基因工程重组人干扰素概述
重组人干扰素b
重组人干扰素b什么是重组人干扰素b？重组人干扰素b是一种由人工合成的蛋白质，属于干扰素家族中的一员。
它在医疗领域中被广泛使用，被用于治疗多种疾病，如白血病、乙型肝炎和多发性硬化等。
在体内，重组人干扰素b能够刺激免疫系统的反应，从而增强身体的免疫力。
重组人干扰素b的作用机制重组人干扰素b主要通过影响人体的免疫系统来发挥作用。
它可以调节和激活多种类型的免疫细胞，如T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等，从而增强人体的免疫功能。
此外，重组人干扰素b还可以抑制病毒和细胞的生长，从而防止感染和肿瘤的发生。
重组人干扰素b的临床应用重组人干扰素b是一种非常重要的生物药物，在临床上有着广泛的应用。
以下是其主要的临床应用：1. 治疗白血病白血病是一种由于骨髓造血细胞恶性增生导致的血液系统恶性肿瘤。
在白血病的治疗中，重组人干扰素b被用作免疫调节剂，能够增强人体的免疫功能，从而提高患者的治疗效果。
2. 治疗乙型肝炎乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病，会导致肝脏损害和发炎。
重组人干扰素b能够抑制乙型肝炎病毒的复制和增殖，从而起到治疗乙型肝炎的作用。
3. 治疗多发性硬化多发性硬化是一种中枢神经系统的自身免疫性疾病，其特征是中枢神经系统的神经髓鞘受到破坏，导致神经细胞功能受损。
重组人干扰素b能够抑制炎性介质的释放，降低炎症反应，从而减轻多发性硬化患者的症状。
重组人干扰素b的不良反应正如其他药物一样，重组人干扰素b也可能引起一些不良反应。
这些不良反应包括以下几种：1. 发热和寒战重组人干扰素b可能引起患者出现发热和寒战的不适感觉。
这些症状通常会在治疗启动后几天内消失，但在一些情况下可能会持续更长的时间。
2. 肌肉和骨骼疼痛重组人干扰素b可以引起肌肉和骨骼疼痛的症状，这可能会影响患者的生活质量。
这些症状通常会随着治疗的进行而逐渐减轻。
3. 恶心和呕吐重组人干扰素b可能会引起患者感到恶心和呕吐的症状，这可能会影响患者的饮食和营养摄入。
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状重组dna技术的名词解释基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
重组dna技术的操作步骤工具(1)酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、(2)载体：质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒、人工染色体1.提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因;另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增，如使用PCR技术)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。
如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
人工合成基因的方法主要有两条。
一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。
另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
生物技术制药名词解释
生物技术制药名词解释生物技术制药是指利用生物技术手段，通过改变细胞或生物体的遗传物质，以生产药物或医疗产品的过程。
这一领域的发展已经取得了巨大的成就，为医疗行业带来了革命性的变革。
以下是一些与生物技术制药相关的名词解释。
1. 生物技术。
生物技术是指利用生物体、细胞或其组分进行实验室操作的一系列技术。
这些技术包括基因工程、细胞培养、蛋白质纯化等，可用于生产药物、治疗疾病、改良农作物等领域。
2. 基因工程。
基因工程是通过改变生物体的遗传物质，来产生特定的性状或产物。
这一技术在生物技术制药中被广泛应用，用于生产重组蛋白、激素、疫苗等药物。
3. 重组蛋白。
重组蛋白是指利用基因工程技术将外源基因导入到宿主细胞中，使其产生特定的蛋白质。
这些蛋白质常被用作药物，如重组人胰岛素、重组干扰素等。
4. 生物制药。
生物制药是指利用生物技术手段生产的药物。
与传统化学合成药物相比，生物制药具有更高的特异性和生物相容性，通常用于治疗癌症、糖尿病、风湿性关节炎等疾病。
5. 生物仿制药。
生物仿制药是指在原研药品专利到期后，其他公司生产的与原研药相似的生物制药产品。
生物仿制药的研发需要严格的生物等效性评价，以确保其与原研药在安全性和有效性上的一致性。
6. 基因治疗。
基因治疗是利用基因工程技术，将外源基因导入到患者体内，以治疗遗传性疾病或其他疾病的一种新型治疗方法。
虽然目前仍处于研究阶段，但基因治疗被认为具有巨大的潜力。
7. 细胞培养。
细胞培养是将动植物细胞在无菌条件下培养、增殖、传代的过程。
这一技术在生物技术制药中被广泛应用，用于生产细胞因子、单克隆抗体等生物制药产品。
8. 单克隆抗体。
单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
单克隆抗体被广泛应用于肿瘤治疗、自身免疫性疾病治疗等领域。
9. 疫苗。
疫苗是一种预防性的生物制品，通过激活机体的免疫系统，产生特定的抗体或细胞免疫应答，以预防传染病的发生。
生物技术制药中的疫苗包括重组疫苗、DNA疫苗等。
分析重组人干扰素α2β栓治疗人乳头瘤病毒感染的临床疗效
分析重组人干扰素α2β栓治疗人乳头瘤病毒感染的临床疗效人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是一种常见的性传播疾病，它可以引起多种不同类型的疾病，包括生殖器疣和宫颈癌。
在过去的几十年里，人们已经意识到干扰素对于治疗HPV感染起着重要作用。
干扰素是一种具有抗病毒和抗肿瘤活性的蛋白质，它在人体内可以激活免疫系统，抑制病毒复制和癌细胞的生长。
由于干扰素的短半衰期和副作用，其临床应用受到了一定的限制。
近年来，科学家们对干扰素进行了重组，制造出了一种新型的干扰素——重组人干扰素α2β。
重组人干扰素α2β是由人类基因工程技术合成的一种蛋白质药物，它具有更长的半衰期和更低的毒副作用，已经在临床上得到了广泛的应用。
在本文中，我们将对重组人干扰素α2β在治疗HPV感染中的临床疗效进行分析。
1. 重组人干扰素α2β的抗病毒机制重组人干扰素α2β具有强大的抗病毒活性，其机制主要包括：激活免疫系统，增强天然免疫细胞的活性；抑制病毒RNA和蛋白质的合成，阻断病毒复制；诱导细胞凋亡，清除感染的细胞。
这些机制使得重组人干扰素α2β能够有效地清除HPV病毒，从而治疗HPV 感染相关的疾病。
2. 重组人干扰素α2β在治疗生殖器疣中的临床疗效生殖器疣是由HPV感染引起的一种常见的性传播疾病，它会给患者带来生理和心理的困扰。
已有多项临床研究表明，重组人干扰素α2β可以显著减少生殖器疣的大小和数量，提高患者的生活质量。
重组人干扰素α2β还可以减少疣的复发率，降低患者的传染性。
这表明重组人干扰素α2β在治疗生殖器疣中具有良好的临床疗效。
宫颈癌是HPV感染的严重后果之一，目前仍然是全球范围内女性癌症发病率和死亡率的主要原因之一。
多项临床研究发现，重组人干扰素α2β可以有效预防宫颈癌的发生，特别是在早期HPV感染和宫颈上皮内瘤变的防治方面表现出良好的效果。
重组人干扰素α2β可以激活宫颈上皮细胞的免疫反应，清除感染的细胞，阻止宫颈上皮病变的进展。
重组人干扰素的作用与功效
重组人干扰素的作用与功效重组人干扰素的作用与功效引言：重组人干扰素（recombinant human interferon）是通过基因重组技术获得的人类干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学活性。
自20世纪80年代出现以来，重组人干扰素在临床上被广泛应用，取得了显著的疗效。
本文将对重组人干扰素的作用机制和功效进行详细的探讨。
一、重组人干扰素的种类和作用机制重组人干扰素主要包括α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素三个亚型，分别由不同的基因编码。
它们通过调节免疫系统的功能，抑制病毒复制和细胞增殖，发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫增强等作用。
1.1 α-干扰素的作用机制α-干扰素主要由多种细胞产生，如白细胞、纤维细胞等。
其主要作用是通过活化和增强免疫细胞的抗病毒能力，抑制病毒复制和细胞增殖。
具体机制包括：增强NK细胞活性，增加巨噬细胞的吞噬功能，增强T细胞的杀伤作用，抑制病毒蛋白合成等。
1.2 β-干扰素的作用机制β-干扰素主要由纤维细胞产生，其主要作用是通过抑制病毒复制和细胞增殖，发挥抗病毒作用。
具体机制包括：抑制病毒蛋白合成，阻止病毒RNA复制，促进巨噬细胞的吞噬作用，增强T细胞的杀伤能力等。
1.3 γ-干扰素的作用机制γ-干扰素主要由活化的T和NK细胞产生，其主要作用是通过调节免疫系统的功能，增强细胞杀伤作用，对病毒感染和肿瘤生长具有抑制作用。
具体机制包括：增强MHC-I类分子表达，提高细胞抗原呈递能力，增强T细胞的杀伤功能等。
二、重组人干扰素的抗病毒作用2.1 抗乙肝病毒作用重组人α-干扰素对乙肝病毒具有直接和间接的抑制作用。
直接作用是通过抑制乙肝病毒的DNA或RNA复制，减少病毒基因产物的合成；间接作用是通过增强宿主免疫反应，促进清除病毒感染的肝细胞。
临床应用重组人α-干扰素可明显改善乙肝病毒感染者的肝功能指标，减少病毒复制，降低肝癌发生率。
2.2 抗丙肝病毒作用重组人α-干扰素和重组人γ-干扰素对丙肝病毒具有抑制作用。
基因工程药物之干扰素的制备流程
基因工程药物之干扰素的制备流程干扰素是一种重要的生物制剂，被广泛应用于医学和生物制药领域。
其中，基因工程合成的干扰素具有高纯度和高效性，成为医药行业备受瞩目的制备临床药物之一。
下面将介绍基因工程制备干扰素的具体流程。
1. 选择干扰素基因：首先，需要确定要制备的干扰素类型，比如干扰素α、β或γ。
然后从合适的来源中提取相应的基因序列，这些基因将用于转染哺乳动物细胞中。
2. 克隆基因：将提取的基因进行PCR扩增，然后将扩增的基因与表达载体连接，形成重组质粒。
这一步大多数需要利用大肠杆菌进行克隆。
3. 转染细胞并表达：将重组质粒导入哺乳动物细胞中，并使用适当的转染试剂进行转染。
转染后，细胞将利用其自身的基因组表达干扰素基因，产生干扰素蛋白。
4. 提取纯化干扰素：采用细胞破碎和超声波等技术，将细胞内的干扰素进行提取。
接着，利用柱层析、凝胶过滤等方法对干扰素进行纯化，确保获得高纯度的目标蛋白。
5. 结构分析和活性检测：对制备的干扰素进行质谱分析、核磁共振等结构分析技术，确保合成的干扰素与天然干扰素的结构相似。
同时，需要进行活性检测，验证其在体外和体内的抗病毒、抗肿瘤等生物活性。
6. 毒性和稳定性评价：进行毒性和稳定性测试，确保制备的干扰素对人体没有不良影响，并且在不同条件下具有一定的稳定性。
7. 大规模生产：通过以上步骤初步制备的干扰素需要进行大规模发酵生产，确保满足医药市场对干扰素的大量需求。
通过上述基因工程制备流程，可以获得高效、高纯度的干扰素制剂，为医药健康事业做出重要贡献。
8. 注册和临床试验：在成功实现大规模生产后，制备的干扰素需要进行严格的注册和临床试验。
在注册过程中，需要提供充分的数据支持其安全性和有效性，以及符合各项规定标准。
对于基因工程制备的干扰素，还需要提供详细的制备工艺和质控措施，证明产品的稳定性和一致性。
在完成注册后，需要进行临床试验以验证干扰素在不同病症（如乙肝、乙型肝炎、多发性硬化症、癌症等）的疗效和安全性。
从技术创新到市场创新——中国首个基因工程创新药物重组人干扰素α1b
从技术创新到市场创新——中国首个基因工程创新药物重组人干扰素α1b技术创新是实现市场创新的关键驱动力，它能够推动产品的不断更新迭代，为市场需求不断变化的快速响应提供了可能。
作为现代医药研发领域的一项重要技术，基因工程技术的应用也在不断探索和扩展。
而重组人干扰素α1b（rhIFNα1b）作为中国首个基因工程创新药物，则充分展示了技术创新向市场创新的转化完美体现。
重组人干扰素α1b是一种由基因重组技术制造的新型干扰素药物，是目前世界上唯一由中国独立自主研发、生产和上市的重组干扰素制品。
这种药物可以在免疫系统中增强人体自身的抗病能力，对于治疗慢性乙型肝炎等病症有重要作用。
重组人干扰素α1b所使用的基因重组技术，也被认为是现代生物技术中最优秀的一种技术，比传统技术具有更高效、更精准、更安全的特点。
为了实现市场创新，重组人干扰素α1b面临着多方面的挑战。
首先，药物研发周期漫长、成本高昂，需要投入大量的政策、资金、人力等资源。
其次，临床试验结果需要得到公认的严格证明，包括疗效、安全性、首次批发价等多个方面。
最后，在产品推广阶段，需要承担融资压力、竞争压力、市场领导力等多种前所未有的挑战。
针对这些挑战，重组人干扰素α1b选择了一条独特的路线，以市场为导向，推进技术创新，实现市场创新。
这条路线采用的关键策略包括加强科技创新，保持研发领先优势，按照国际化标准加强诊疗指南制定，积极发挥市场推动作用，打造品牌形象。
同时，公司还采用了先期投入、后期收益的模式，鼓励客户使用重组人干扰素α1b，并在产品使用上予以支持，以便在市场上取得更大的份额。
在技术创新和市场创新的共同推动下，重组人干扰素α1b得以获得市场上的成功。
以国药控股为例，公司在产品推广上不断精细化、提高范围覆盖能力，为医疗、研究机构、医保等多个领域提供了全方位服务，凭借超过四十个国家的注册证和超过四百个专利的保护优势，重组人干扰素α1b在全球同类产品市场中举足轻重。
重组人干扰素
重组人干扰素简介重组人干扰素（recombinant human interferon）是一种由基因重组技术制备的人工合成干扰素。
干扰素是人体自然产生的一类蛋白质，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。
通过基因重组技术，人工合成的重组人干扰素可以在人体内发挥类似自然干扰素的生物学活性，被广泛应用于医学领域的疾病治疗和预防。
组成与结构重组人干扰素的组成与结构与自然干扰素类似，主要由蛋白质组成。
根据不同的干扰素类型，药物名称可能会有所不同，如重组人α干扰素（recombinant human interferon alpha），重组人β干扰素（recombinant human interferon beta）和重组人γ干扰素（recombinant human interferon gamma）等。
重组人干扰素通常采用大肠杆菌等常见微生物进行表达和生产，通过基因重组技术将干扰素基因导入到宿主细胞中，使宿主细胞表达并合成干扰素蛋白质。
制备过程中还可能采用亲和层析、离心、冻干等工艺，保证药物的纯度和稳定性。
作用机制重组人干扰素通过与人体细胞表面的干扰素受体结合，触发一系列信号转导途径，从而发挥其多种生物学活性。
主要的作用机制包括：1.抗病毒作用：重组人干扰素可以激活多种抗病毒机制，如抑制病毒复制、增强细胞免疫反应、诱导干扰素诱导基因和抗病毒蛋白的表达等，从而对多种病毒感染起到抑制和清除的作用。
2.抗肿瘤作用：重组人干扰素可以通过调节宿主免疫系统、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长和扩散等机制，对多种恶性肿瘤具有抑制和杀伤作用。
3.免疫调节作用：重组人干扰素可以调节宿主免疫系统的免疫应答，增强细胞免疫和体液免疫功能，对免疫相关性疾病具有治疗和预防作用。
临床应用重组人干扰素在临床应用中已被广泛用于多种疾病的治疗和预防。
以下是一些常见的临床应用：1.丙型肝炎：重组人干扰素可以用于慢性丙型肝炎的治疗，通过抑制病毒复制和增强宿主免疫力来达到治疗效果。
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根据来源、基因序列和氨基酸组成分类I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长免疫调节(较弱）其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
II 型干扰素：干扰素γ（IFN)来源：活化的T细胞和NK细胞产生功能：免疫调节➢提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力➢增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性➢抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答➢趋化作用➢抗病毒和抗肿瘤作用（次要）2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。
免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。
●对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc 受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。
●对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。
在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。
在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。
IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。
IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
●对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子，发挥抗原递呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。
二重组干扰素的临床应用●广谱抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。
●直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。
●免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）●多发性硬化症 rhuIFNβ对已知基因序列的干扰素 , 基因文库的调用可以用其序列 3' 端和5' 端部分事先用同位素标记过的序列作为探针 , 通过杂交的方法进行调用。
由于干扰素基因的种属特异性不是很大 ,| 可以用人的干扰素基因为同源探针 , 从鼠基因文库中调出相应的干扰素基因 , 其方法将在下文 1 中提到。
| 对于扰素基因的取用 , 不仅可以使用构建基因文库的方法 , 对已了解其氨基酸或核昔酸割成的干扰素也可以用化学合成的方法先合成其编码的 DNA 序列 , 再对其进行表达。
化学合 | 成方法包括固相合成法及液相合成法两大类。
与利用基因文库的方法相比 , 化学合成法比较 | 复杂 , 由于每加入一个核昔酸就会有一定比例的错误掺入、基因重叠、基因缺失等情况 , 并且在 l 整个合成过程中这种错误不断积累 , 因此该方法适合比较短的基因 , 而对长的基因则有目的产 | 物含量低、产物纯化困难的缺点。
但它也有优点 , 如可根据研究的需要对一些氨基酸进行定点 | 突变 , 或根据宿主菌的特性 , 在不改变其氨基酸组成的情况下使用宿主的偏爱密码子 , 以提高 | 产物的产量。
|对于不同亚型的干扰素 , 由于同源性较高 , 可以用相同的引物从诱导的小鼠细胞系中提取mRNA 混合物进行反转录和扩增 , 然后用亚型特异性探针对 CDNA 混合物进行 Southern 印迹 , 这样便可将序列上相差较小的同种、不同亚型的干扰素基因进行分离 , 为生产高纯度的单一干扰素提供了方法O三、表达方法随着对干扰素研究的深入 , 人们了解到鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的10~40 位、 78~107 位、 123~166 位的 A 、 B 、 C 区 , 尤其是位于 78 和 79 位的氨基酸对抗病毒 | 活性十分重要。
而人 IFNt1 的121~136 位对抗病毒活性作用较大 , 人 IFN 子的 N 端 10 个集 |基酸也是保持其活性所必需的。
对干扰素结构的了解为更好地构建基因表达奠定了基础。
干 | 扰素最初是用其外源序列进行表达的 , 但近年来的研究表明嵌合表达的干扰素往往优于单一干扰素 , 因此出现了较多的嵌合表达形式 , 并取得了较好的效果。
1.IFN- α的表达家蚕作为一种用于表达外源基因的宿主有易于养殖、生产周期短、夕阳基因表达量高的优点 , 同时由于家蚕为真核生物 , 能对表达产物自行进行糖基化修饰 , 产生有生物活性的蛋白 , 并且在产物提取的过程中只要将家蚕进行匀浆 , 再进行抽提即可 , 操作上十分方便 , 因此 , 它在基因工程领域内被广泛应用。
下面便以人IFN, α的生产为例介绍家蚕表达体系在干扰素生产中的应用。
用家蚕核型多角病毒 BIIINPV 体外感染的家蚕传代细胞株 BM-N 通过噬菌斑法纯化得到 BmNPV 的τ 3 亚型。
利用从感染脂肪体 mRNA 制得的 CDNA 为探针 , 对其多角蛋白序列进行检验 , 其中 10.5kb 的EcoR I 片段及 3.9 灿的 HindE 片段可与探针杂交 , 将 10.5 灿的EcoR I 片段克隆到 pBR322 中 , 产生质粒 pBmE360 对其用 HindE 切 , 得到 3.9kb 片段 , 其中 | 含有多角蛋白全部序列 ( 图 123 中为黑色框架 ), 将该片段插入 pUC9 的 HindE 位点 , 产生质 | 粒p9H18 。
将 p9H18 用 EcoR I 切后于 50U BAL31 外切核酸酶缓冲液中23 ℃水浴 10min, 更 | 掐锺油油菲如 n 入 07 倍他烈的。
气 mnlAd EDTA 终止反应。
将截短的 p9H18 片段用 Hind E i切 , 并通过琼脂糖凝胶电泳分离 2.7kb 的 Hind 皿平头末端片段 , 将其插入 pUC9 即p9B310的 Hind HI-Sma I 位点 O 另外 , 将 pBmE36 的 3.1 峙的 HindE 片段连接到 pUC8 上 , 得到质粒 p8H225, 用 EcoR I 及 Aat E 切 , 得含有多角蛋白基因下游 3.1kb 基因的 3.5kb 片段 , 将其连接到p9H18 的 4.7kb 的 EcoR IAat E 片段上 , 产生杂交质粒 p89B310,它在启动子下游含有多聚接头 (EcoR I 、 BamH ISma I 、 Sal I 、 Pst I 位点 ) 。
将从基因文库中用 183bp 探针调出的在 ATG 后含有 Sma I 位点 ( 即有序列 CCCGGGATG) 的IFNm α J 基因片段连接到 p89B310 上 , 便构建成质粒 pIFN2B310 。
将 pIFN2B310 与病毒基因组 DNA 便可共转染 BM- N 细胞系或家蚕幼体 , 其具体操作如下 : 向 2.5mL 含有 0.25molACaCl2 、10 μ g BmNPV DNA 及65 μ g pIFN2B310 的溶液中加含 0.28II1014NaCl 、 0.7mmoi/L Na2C03 、 0.7IIIII1014 Na2HP04 、 50mmol/L EfEPE (pH 7.1) 的缓冲液 , 进行沉淀。
取 0.45ml 沉淀加至 4.5mi 含3 × 106 个细胞的培养液中 ,12h 后换液一次 , 再培养 4d, 即可得到重组病毒 BmIFN2B310 。
用两个噬菌斑单位的病毒感染3 × 106 个 BM-N 细胞或用50 μ L3 × 105 个噬菌斑单位的病毒溶液注人家蚕幼体 , 培养 24h 后收集培养液便可得到干扰素。
2.IFN- 目的表达将人 IFN-R 基因 HimdE 片段插人载体 pSV2-dhfr中 SV40 晚期启动子 PL 下游的 Pvu E 位点。
用此重组质粒与带有黄瞟岭磷酸核糖转移酶 (XGPRT) 基因的质粒 pSU--gpt 共转染次黄瞟岭磷酸核糖转移酶 (HGPRT) 基因缺陷小鼠的骨髓瘤 (sp24) 细胞 O 经过霉盼酸及氨基喋岭培养基筛选 , 便可得到表达人 IFN-R 。
具体操作步骤如下 : 将含有人 IFN-p 基因的重组质粒 pBV-92 用 EcoR I 及 Hind E 酶切 , 分别作为探针模板及插入片段 , 同时用 PvuII 切载体 pSVZdhfr 质粒 , 使其线性化后将外源基因插入。
将次黄瞟岭磷酸核糖转移酶基因缺陷的 sp2/0细胞在含有 10% 小牛血清、 10% 青链霉素的 DLfEM 培养基中传 3~4 代后在小空斑瓶中培养 24h, 成半悬浮状 ,400r/ 勺 1in 离心 5min 将细胞沉积加入新鲜培养基 , 再培养 2~4h 。
转染液中含目的基因pSVHIF 和标记基因 pSVZgpt( 比值为 10:1), 其中 DNA 浓度为20 μ g/IIIlo 在 2IIIol/L CaCl263 阵、 10mmolATris-HCl (pH 7.1)428 μ L 中缓缓加入2 × HeBs 液 (EEPES50mmol 只 L 、 NaCl280mmolA 、Na2HP040.75mmolA 、 0.75IIlII1014 Na2HP04,pH 7.1) 约500 μ L, 加入 sp2/0 细胞培养物中 , 轻轻摇匀37 ℃孵育 8h 。
再更换为含有黄瞟岭250 μ g/mL 、次黄瞟岭15 μ g/mL 、胸昔10 μ g/mL 、氨基蝶岭。
-2 μ g/mL 、霉盼酸 25 问 /mL 的 DhEM 培养基,37 ℃ cq 孵箱中选择性培养。
一周后更换为含250 μ g/mL 黄瞟岭的 D; 旧M 培养基 , 继续培养 2 周以上 , 检查 IFN-P 活性。
3.IFN- γ的表达以鼠干扰素 MuIFN- γ为例 ( 图 12-3) 。
用含人IFN- γ编码区基因的探针与噬菌体γ MG9 构建的鼠 M600 基因组 DNA 文库在 20% 甲酷胶中进行低严格性的杂交 , 膜用 0.3molANaCl 、0.03II1014 拧棱酸纳及 0.1%NaEbS04 在室温洗涤两次。
将结合的噬菌体用噬菌斑法纯化 , 提取 DNA 后 , 用多种限制性内切酶切 , 以1% 葡聚糖凝胶电泳纯化后与人 CDNA 探针杂交 , 将γ MG9 中与探针可以杂交的 10.5kb 的 BamH I 片段亚克隆到 pBR322 的 BaIIIH I 位点 , 产生质粒 pMG10.5 。