重组人干扰素生产工艺
重组人干扰素
重组人干扰素简介重组人干扰素（recombinant human interferon）是一种由基因重组技术制备的人工合成干扰素。
干扰素是人体自然产生的一类蛋白质，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。
通过基因重组技术，人工合成的重组人干扰素可以在人体内发挥类似自然干扰素的生物学活性，被广泛应用于医学领域的疾病治疗和预防。
组成与结构重组人干扰素的组成与结构与自然干扰素类似，主要由蛋白质组成。
根据不同的干扰素类型，药物名称可能会有所不同，如重组人α干扰素（recombinant human interferon alpha），重组人β干扰素（recombinant human interferon beta）和重组人γ干扰素（recombinant human interferon gamma）等。
重组人干扰素通常采用大肠杆菌等常见微生物进行表达和生产，通过基因重组技术将干扰素基因导入到宿主细胞中，使宿主细胞表达并合成干扰素蛋白质。
制备过程中还可能采用亲和层析、离心、冻干等工艺，保证药物的纯度和稳定性。
作用机制重组人干扰素通过与人体细胞表面的干扰素受体结合，触发一系列信号转导途径，从而发挥其多种生物学活性。
主要的作用机制包括：1.抗病毒作用：重组人干扰素可以激活多种抗病毒机制，如抑制病毒复制、增强细胞免疫反应、诱导干扰素诱导基因和抗病毒蛋白的表达等，从而对多种病毒感染起到抑制和清除的作用。
2.抗肿瘤作用：重组人干扰素可以通过调节宿主免疫系统、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长和扩散等机制，对多种恶性肿瘤具有抑制和杀伤作用。
3.免疫调节作用：重组人干扰素可以调节宿主免疫系统的免疫应答，增强细胞免疫和体液免疫功能，对免疫相关性疾病具有治疗和预防作用。
临床应用重组人干扰素在临床应用中已被广泛用于多种疾病的治疗和预防。
以下是一些常见的临床应用：1.丙型肝炎：重组人干扰素可以用于慢性丙型肝炎的治疗，通过抑制病毒复制和增强宿主免疫力来达到治疗效果。
干扰素的工艺制备流程
蛋白质含量测定
原理：利用蛋白质与特定试剂反应，生成有色物质，通过比色法测定蛋白质含量
试剂：考马斯亮蓝、溴酚蓝、福林酚试剂等
步骤：样品处理、试剂添加、反应时间、比色测定、结果计算 注意事项：样品处理要充分，试剂添加要准确，反应时间要控制好，比色测定要准确，结果计 算要正确。
基因序列分析
目的：检测干扰素 的基因序列
化学合成法
原料：氨基酸、核苷酸等
反应条件：温度、pH值、反应时间 等
合成步骤：氨基酸合成、核苷酸合成、 蛋白质合成等
产物纯化：色谱法、电泳法等 质量控制：检测纯度、活性等 包装与储存：无菌包装、低温储存等
干扰素质量检测
生物学活性检测
检测方法：采用细胞培养法或酶联免疫吸附法 检测指标：干扰素的生物学活性、纯度、稳定性等 检测步骤：样品制备、细胞培养、酶联免疫吸附、结果分析等 检测结果：根据检测结果判断干扰素的生物学活性是否达标
干扰素工艺制备流程
汇报人：
干扰素制备原料 干扰素制备工艺流程 干扰素质量检测 干扰素生产成本控制 干扰素工艺制备技术的发展趋势
干扰素制备原料
重组人干扰素
原料：人源细胞
制备方法：基因 工程
作用：抗病毒、 抗肿瘤
应用：临床治疗、 疫苗开发
病毒干扰素
病毒来源：自然界 中的病毒
病毒种类：包括流 感病毒、乙肝病毒 等
病毒提取：通过生 物技术从病毒中提 取干扰素
干扰素纯化：通过 生物技术对提取的 干扰素进行纯化处 理
干扰素制备工艺流程
基因工程法
基因工程法简介： 通过基因工程技术， 将干扰素基因导入 到微生物中，使其 表达出干扰素蛋白
基因工程法的优点： 可以大规模生产， 成本低，效率高
干扰素生产工艺
（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR
（3）具有生产干扰素精能选ppt 力：
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2.3 菌种库的建立与保藏
• QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 • 菌种检查合格后，方可投产。
精选ppt
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3 .干扰素α-2b的发酵工艺过程
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3.1摇瓶培养
取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶培养：30℃，pH7.0，250 r/min，
对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，增强其 吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCⅡ类分 子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子， 发挥抗原递呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化 为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。
1992年我国第一个基因工程药物IFN-α1b获 得国家一类新药证书。
研发中的重组干扰素：IFN ω，临床阶段
精选ppt
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1.2干扰素的理化性质
精选ppt
143-166aa； MW:18-40 ku； pI: 6.5-7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附玻璃、淀粉、醋酸 纤维膜、琼脂和塑料等介质。
➢ 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力
➢ 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性
➢ 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答
➢ 趋化作用
➢ 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）
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2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素
上市重组干扰素: α2a、α2b、α1b、 β1b，γ
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。
干扰素的工艺制备流程
取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人
每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存
活，说明成品合格。
4 国内基因工程药物产业发展状况
我国的生物技术药物却一直苦于缺乏 自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿 制药，创新药物的开发一直未能打开局面。
一种新药从研发到投放市场，投入大 约为30亿~60亿美元。
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→
→
受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
→
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与扩增
❖ 1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA ❖ 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
存在的问题：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞 争， 严重影响产业的健康发展。
（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。 （3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。 （4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮 乏。
后面附件PPT常用图标，方便大家提高工作效率
140 BUSINESS & FINANCE ICONS
源性DNA应低于100pg。
❖ （7）残余血清IgG含量测定
❖
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
❖ （8）残余抗生素活性测定
❖
半成品中不应有抗生素活性存在。
❖ （9）紫外光谱扫描
❖
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。
注射用重组人干扰素a-2b工艺规程
技术标准文件1．产品概述1.1 产品名称：商品名：隆化诺通用名：注射用重组干扰素α-2b英文名：Recombinant Human Interferon α-2b for Injection。
汉语拼音：Zhusheyong Chongzurenganraosu α-2b。
产品代码:1.3类别：生物药1.4剂型：冻干粉针剂1.5规格：⑴100万单位；⑵300万单位；〔3〕500万单位1.6批量：60000 瓶1.7性状：本品为白色薄壳状疏松体，参加标示量注射用水后应迅速复溶为澄明液体。
1.8作用与用途：治疗慢性乙型肝炎、肿瘤及其它病毒性疾病。
1.9包装规格：100万单位×10瓶×40盒/箱， 300万单位×10瓶×40盒/箱，500万单位×10瓶×40盒/箱1.10贮藏：2～8℃避光保存。
1有效期：2年6个月2批准文号：300万单位国药准字S1*******；500万单位国药准字S2*******；3考前须知：1. 本品冻干制剂为白色疏松体，溶解后为无色透明液体，如遇有浑浊、沉淀等异常现象，那么不得使用。
包装瓶有损坏、过期失效不能使用。
1.13.2. 以注射用水溶解时应沿瓶壁注入，以免产生气泡，溶解后宜于当日用完，不得放置保存。
1.14禁忌：1.14.1. 对重组人干扰素α-2b或该制剂的任何成分有过敏史。
1.14.2. 患有严重心脏疾病。
1.14.3. 严重的肝、肾或骨髓功能不正常者。
1.14.4. 癫痫及中枢神经系统功能损伤者。
1.14.5. 有其他严重疾病不能耐受本品者，不宜使用。
2．处方及处方依据：规格：100万单位/瓶；批量：60000 瓶规格： 300万单位/瓶；批量：60000 瓶规格： 500万单位/瓶；批量：60000 瓶2.2处方依据：规格： 100万IU /瓶国药准字S1*******；规格： 300万IU /瓶国药准字S1*******规格： 500万IU /瓶国药准字S2******* 2.3生产批件:药品GMP证书及生产批件复印件：见附录3．工艺3.2 生产过程及技术参数配料仓库配料人员应认真对照生产领料单〔附件1〕核对原料“合格证〞上的代号、名称、规格、有效期，按生产领料单上物料品名及数量仔细称量，在生产核料单〔附件2〕和配料标签上注明物料的物料编码、名称、批号、重量，由QA中控人员监督复核生产核料单、重量、配料标签与封签，内容无误后，由配料人和复核人共同在生产领料单和核料单签字。
干扰素的工艺制备流程
干扰素的工艺制备流程干扰素是一种细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种功能。
干扰素的制备是通过基因工程技术来实现的，下面将介绍干扰素的工艺制备流程。
1. 基因克隆在干扰素的工艺制备中，首先需要进行基因克隆。
这一步是将目标基因与表达载体连接起来，形成重组 DNA 分子。
常用的表达载体包括质粒和病毒载体。
基因克隆的具体步骤如下：1.1 选择目标基因：根据所需要制备的干扰素类型，选择相应的目标基因序列。
1.2 购买引物：根据目标基因设计引物，并购买合成。
1.3 PCR 扩增：使用引物进行 PCR 扩增，得到目标基因的 PCR 产物。
1.4 酶切与连接：将目标基因的 PCR 产物切割与载体进行连接，形成重组 DNA 分子。
常用的酶切酶有 EcoRI、BamHI、XhoI 等。
1.5 转化：将重组 DNA 转化至宿主菌中，如大肠杆菌，以便后续大规模培养。
2. 克隆表达在克隆表达阶段，需要将重组 DNA 导入到宿主细胞中，并使其表达干扰素。
克隆表达的具体步骤如下：2.1 酵母菌检测: 通过将宿主细胞转化至酵母菌中，进行孢子碟试验来筛选高表达的菌株。
2.2 培养: 选取高表达的菌株进行大规模培养，提供充足的菌体用于干扰素的表达。
2.3 诱导表达: 通过添加合适的诱导剂，如等温诱导或化学诱导，使菌体产生干扰素。
2.4 培养时间控制: 根据不同的干扰素类型，确定合适的培养时间。
2.5 菌体破碎: 将培养得到的菌体进行破碎，以释放干扰素。
2.6 干扰素纯化: 利用分离纯化技术，如柱层析、高效液相层析等，对菌体提取液进行纯化，得到纯净的干扰素。
3. 干扰素的活性检测制备干扰素后，需要对其进行活性检测，以确保其具有预期的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能。
干扰素活性检测的方法有多种，包括：3.1 细胞抑制实验：通过对目标细胞进行处理，并观察细胞生长情况，来判断干扰素抑制细胞生长的能力。
3.2 抗病毒实验：通过对目标病毒感染细胞进行处理，并观察细胞感染情况，来判断干扰素抗病毒能力。
第十五章重组干扰素生产工艺
5、pH 值
菌体生长：pH 6.8 产物积累：pH 6.0 策略：两段培养
发酵工艺过程
干扰素生产工艺
6、泡沫控制
发酵工艺过程
机械除泡和消泡剂共同使用
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
离心：
➢ 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min
➢ 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质
➢ 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌，焚烧处理。
干扰素生产工艺
3、初级分离
分离纯化工艺
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃。
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
15.4.1 干扰素分离工艺过程 15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
蛋白质分离纯化的目标是增加制品的纯度或比活性， 即增加单位蛋白质的含量或生物活性。设法除去变 性的和杂蛋白，并且希望所得到蛋白质的产量和纯 度最高值。
干扰素生产工艺
干扰素概述
15.2. 3 干扰素的生产工艺路线
路线1
体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞
血浆
人白细胞
分离纯化
人白干扰素
病毒诱导
1989年：IFNα-n3，批准上市 产量低：1g IFNα，需要3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性
干扰素生产工艺
2、预处理
分离纯化工艺
第7章重组人干扰素生产工艺
病毒诱导
1989年，IFNα-n3/Alferon，批准上市 缺点：产量低，1g IFNα/3x105 L人血
白细胞来源困难，工艺复杂，收率低， 价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可 能性（特别是逆转录病毒）。
2.人源转化细胞系培养生产工艺
Namalva 细胞培养
合成干扰素
分离纯化
病毒诱导
免疫缺陷症患者，产生免疫相关细胞的抗体，造 成免疫系统的自我攻击。干扰素抑制T淋巴细胞 抗体的产生，恢复细胞免疫功能。
7.1.3 重组干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性（rhuIFNα）
慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎…
直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）
毛细胞和慢性髓样白血病、Kapos肉瘤、非霍金淋巴瘤…
长期、高剂量使用时可出现骨髓抑制、消化道 反应、神经系统和心血管系统症状等，同时出现 干扰素抗体。
7.1.5 中国干扰素市场
我国是世界乙型肝炎高发国，目前有800万～ 1000万名乙肝病人。这些病人却很少选用干扰素作 为治疗药物，主要原因就是干扰素过高的价格。
目前国内重组人干扰素的市场呈现国产药品和 进口药品并存的格局。进口重组人干扰素为长效干 扰素，价格偏高，单价均在1000元左右。国产重组 人工干扰素为普通干扰素，最高剂量的单价只在 100元左右。
因产生蛋白质因子发挥作用，因此不同细胞对干 扰素的敏感不同；
（3）病毒大量复制时引发细胞炎症应答，此时干 扰素易产生作用；
（4）当病毒DNA已整合到宿主细胞的染色体中时， 干扰素不能发挥其抗病毒活性。
2、干扰素抗肿瘤作用机制
肿瘤细胞：无限繁殖能力；转化能力；滋 润能力。
干扰素抗肿瘤作用机制：
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基因工程干扰素a与天然干扰素a的序列区别？
重组人干扰素生产工艺
概述
2、重组干扰素的临床应用
• 广谱抗病毒活性（rhuIFNα及其PEG化，α2a, α2b, alfacon-1, α1b, ）
✓ 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎…
• 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα及其PEG化） ✓ 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金
IFNa1b MCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHE 60
Alfacon-1
QTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHE
IFNa2a MIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILA 119 IFNa2b MIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILA 119 IFNa1b LIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQPNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILA 120 Alfacon-1 MIQQTFNLFSTKNSSAAWNESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVTETPLMNVDSILA
rhuIFNα 、Alfacon-1、rhuIFNβ 、rhuIFNγ
重组人干扰素生产工艺
概述
上市重组人干扰素a的氨基酸序列
IFNa2a MCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEF-GNQFQKAETIPVLHE 59
IFNa2b MCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEF-GNQFQKAETIPVLHE 59
165-166个氨基酸组成，对乙醚、氯仿敏感； 容易吸附在介质上。
重组人干扰素生产工艺
概述
天然人干扰素基因
基因组测序表明，至少存 在17 基因和 13 假基因
重组人干扰素生产工艺
概述
2、重组人干扰素的种类
全球约有十几个国家批准基因工程重组人干扰 素(Recombinant human interferon, rhuIFN) 上市。
IFNa2a VRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE 166 IFNa2b VRKYFERITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE 166 IFNa1b VKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIVRSLSLSTNLQERLRRKE 167 Alfacon-1 VKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKE
重组人干扰素生产工艺
概述
1、天然干扰素的种类
• 具有种属特异性 人源干扰素-人干扰素,牛源干扰素-牛干扰素,…
• 天然人干扰素分类-抗原特异性 ✓ I型干扰素：IFNα、IFNβ[糖基化蛋白]、IFN 、
IFN 、IFN ✓ II型干扰素：IFNγ[糖基化蛋白] ✓ III型干扰素：IFN-λ1，IFN-λ2， IFN-λ3 • 氨基酸序列差异分不同亚型：IFNα2a、α2b、α1b
重组人干扰素生产工艺
概述
1、干扰素(interferon，IFN）的种类
• 概念：机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一 组结构类似、功能接近的细胞因子。
• 细胞因子:由机体细胞合成分泌的能调节生理功能、 参与免疫应答和介导炎症反应等小分子可溶性蛋 白[与免疫球蛋白区别]。
• 发现:1957年英国国立医学研究所科学家Isaacs A 和Lindenmann J,研究病毒干扰现象时，发现一种 抑制病毒繁殖的物质。
概述
人干扰素IFN α的结构与理化性质
CDLPQTHSLGSRRTLMLLA QMRKISLFSCLKDRHDFGF PQEEFGNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDSSAAW DETLLDKFYTELYQQLNDL EACVIQGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYLKEK KYSPCAWEVVRAEIMRSFS LSTNLQESLRSKE
重组人干扰素生产工艺
概述
主要天然人干扰素
种类 亚型 α 稳定性
产生条件
白细胞 类淋巴 细胞
成纤维 细胞
pH2 稳定， 病毒等诱导 56℃ 稳定
pH2 稳定， 病毒等诱导 56℃ 不稳定
T淋巴细 pH2不稳定 有丝分裂原
胞
56℃不稳定 和抗原诱导
重组人干扰素生产工艺
重组人干扰素生产工艺
概述
3、人干扰素生产工艺路线（2）
• 人源转化细胞系培养生产工艺：
Namalwa培养
合成干扰素
分离纯化
病毒诱导
多亚型混合干扰素
•类淋巴母细胞，非整倍体 •1999年：IFNα-n1/Wellferon, 批准用于临床。 • 优点：首次用细胞培养8000L,实现大规模商业化生产。 • 缺点： 活性低，退出临床应用。
重组人干扰素生产工艺
概述
制药工艺学
Pharmaceutical Technology
重组人干扰素生产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
重组人干扰素生产工艺
概述
第一节 干扰素概述
• 干扰素的种类 • 干扰素的临床应用 • 干扰素的生产工艺路线
淋巴瘤… • 免疫调节活性（rhuIFNγ）——慢性肉芽肿瘤… • 多发性硬化症——rhuIFNβ
重组人干扰素生产工艺
概述
3、人干扰素生产工艺路线（1）
•体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞
血浆
人白细胞
分离纯化
人白干扰素
病毒诱导
• 1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市 • 缺点：产量低,1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性，限制了临床应用