王玉飞;汪舟佳;乔凤;钟志军;杜昕颖;赵瑾;曲勍;高岚5.布鲁菌VirB5基因的克隆和原核表达及其蛋白纯化 [J], 房姣阳;李会玲;李俊玫;靳亚平;王爱华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
布鲁氏菌外膜蛋白OMP10与宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定及其功能研究
布鲁氏菌外膜蛋白OMP10与宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定及其功能研究布鲁氏菌是一种危害人类和养殖动物健康的细菌，它通过外膜蛋白与宿主细胞进行互作来实现其病理效应。
其中，外膜蛋白OMP10被认为在布鲁氏菌感染过程中发挥重要的角色。
本文旨在通过筛选和鉴定与OMP10相互作用的宿主细胞蛋白，并研究其功能，以深入了解布鲁氏菌与宿主细胞的相互作用机制。
首先，我们通过利用酵母双杂交技术筛选出与OMP10相互作用的宿主细胞蛋白。
将OMP10的基因克隆到酵母表达载体中，并构建酵母双杂交报告质粒。
将该质粒转化至酵母菌株中，并通过培养于选择性培养基上来筛选出与OMP10相互作用的酵母克隆。
随后，从筛选出的阳性克隆中提取质粒，通过测序鉴定其带有的宿主细胞基因序列。
通过生物信息学分析，我们发现OMP10与一系列与蛋白翻译后修饰、胞内运输、凋亡调控等相关的宿主细胞蛋白发生了相互作用。
其中特别引起我们的注意的是一种名为NF-κB的转录因子。
NF-κB在免疫应答中扮演重要角色，其激活可诱导一系列免疫反应基因的表达。
此外，NF-κB还参与细胞凋亡和炎症反应的调节。
这提示OMP10可能通过与NF-κB相互作用来调控宿主细胞的免疫应答和炎症反应。
为了验证NF-κB与OMP10的相互作用，我们利用共免疫沉淀实验进一步验证了两者的结合。
通过过表达OMP10和NF-κB，并共转染至293T细胞中，发现NF-κB可以与OMP10相互作用，并形成复合物。
此外，我们还观察到OMP10的表达能够促进NF-κB的核定位，进一步支持了两者的相互作用。
接下来，我们进一步研究了OMP10和NF-κB相互作用的功能。
通过siRNA敲降NF-κB的表达，发现在布鲁氏菌感染下，NF-κB的沉默能够显著减少细胞产生的炎症因子，如IL-1β和TNF-α。
这表明NF-κB的活化是布鲁氏菌感染中炎症反应的重要调节因子，而OMP10与NF-κB的相互作用可能是布鲁氏菌促进炎症反应的机制之一。
布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)的制备及免疫原性评价
布鲁氏菌外膜囊泡（OMVs）的制备及免疫原性评价布鲁氏菌外膜囊泡（OMVs）的制备及免疫原性评价布鲁氏菌是一种引起布鲁氏菌病的致病菌，该疾病在许多动物种群中广泛传播，也可感染人类。
由于布鲁氏菌引起的疾病严重影响了人类和动物的健康，因此寻找一种有效的预防和治疗方法对于疾病的控制至关重要。
在布鲁氏菌研究中，外膜囊泡（OMVs）被发现具有潜在的免疫原性和药物传递特性，因此引起了研究人员的广泛关注。
OMVs是细菌细胞外膜片段，在细菌分裂时通过骨骼蛋白的调节被放出。
OMVs主要由脂质双层包围，包含主要的外膜蛋白（OMP）以及一些细胞内成分。
OMVs对于细菌的存活和传递外输信息具有重要作用，同时也被认为具有免疫活性。
在制备布鲁氏菌OMVs的过程中，最重要的是选择合适的菌株。
布鲁氏菌中的OMVs制备主要依赖于两种方法：自然释放和人工诱导。
自然释放是指在培养布鲁氏菌菌株时，OMVs自然释放到培养基中；人工诱导则是通过特定的处理方法诱导细菌释放OMVs。
一般而言，人工诱导的方法更常用且更可控，可以根据需要调整相应的参数。
这些方法包括使用低渗透压、超声波、化学诱导剂和热激等。
制备好的OMVs需要进行免疫原性评价，以确定其是否适合用作疫苗候选物。
免疫原性评价通常包括体外实验和体内实验两个方面。
在体外实验中，将OMVs与免疫细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）共培养，观察其诱导细胞因子的释放、共刺激分子表达以及免疫细胞的活化情况。
体内实验则是在动物模型中，给予OMVs进行免疫接种，并评估其对免疫系统的激活程度和保护效果。
OMVs作为一种潜在的疫苗候选物，在布鲁氏菌病的预防和治疗中具有广阔的应用前景。
研究表明，OMVs可以诱导机体产生特异性的免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫。
此外，OMVs还可以通过与抗原递呈细胞相互作用，激活免疫系统并促进抗原的处理和呈递，从而增强免疫应答。
由于OMVs相较于整菌疫苗而言具有更强的免疫原性和更低的毒性，因此被认为是一种更安全有效的布鲁氏菌疫苗。
新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白omp2b基因的克隆与序列分析
新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白omp2b基因的克隆与序列分析滕文军;陈创夫;王远志;任雪艳;刘文进【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2005(26)5【摘要】根据已报道的绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白基因omp2b的核酸序列设计引物,从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组中扩增到了omp2b基因.将该片段克隆到PBS-T 载体上,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定,证明所得到的片段为阳性重组子.与报道的绵羊种布鲁氏菌omp2b序列有89.72%的同源性,并在N端存在高度保守区.至此得到omp2b基因的全长克隆,通过对所克隆的基因和其他布鲁氏菌外膜蛋白omp2b的进化树分析,发现其和牛种布鲁氏菌的亲缘关系最近,同源性较高.【总页数】4页(P21-24)【作者】滕文军;陈创夫;王远志;任雪艳;刘文进【作者单位】新疆地方与民族高发病实验室,新疆,石河子,832003;新疆地方与民族高发病实验室,新疆,石河子,832003;新疆地方与民族高发病实验室,新疆,石河子,832003;石河子大学生物工程学院,新疆,石河子,832003;新疆地方与民族高发病实验室,新疆,石河子,832003【正文语种】中文【中图分类】S826.2;Q781【相关文献】1.新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因的克隆及序列分析 [J], 刘辉;陈创夫;许程剑;王远志;韩亚杰2.新疆绵羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP2b的克隆与表达 [J], 滕文军;陈创夫;任雪艳;王远志;杨丽鹃;包彗芳;刘文进3.新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b基因的克隆与表达[J], 滕文军;陈创夫;任雪艳;王远志;杨丽鹃;包彗芳;刘文进4.新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因与GroEL基因的克隆及其原核表达 [J], 刘辉;陈创夫;韩亚杰;董玲;许程剑5.新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因的克隆与序列分析 [J], 刘辉;陈创夫;韩亚杰;董玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
布鲁氏菌外膜蛋白OMP15.6表达及免疫反应原性测定
摘 要 ： 达羊布鲁 氏菌 １Ｍ 预测外膜蛋 白 Ｏ １ ．， 索其作 为诊 断抗原 的可 能性 。采用 降落 Ｐ Ｒ方法 ， 表 ６ ＭＰ ５ 探 ６ Ｃ 从 羊布鲁 氏菌 １Ｍ 基 因组 Ｄ Ａ 中扩 增 出 ４ ３ ｐ的基 因片段 ， ６ Ｎ ２ｂ 将该 片段克 隆于原核表 达载体 Ｐ Ｅ ４ ． ， 建重组 Ｇ Ｘ一Ｔ ２ 构 表 达载体 。经 ＩＴ Ｐ Ｇ诱 导 ，ＤＳＰ Ｅ 检 测 ，结果 表 明 ，在 大肠杆 菌 中成 功表 达 了外 膜蛋 白 Ｏ １ ．。经 Ｗｅｔ Ｓ —ＡＧ ＭＰ ５ ６ ｓ ． ｅ ｂｏｔ ｇ 测 ， ｍ．ｌｔｎ 检 ｉ 该蛋 白能与豚 鼠抗布鲁 氏菌 阳性血 清发 生特异性免 疫反应 ， 为其之 后 的抗 原性 以及 免疫原 性研 究
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１ ． ５６
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布 鲁 氏菌 病 是世 界 范 围 内引 起 １２ 血清与 抗体 豚 鼠抗布 鲁 氏菌 每 降 一 度 ２个 循 环 ，５℃ 时 １ ． ５ ０个 循 的人畜共 患病重要病 原体之 － ［ ” 。世 阳性 血清 由本实验 室置备 ； 羊抗豚 鼠 环 ， ２℃延伸 ９ ， ３ ７ ０Ｓ共 ６个循 环 ； 最 界 部分 地 区在 ２ ０世 纪 ８ ０年 代 中期 ＩＧ购 自北京百奥康生物技术 有限公 后 ７ ｇ ２℃延 伸 １ ｎ ０ｍｉ。 后 ，我 国 自 ２ ０世 纪 ９ ０年代 后期 ， 布 司 。 １３ ４ 重组表 达 载体 的构 建 Ｐ Ｒ ．． Ｃ 鲁 氏菌病 疫情 一直呈现 回升态 势 ， 是 １３ 目的 片段 的 Ｐ Ｒ扩 增 和 重 组 产 物 Ｂ ｍＨ 和 Ｅ ｏ Ｉ双 酶 切 后 ， ． Ｃ ａ Ｉ ｃＲ 和 在持 续稳定下 降 ２ Ｏ年 后 的 大 幅 度 反 表 达 载 体 的构 建 同 样 用 Ｂ ｍ 和 Ｅ ｏ Ｉ 酶 切 的 表 ａ ＨＩ ｃＲ 双 弹 。目前 国内外 尚缺乏 高效的布鲁 氏 １３ １ 引 物 的 设 计 与 合 成 根 据 达 载体 Ｐ Ｅ 一Ｔ ２连 接 ，将 连接 产 ．． Ｇ Ｘ４ ． 菌疫苗 。 布鲁 氏菌细 菌学检测在方法 ＧｅＢ ｎ 中 Ｏ ｎ ａＫ ＭＰ ５ １． ６对应 的基 因设 物 转化入 感受态 细胞 Ｂ ２ ，在 带有 Ｌ１ 上存在 安全性 差、 时耗 力和诊 断通 计 引物 ，并 引入 Ｂ ｍ 和 Ｅ ｏ Ｉ 耗 ａ ＨＩ ｃ Ｒ 酶 氨苄抗 性的 Ｌ Ｂ平板上 ，筛选 阳性菌 量低 等缺点 ； 利用细菌 多糖抗 原的血 切位点 。 引物 由上海 生工生物技术有 落 。 将该平板 上的单个菌落导入含有 清 学检 查存 在 交叉 反应 及 不 能鉴 别 限 公 司 合 成 。 氨 苄的 Ｌ Ｂ液 体 中 ，７℃ 过 夜 摇 动 ３ 临床感 染动 物 和疫 苗 免 疫动 物 等缺 上 游 引 物 ５ Ｇ ’ ＧＧ Ｔ Ｃ 后 ， 质 粒酶 切鉴 定 ， 接 以菌 液为 Ｃ Ａ Ｃ 提 直 ＧＣ Ｔ ＡＣ Ｔ Ｃ ＡＴ ＧＣ ＧＡＣ Ｔ ３； ＣＴ Ｔ ’下 模 板进 行 Ｐ Ｒ鉴 定， 陷， 使动物布 病防控技 术 临床 应用 致 Ｃ 并送 公司测 序 。 受Ｎ ￣Ｎ［ 布 鲁氏菌抗原成分复杂 ， 游 引物 ５ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ＧＴ ＡＴ １４ 重组表达 载体 的诱导表 达 将 ２ １ 。 ’ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ ． Ｃ ’ 有 脂多糖 、 多糖 、 Ｏ 外膜 蛋 白等 ， 研究 ＴＣＴＴＣＡ ＴＣＡ ＧＧ ３ 。 测序 正确 的 阳性 菌 液导 入含 有氨 苄 发 现布 鲁 氏菌 外膜 蛋 白具有 很好 的 １ ． 基 因组模 板 Ｄ Ａ 的提 取 取 的 ２ ．２ ３ Ｎ ＹＴ液 体培 养 基 ，７℃培 养 至菌 ３ 免 疫原性［１ ２。为此 ， － ３ 本研 究试 图通过 灭 活 的羊 种 布 鲁 氏菌 １ 菌 液 １ 液 的 ０ 值 在 ０ ．． 时 加 入 ６ Ｍ ５ Ｄ ．１ ５ ０ 大肠 杆菌表达 、 鉴定 蛋 白的免疫反应 ｕＬ，用 １５ｕ Ｌ ＮＥ重悬 之 后加 入 ＩＴ ＩＴ 终 浓 度 分 别 为 ０ ３ Ｔ Ｐ Ｇ， Ｇ Ｐ ． ｍＭ、 ５ 原性 ， 以便 为进～步 寻找诊 断性抗原 １ ５ ｕ Ｌ 含 ２ Ｔ ｉ ｎ Ｘ一０ Ｔ ３ ％ ｒ ｏ １ ０ ＮＥ 洗 １ ｔ ． ｍＭ、 ． ｍＭ，分 ２ｈ ４ｈ ６ｈ取 ０ ２０ 、 、 提 供理论依据 。 涤。 然后加入新鲜配置 的 ５ ／ ｍＬ的 样 ， ｍｇ 检测 蛋 白是 否表 达 ， 并确 定 最佳 １ 材 料 与 方 法 溶菌酶 ３ Ｌ ０ ，轻弹 混匀， ７℃水浴 表 达 条 件 。 ３ １ １ 菌 株 、载体 羊布鲁 氏菌 １Ｍ ３ ｎ 再 加 入 ５ｍｇ ． ６ ０ｍｉ。 ／ 蛋 白 酶 Ｋ １ ５ Ｗ ｅｔ －ｂｏｔ ｇ检 测 表 达 蛋 ｍＬ ． ｓｒ ｅ ｎ ｌｔｎ ｉ １ ，５℃水浴孵 育过夜 ，最后加 白 的 免 疫 原 性 重 组 的 Ｏ １ ． ５ｕ Ｌ ６ ＭＰ ５ ６蛋 灭 活菌 株及 Ｐ Ｅ ．Ｔ ２表 达载 体均 Ｇ Ｘ４ 一 由本实验室保存 。 入 １ ｍＬ的 Ｒ Ａｓ，２ ０ｕ ｅ Ｃ Ｎ ｅ－ ０℃保 存 白经 １％Ｓ —Ｐ Ｅ凝 胶 电泳 后 ， ２ ＤＳ ＡＧ 半干转 印 至硝酸 纤维 素膜 ，０ １％马血 基金项 目： 现代农 业（ 肉牛 ） 业技术体 系建设 备用 。 产 Ｃ ７℃封 闭 １ ，Ｂ Ｔ洗 涤 ３次 ， ＰＳ ｈ 与 专 项 资金 ； 国 家科技 部科 技 支撑 计 划项 目 １３ ３ 目的 基 因 的 Ｐ Ｒ 扩 增 反 清 ３ ．． 应 条件 为 ９ ４℃预 变性 ３ ｎ ９ ℃变 １ ０ ；４ ｍｉ ： ０稀释 的豚 鼠抗布鲁 氏菌 阳性血 ５ （ ０ ６ Ａ ０ Ａ ５ ０ ） ２ ０Ｂ Ｄ ４ ０－ ３ ； 性 ４ ， 火 温 度 从 ６ ５ 退 Ｓ ５℃ 降 到 ５ ５℃ ， 清 作 用 ７ ｍｉ，Ｂ Ｔ洗 涤 ３次 ， １ ０ ｎＰ Ｓ 与 ： 通讯作者 ： 吴清民
外膜蛋白Omp25在布鲁氏菌毒力及免疫保护中的作用研究
外膜蛋白Omp25在布鲁氏菌毒力及免疫保护中的作用研究布鲁氏菌病是一种危害严重的人兽共患病,在世界范围内有广泛流行,给人类健康和经济发展带来巨大损失。
布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,具有比较独特的胞内生存机制和免疫机制。
它的致病机制以胞内生存为主要特征,而免疫机制则是在与宿主免疫系统斗争中逃避免疫反应而得以生存繁殖。
针对布鲁氏菌的有效的免疫反应以细胞免疫为主,并且是多种抗原综合作用的结果。
深入探讨布鲁氏菌的胞内生存机制和免疫保护机制,对于布鲁氏菌致病机制的理解、疫苗的保护机制以及新型疫苗的研发等具有重要意义。
外膜蛋白在稳定细菌外膜的结构、适应胞内外环境和抵抗胞内杀菌机制等方面起着重要作用,与细菌的毒力有密切关系。
外膜蛋白位于细菌的表面,容易被免疫系统识别,在与宿主的相互作用中发挥作用。
另一方面,很多外膜蛋白都具有免疫原性,其中很大一部分是免疫保护抗原。
因此,很多有关细菌致病机制和免疫反应机制的研究都集中在外膜蛋白的研究上。
布鲁氏菌病的控制重在预防,大规模接种疫苗是有效控制疾病的重要措施。
事实证明,尽管经历了很多对其它疫苗形式的尝试,如亚单位疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗等,但是减毒活疫苗仍是目前预防布鲁氏菌病最为有效的疫苗形式。
减毒活疫苗之所以能够发挥有效的免疫保护作用,是否与其外膜的成分,特别是外膜蛋白有关?或者说外膜蛋白在减毒活疫苗中发挥了什么样的作用?这些问题的回答,有利于解释布鲁氏菌疫苗的作用机制和保护机制,也有利于进一步开发新型的疫苗。
为研究布鲁氏菌主要外膜蛋白在布鲁氏菌毒力和免疫保护中的作用,本研究中,我们首先利用蛋白质组技术,分离鉴定布鲁氏菌的外膜蛋白,明确外膜蛋白的组成。
然后,选取主要的外膜蛋白,构建其缺失突变株,并比较分析这些突变株的胞内外的毒力表型,探讨其与毒力的关系。
用M5及缺失突变菌株免疫小鼠,然后用M5本身和羊种布鲁氏菌强毒株16M 进行攻击,观察M5及突变菌株的免疫保护性,探讨主要外膜蛋白在疫苗株免疫保护中的作用及其机制。
大肠杆菌外膜蛋白F的原核表达、多克隆抗体制备及生物信息学分析
大肠杆菌外膜蛋白F的原核表达、多克隆抗体制备及生物信息学分析伍娜娜;康超;荣娜;刘祥;陈春琳;陈琛;丁锐;吴三桥【摘要】为获得大肠杆菌外膜蛋白OmpF并对其耐药性功能进行研究,通过分子克隆技术构建OmpF蛋白重组表达菌株,利用正交试验法获得OmpF菌株的最佳培养条件和表达条件,采用SDS-PAGE电泳切胶纯化方法获得OmpF蛋白,免疫小鼠获得OmpF蛋白多克隆抗体,Western blotting方法检测多克隆抗体的特异性,使用DNAMAN 8.0与MEGA 5.0软件对OmpF蛋白进行同源性和系统发生分析.结果显示,PCR扩增获得1089 bp的ompF基因,成功构建pET-32a-ompF载体,其诱导表达产物分子质量为38 ku,与预期大小一致.正交试验获得OmpF菌株的最佳培养条件为葡萄糖浓度为0,转速为230 r/min,装液量为50 mL;最佳表达条件为诱导时菌液OD600为0.5,IPTG终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为8 h,温度为28℃.SDS-PAGE切胶纯化获得高纯度的OmpF蛋白后,利用Western blotting证实OmpF蛋白抗血清具有较好的特异性.OmpF蛋白序列系统发生分析发现,OmpF 蛋白在不同种类的细菌中具有较高的同源性,OmpF蛋白产生的抗体可能为不同种细菌的感染提供交叉免疫保护作用,并且不同种类细菌中OmpF蛋白可能具有相似的分子功能.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2019(048)003【总页数】8页(P145-152)【关键词】大肠杆菌;外膜蛋白OmpF;原核表达;正交试验;诱导条件;生物信息学分析【作者】伍娜娜;康超;荣娜;刘祥;陈春琳;陈琛;丁锐;吴三桥【作者单位】陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所,陕西汉中723001;陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所,陕西汉中723001;陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所,陕西汉中723001;陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所,陕西汉中723001;陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所,陕西汉中723001;陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所,陕西汉中723001;陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所,陕西汉中723001;陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所,陕西汉中723001;陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心,陕西汉中723001【正文语种】中文【中图分类】S852.4;Q816大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)属于革兰氏阴性短杆菌，是一种人畜共患的机会性病原菌，在一定条件下可引起人类的脑膜炎、腹泻、败血症[1-4]，奶牛和奶山羊的乳房炎[5]，以及鸡的肝周炎、心包炎、气囊炎和脐炎等疾病[6]，不仅威胁人类健康，给养殖业造成严重的经济损失，还会对奶制品带来巨大的安全隐患。
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鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF基因的分子克隆、生物信息学与免疫原性分析王二龙;秦振阳;汪开毓;陈德芳;王均;贺扬【摘要】为筛选潜在的保护性抗原基因研制鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)基因工程疫苗,实验利用特异性引物扩增分离自斑点叉尾(鲴)(Ictalurus punctatus)的Y.ruckeri外膜蛋白ompF基因并对其进行分子克隆,应用相关软件和程序对其核苷酸及氨基酸序列进行生物信息学分析,并进行了ompF蛋白的表达和免疫原性检测.结果显示,ompF基因全长1 095 bp(GenBank登录号KP159420),包含一个编码364个氨基酸的完整开放阅读框,其氨基酸序列具有极高保守性,与Y.ruckeri外膜穿孔蛋白ompF(GenBank登录号ADK27779.1)亲缘关系最近,序列一致性为99.2％,进化树聚为一支;具有1个革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,存在1个信号肽和1个跨膜区,是一种跨膜蛋白;具有12个与免疫相关的抗原决定簇区域.SDS-PAGE分析发现该蛋白主要以包涵体形式表达在沉淀,经Western-bolt显示ompF 蛋白具有较好的免疫原性.以上结果表明ompF基因可作为Y.ruckeri基因工程疫苗的候选抗原基因.【期刊名称】《南方水产科学》【年(卷),期】2016(012)003【总页数】11页(P24-34)【关键词】鲁氏耶尔森氏菌;外膜蛋白;ompF基因;分子克隆;生物信息学;免疫原性【作者】王二龙;秦振阳;汪开毓;陈德芳;王均;贺扬【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130【正文语种】中文【中图分类】S941.42鲁氏耶尔森氏菌(Yersiniaruckeri)，隶属肠杆菌科、耶尔森氏菌属，呈革兰氏阴性短杆状，是冷水性鲑科鱼类红嘴病(Enteric redmouth disease，ERM)的主要病原菌[1]。
早在1952年美国首次发生虹鳟(Salmogarirdneri)红嘴病，1966年RUCKER等[2]从患病虹鳟体内首次分离得到该病原菌。
自1952年发现以来，该菌的地理分布和宿主范围已有明显扩大，现流行于澳大利亚、南非和西欧等地，中国近年来也有该菌感染养殖鱼类发病的报道[3-5]。
鲁氏耶尔森氏菌除几乎对所有的鲑鳟鱼类养殖品种都具感染性外，亦可感染其他鱼类如鲤科(鲢、鳙、鲤、金鱼)、鳗、罗非鱼和鲟鱼等[4,6]，具有广泛的致病性。
2008年3月～4月，四川简阳三岔湖网箱养殖的斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)爆发急性传染性疾病，死亡率高达85%，发病鱼表现为口腔周围、下颌、腹壁大量针尖状出血，剖检后发现内脏器官不同程度出血，经检测诊断为鲁氏耶尔森氏菌感染[7-8]。
鲁氏耶尔森氏菌病已对水产养殖业造成严重的经济损失，相应的防治措施亟需建立。
研究发现，镶嵌在细菌表面的外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)是一种重要的保护性抗原，能有效激发宿主的体液免疫和细胞免疫，具有良好的免疫保护作用，是候选亚单位疫苗最具潜力的免疫抗原成分之一[9-12]。
外膜蛋白ompF(outer membrane protein F)作为肠杆菌科的主要膜孔蛋白(Porin)之一，是细菌外膜上的一种非特异性、跨越细胞膜的水溶性的蛋白通道[13]。
研究报道，ompF作为目的抗原对抵抗铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和致病性大肠杆菌(E.coli)感染具有良好的免疫保护效果[14-15]。
鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF具有典型的革兰氏阴性菌外膜中β-结构孔蛋白的空间结构，且ompF在耶尔森氏菌属中具有较高的保守性，与生物和非生物因素相互作用参与细菌在体内的致病过程[16-17]。
此外，因其位于细胞膜外表面，表面暴露的抗原决定簇和抗原表位可被宿主识别并结合引发免疫反应。
目前关于斑点叉尾的鲁氏耶尔森氏菌基因工程疫苗研究几乎空白，仅有早期Y.ruckeri灭活疫苗的研究[18-19]，对其外膜蛋白作为亚单位疫苗的研究尚未见报道。
因此筛选外膜蛋白ompF作为亚单位疫苗的候选目的抗原，对控制和预防鲁氏耶尔森氏菌感染具有很大的研究和应用价值。
文章在前期斑点叉尾源鲁氏耶尔森氏菌分离、鉴定的基础上，设计特异性引物PCR扩增Y.ruckeri外膜蛋白ompF基因，通过分子克隆、双酶切和测序鉴定验证扩增得到的基因为ompF基因，应用生物信息学分析工具对ompF基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行全面的分子特性分析和ompF蛋白的抗原表位预测，并进行了ompF蛋白的原核表达和免疫原性分析，为筛选ompF作为斑点叉尾抵抗鲁氏耶尔森氏菌感染的候选亚单位疫苗目的抗原基因提供了理论依据，同时为进一步研究ompF基因的生物学功能，了解ompF基因结构与功能的关系提供一定的理论参考。
1.1 菌株斑点叉尾源鲁氏耶尔森氏菌由四川农业大学鱼病研究中心从患病斑点叉尾分离、鉴定并保存，命名为Yr-WEL01。
大肠杆菌DH5α/BL21(DE3)感受态购自天根生化科技(北京)有限公司。
含表达载体pET32a的工程菌由四川农业大学鱼病研究中心保存。
1.2 主要试剂PCR PreMix、细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
pMD19-T(Simple)克隆载体、T4DNA连接酶、DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。
质粒小量抽提试剂盒、Ni-NTA树脂亲和层析柱购于上海生工生物工程有限公司，限制性内切酶NcoⅠ和SacⅠ购自Thermo Scientific公司。
兔抗鲁氏耶尔森氏菌血清由四川农业大学鱼病研究中心制备并纯化。
1.3 引物设计与合成参考GenBank中鲁氏耶尔森氏菌Nr34/85菌株的ompF基因全序列(登录号HM142671.1)，运用Primer 5.0和Oligo 6.0软件在其完整的开放阅读框(ORF)上设计上下游引物以扩增ompF基因的全序列，并添加酶切位点。
引物序列分别为上游引物(F)5′-CCATGGATGAAGCGCAATATTCTTGCAGTAGTA-3′，下游引物(R)5′-GAGCTCTTAGAACTGATAAACCAAGCCAACA-3′，下划线分别为添加的酶切位点NcoⅠ和SacⅠ,预期扩增片段大小为1 098 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.4 菌株培养、DNA提取与PCR扩增挑取低温保存的鲁氏耶尔森氏菌Yr-WEL01菌株接种于BHI脑心浸液营养肉汤中，于28 ℃、120 r·min-1的恒温水浴摇床培养过夜，取2 mL菌液于8 000×g离心2 min收集菌体，根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取菌体基因组DNA，以提取的DNA为模板，设置如下参数进行ompF基因的PCR扩增：PCR 反应体系为25 μL，其中PCR PreMix 12.5 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，无菌超纯水8.5 μL。
反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
取5 μL反应产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳，经凝胶成像系统检测并照相。
1.5 ompF基因的T克隆、鉴定与测序PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA凝胶回收试剂盒进行目的片段的胶回收，与pMD19-T(Simple)载体进行连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，铺板于含100 μg·mL-1氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37 ℃培养12～16 h后挑取单个菌落，增菌后采用质粒小量抽提试剂盒提取质粒，进行PCR 鉴定和单双酶切(NcoⅠ+SacⅠ)鉴定。
将鉴定筛选出的阳性重组质粒命名为pMD19-T-ompF，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果上传至NCBI获取Genbank登录号。
1.6 ompF核酸序列特征分析运用NCBI的ORF Finder工具进行ompF基因核酸序列的开放阅读框(Opening reading frame，ORF)分析[20]，NCBI的Blastn程序进行序列的相似性搜索[21]。
1.7 ompF氨基酸序列特征分析应用瑞士蛋白质专家网(http:∥)的ProtParam在线翻译工具将鲁氏耶尔森氏菌ompF基因的核苷酸序列翻译成氨基酸序列[22]，应用NCBICDD(Conserved Domains)查找工具分析氨基酸序列的保守结构域[23]；通过NCBI的Blastp程序对ompF氨基酸序列进行同源性检索[24]，Clustal X 2.0软件进行多序列同源矩阵分析，采用邻近法(neighbor-joining)于MEGA 5.0软件构建系统发育进化树[25-26]；应用ProtScale程序进行氨基酸序列亲/疏水性分析[27]，SignalP 4.1Server在线搜索工具查找信号肽序列[28]，TMHMM程序进行跨膜区预测[29]，NetPhos 2.0及NetNGlyc 1.0在线程序分析蛋白翻译后修饰的相关磷酸化位点和糖基化位点[30]；通过PSORTb 3.0程序进行蛋白质的亚细胞定位分析[31]，http:∥imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl网站进行ompF蛋白产物的抗原决定簇的预测[32]；应用SOMPA程序进行蛋白质二级结构预测[33]，SWISS-MODEL在线程序进行蛋白质三级结构同源建模[34]。
1.8 重组表达质粒pET32a-F的构建根据ompF基因的生物信息学分析结果去除信号肽，重新设计引物扩增ompF成熟肽序列。
引物序列分别为上游引物(ompF-F1)：CATGCCATGG-CAGAAATCTACAACAAAG，下游引物ompF-R1：CGAGCTCTTAGAACTGATAAACCAAGC，下划线分别为添加的NcoⅠ和SacⅠ酶切位点，酶切位点前为相应的保护性碱基，预期扩增大小为1 032 bp。
引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
按照1.4～1.5步骤进行重组克隆质粒的构建和鉴定，并命名为pMD19-T-F。