柱前荧光衍生2高效液相色谱法测定尿和血清中的环境雌激素
固相萃取-高效液相色谱法测定芹菜茎叶中的环境雌激素
／ ／ ｏ１ ｇ Ｌ Ｔｈ ｏ ｒｌｔ ｎ ｃｅｆ ｉ ｔ ｓｈｇ ｅ ｈ ｎ０ ９ ９５ Ｔ ｅｄ ｔｃｉｎ ｌ ｔ ｗｅｅｆ ｍ ． ， Ｌ ｔ ０＃ ／ ． ， ｃ ｒｅａｉ ｏ ｆ ｃｅ ｉｈ ｒｔａ ． ９ ． ｈ ｅｅ ｔ ｉ ｓ ｒ ｒ ３ ７ ｇ ｅ ｏ ｉ ｎ ｗａ ｏ ｍｉ ｏ ＃ ／ ｏ６ ３ ｇ Ｌ Ｔ ｅｒｃ ｖ ｒ ｓｗｅｅｆｏ ８ ． ０ ｔ ７ １ 。 ｌｏ ｈ ｅ ｔ ｅｓａ ｄ ｒ ｅ ｉｔ ｎ ｇ Ｌ ｔ ． ＃ ／ ． ｈ ｅ ｏ ｅｉ ｒ ｒｍ ９ ６ ｏ９ ． ３ Ａｌ ｆｔ ｅｒｌ ｉ ｔｎ ａｄ ｄ ｖａｉ ｓ ｅ ａｖ ｏ
ｗ ｅ ｅ ｄ ｔ ｃ ｅ ｙ ｔ ｅ ｈ ｇ ｌ ｅ ｆ ｒ ａ ｃ ｉ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍ ａ ｏ ｒ ｐ ｙ ａ ｔ ｒ ｐ ｅ ｃ ｌ ｍ ｌ ｏ ｅ ｅ ｔ ｄ ｒｖ ｔ ａ ｉ ｎ ｒ ｅ ｅ ｔ ｄ ｂ ｈ ｉ ｈ ｙ ｐ ｒ ｏ ｍ ｎ ｅ ｌ ｉ ｈ ｏ ｔ ｇ ａ ｈ ｆ ｅ ｒ － ｏ ｕ ｆｕ ｒ ｓ ｎ ｉｉ ａ ｉ ｔｏ ｑ ｚ ｗｉｈ ｐ ｎ ｔ ｏ ｅ ｚ ｙ ｈ ｏ ｉ ｅ ｔ － ｉ ｂ ｎ ｏ ｌ ｃ ｌ ｒｄ ．Ｔｈ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ｔ ｅ ｌ ｅ ｒ ｒ ｎ ｅ ｏ ｅ ｅ ｍ ｉ ａ ｉ ｎ ｗｅ ｅ ｆｏ ６ ３ ｒ ｅ ｒ ｓ ｌｓ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｈ ｉ ａ ａ ｇ ｆ ｄ ｔ ｒ ｎ ｔ ｒ ｒ ｍ ｎ ｏ
ｔ ｌ ｓ ｒ ｇ ｎ ｎ ｃ ｌ ｒ ． ａ ｔ ｏ ｅ ｓ ｉ ｅ ｅ ｙ ｅ Ｋｅ ｒ ｓ ｃ ｌ ｒ ； ｏ ｉ ｈ ｓ ｘ ｒ ｃ ｉ ｎ； ｒ — ｏ ｕ ｆ ｏ ｅ ｅ ｔ ｄ ｒｖ ｔｚ ｔ ｎ； ｉ ｈ ｐ ｒ ｏ ｍａ ｃ ｉ ｕ ｄ ｙ ｗｏ ｄ ： ｅ ｅ ｙ ｓ ｌ ｐ ａ ｅ ｅ ｔａ ｔ ｄ ｏ ｐ ｅ ｃ ｌ ｍ ｌ ｒ ｓ ｎ ｉｉ ａ ｉａ ｉ ｕ ｏ ｈｇ ｅ ｆ ｒ ｎ ｅ ｌ ｉ ｑ
柱前衍生化高效液相色谱法测定乳酸的光学纯度
柱前衍生化高效液相色谱法测定乳酸的光学纯度
1. 前言：柱前衍生化高效液相色谱法是一种用于测定有机化合物光学纯度的分析方法，通常结合手性色谱柱使用，能够对不对称分子进行高效、准确的分离。
2. 实验原理：该方法采用柱前衍生化反应，将测试物转化为对映异构体的对应衍生体，在手性色谱柱上进行分离，最终通过高效液相色谱分析获得测试物的光学纯度。
3. 实验步骤：
（1）样品制备：将测试物加入反应溶剂中，加入反应试剂进行柱前衍生化反应。
（2）检测系统设置：使用手性色谱柱进行分离，常用的手性色谱柱包括Chiralpak AD、Chiralcel OD等。
检测设备为高效液相色谱仪，通常需要进行优化和校准。
（3）操作流程：样品注入手性色谱柱后，固定相将对映异构体分离，流经检测器进行检测，通过峰面积比值计算样品的光学纯度。
4. 实验注意事项：
（1）反应条件要严格控制，如反应试剂用量、反应时间等均需要优化。
（2）手性色谱柱的选择需根据分析物的分子结构进行选择。
（3）实验过程中应尽量避免杂质的干扰，以保证准确性和可靠性。
5. 结论：柱前衍生化高效液相色谱法是一种有效的测定有机化合物光学纯度的方法，能够实现高效、准确的分离和检测，在化学合成和制药行业等领域得到广泛应用。
高效液相色谱法同时测定动物饲料中的4种雌激素
高效液相色谱法同时测定动物饲料中的4种雌激素摘要：采用反相高效液相色谱法同时测定动物饲料中的4种雌激素（雌酮、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚）。
检测条件为色谱柱Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇-水（60∶40，V/V），流速1 mL/min，检测波长279 nm，柱温25 ℃。
结果表明，4种雌激素成分在0.02～200 μg/mL浓度范围内与其对应峰面积呈良好线性关系。
样品平均加标回收率为92.4%～109.3%，RSD为2.4%～3.4%，饲料中4种雌激素的检出限为0.010～0.030 mg/kg。
该法操作简便、灵敏度高，可同时检测动物饲料中4种雌激素含量。
关键词：高效液相色谱法；雌激素；动物饲料Determination of Four Estrogens in Animal Feeds by HPLCAbstract：The simultaneous determination method of four estrogen （estrone，estriol，ethiny，diethylstilbestrol）in animal feeds were established by RP-HPLC with Kromasil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）column at 25 ℃. The mobile phase consisted of methanol-water （60∶40，V/V）. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 279 nm. The results revealed that there were good linear responses in the range of 0.02～200 μg/mL of 4 estrogens，and LODs were 0.010～0.030 mg/kg. The average recoveries were 92.4%～109.3% with RSD of 2.4%～3.4%. Consequently，the method was simple，sensitive for quality control of these estrogens in animal feeds.Key words：HPLC；estrogen；animal feeds饲料安全是动物性食品安全的重要环节，近年来，由饲料安全问题引发的食品安全事件时有发生。
柱前衍生高效液相色谱法测定二乙醇胺脱氢产物r亚氨基二乙酸和甘氨酸
柱前衍生高效液相色谱法测定二乙醇胺脱氢产物r亚氨基二乙酸和甘氨酸张蕾;段正康;朱宏文;尹科【摘要】An analytical method was developed for the determination of iminodiacetic acid ( IDA) and glycine ( Gly) , the dehydrogenation products of diethanolamine, by high performance liquid chromatography ( HPLC ) coupled with pre-column derivatization using p-toluenesulfonyl chloride ( PTSC) as the derivatization reagent. IDA and Gly reacted with PTSC in the alkaline environment ( pH 11) under 45℃ for 15 min. Then the derivatization products were analyzed by HPLC-MS. The separation was carried out on a high performance liquid chromatograph equipped with an ultraviolet detector. A VP-ODS column ( 200 mm × 4. 6 mm, 5 μm ) was employed using 0. 03 mol/L ammonium acetate (pH 5. 5)-acetonitrile (87:13, v/v) as mobile phases for isocratic elution at a flow rate of 1mL/min and detection wavelength of 235 nm. The results showed good linearities for iminodiacetic acid of 900-2100 mg/L, and for glycine of 20-100 mg/L, respectively. The linear correlation coefficients ( R2 ) were both greater than 0. 999. The limits of detection ( LODs) of IDA and Gly were 0. 0897 mg/L and 0. 0262 mg/L and the recoveries were in the range of 98. 7%-99. 3% and 98. 0%-99. 5%, respectively. The relative standard deviations ( RSDs) of IDA and Gly were in the range of 0. 89%-1. 23% and 0. 95%-1. 11% ( n=3) . The method has the characteristics of mild reaction conditions and high accuracy,and is well suitable for the determination ofIDA and Gly in industrial production.%以对甲苯磺酰氯(PTSC)为衍生剂,建立了柱前衍生高效液相色谱(HPLC)测定二乙醇胺脱氢产物中亚氨基二乙酸(IDA)和甘氨酸(Gly)含量的分析方法.IDA和Gly与衍生剂在碱性(pH 11)条件下于45℃反应15 min,进行柱前衍生,并利用高效液相色谱-质谱对衍生产物进行定性分析.衍生化产物采用VP-ODS色谱柱(200 mm×4.6 mm,5μm)分离,以0.03 mol/L醋酸铵溶液(pH 5.5)为流动相A、乙腈为流动相B(体积比为87:13),进行等度洗脱,流速为1 mL/min,并采用配有紫外检测器的高效液相色谱仪测定,检测波长为235 nm.该法在IDA质量浓度为900~2100 mg/L、Gly质量浓度为20~100 mg/L的范围内线性关系良好,相关系数(R2)均大于0.999.IDA和Gly的检出限(LOD)分别为0.0897 mg/L和0.0262 mg/L,加标回收率分别为98.7%~99.3%和98.0%~99.5%,相对标准偏差(RSD)分别为0.89%~1.23%和0.95%~1.11%(n=3).该法具有反应条件温和、准确性高的特点,可用于工艺生产中IDA和Gly含量的测定.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2017(035)011【总页数】6页(P1165-1170)【关键词】高效液相色谱;柱前衍生;亚氨基二乙酸;甘氨酸;对甲苯磺酰氯【作者】张蕾;段正康;朱宏文;尹科【作者单位】湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105【正文语种】中文【中图分类】O658亚氨基二乙酸(IDA)和甘氨酸(Gly)是重要的化工中间体,广泛用于农药、化工、医药等领域。
HPLC实验报告
水体中雌激素的高效液相色谱法分析李甜甜指导老师：凌婉婷1 前言目前, 环境内分泌干扰物( endocrine disrupting chemicals, EDCs) 被列为继臭氧层空洞和地球变暖之后的又一新的环境污染问题, 成为当前国际上研究的热点。
至今所报道的各种内分泌干扰物中, 雌性天然激素及其合成激素被认为是最重要的干扰物之一。
这些外源性化学物进入体内后通过和内源性雌激素相同的作用机制( 主要是核受体蛋白介导作用) 干扰内分泌系统而产生一系列的不良作用, 包括致癌、损伤生殖功能导致神经系统和免疫系统异常等。
环境中的雌激素主要是由人类和动物的新陈代谢而产生的，随着尿和粪便等排泄物而进入废水中，经过污水处理厂处理后进入到自然水体中，并在城市水系统中的固液相之间进行迁移和转化。
再者，由于激素类药物在人类日常生活和养殖业中被大量使用，不同种类的雌激素因此会进入城市污水管网，经污水处理厂处理后，排放进入环境。
EDCs 是城市水循环过程中长期存在的一类典型污染物，虽然其含量较低，但是在极低的浓度( ng·L-1)水平下就能造成动物内分泌紊乱、雌性化、发育不良以及畸形化等不良影响，而且有可能和水体中残留的其他雌激素类物质发生协同作用, 因此这类物质对生态环境潜在的危害性是不可忽视的。
同时由于EDCs的亲脂和难降解特性，在城市水循环的过程中会逐渐积累，威胁到城市居民的身体健康，对生态环境存在潜在的危害性，已经成为城市环境保护的核心问题，急需针对城市水体中的EDCs开展基础研究工作。
因此在环境中建立一套科学、完善、高效的雌激素类物质检测方法是十分必要的。
近年来，随着色谱、质谱及色谱-质谱联用技术等的快速发展，微量雌激素类污染物的检测技术也随之有较快的发展。
目前测定EDCs的方法有GC- MS 法、HPLC法, 荧光光度法 , 酶联免疫分析法(ELISA), 极谱法等。
其中GC - MS 和HPLC是比较常用的方法。
“环境雌激素”资料汇编
“环境雌激素”资料汇编目录一、固相萃取衍生化气相色谱质谱法测定制药厂污水中的环境雌激素二、基于碳纳米管的固相萃取分散液液微萃取测定水中多种痕量环境雌激素三、高通量筛选环境雌激素类化合物的方法学研究四、环境雌激素双酚A对小鼠生殖和内分泌系统的毒性研究五、水中典型环境雌激素共存对内分泌系统的影响及机制研究六、柱前荧光衍生高效液相色谱法测定尿和血清中的环境雌激素固相萃取衍生化气相色谱质谱法测定制药厂污水中的环境雌激素环境雌激素是近年来备受关注的一类污染物，其在自然界中的存在和影响日益受到人们的重视。
制药厂的污水作为一种潜在的环境雌激素来源，其检测和分析显得尤为重要。
本文将介绍一种采用固相萃取衍生化气相色谱质谱法测定制药厂污水中的环境雌激素的方法。
样品采集与预处理：在制药厂的污水排放口处采集水样，用玻璃纤维滤膜过滤以去除悬浮物，然后将其储存在棕色玻璃瓶中。
固相萃取：将预处理后的水样通过固相萃取柱，去除水样中的有机物和其他杂质。
衍生化：将固相萃取后的样品进行衍生化处理，以提高其挥发性，便于后续的气相色谱分析。
气相色谱质谱分析：将衍生化后的样品进行气相色谱质谱分析，通过对比标准品和已知环境雌激素的质谱图，确定样品中的环境雌激素。
方法的检出限和线性范围：通过实验测定，该方法对环境雌激素的检出限较低，线性范围较广，适用于各种浓度的环境雌激素检测。
实际样品检测：采用该方法对制药厂污水进行实际检测，成功检测出多种环境雌激素，包括但不限于：邻苯二甲酸酯、双酚A等。
方法的优缺点：该方法具有较高的灵敏度和特异性，但操作过程相对复杂，需要专业人员操作。
本文介绍的固相萃取衍生化气相色谱质谱法能够有效地测定制药厂污水中的环境雌激素，为制药厂的污水处理提供了有效的检测手段。
然而，该方法操作过程较为复杂，需要进一步优化和改进。
未来研究可以探讨其他更简便、高效的方法，以便更好地服务于环境保护工作。
随着环境保护意识的提高，对制药厂污水中的环境雌激素检测需求将不断增加。
柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法测定血浆中同型半胱氨酸
柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法测定血浆中同型半胱氨酸唐秀芳;甄乾娜;樊子勉;冯成亚;丁敏【摘要】A precolumn derivatization-high performance liquid chromatographic method for the determination of homocysteine (Hey) in plasma was established. Tris (2-carboxyethyl) phos-phine hydrochloride (TCEP) and N-( 1-pyrenyl) maleimide (NPM) were used as the reduced reagent and derivatization reagent, respectively. The separation was carried out on an Agilent Hypersil C-18 column (250 mm x4. 0 mm, 5μm) in gradient elution mode. The mobile phase consisted of A (15 mmoI/L sodium acetate solution), B (acetonitrile) and C (300 mL water containing 1 mL acetic acid and 1 mL phosphoric acid). The eluate was monitored by the fluorescence detector at an excitation wavelength of 330 nm and an emission wavelength of 380 nm. The mean recovery of Hey was (102.08±4.94)%. The linear range was from 0.500 μmol/L to 100μmol/L, with a detection limit of 0. 016μmol/L. The intra-day and inter-day relative standard deviations (RSDs) for Hey were less than 5%. Seven plasma samples of patients with hypertension and seven plasma samples of healthy controls were tested, and the results demonstrated that the Hey in the plasma from the hypertension group was significantly different from that of the control group (p < 0. 05). The developed method is simple, fast, accurate, and suitable for clinical measurement.%建立了一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法用于测定血浆中同型半胱氨酸(Hcy).使用三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)为还原剂,N-(1-芘)马来酰亚胺(NPM)为衍生剂进行样品预处理,AgilentHypersil C-18柱(250mm ×4.0 mm,5μm)进行分离,流动相为15 mmol/L醋酸钠-乙腈-混合酸(300 mL水中含1mL醋酸和1mL磷酸)混合溶液,采用梯度洗脱,荧光检测激发波长为330nm,发射波长为380 nm.Hcy的回收率为(102.08±4.94)％.线性范围为0.500～100μmol/L,检出限(以信噪比为3计)为0.016μmol/L.日内与日间相对标准偏差均小于5％.利用该方法对7例高血压患者和7例健康志愿者的血浆进行了测定,结果表明两组间的Hcy含量存在显著的差异(p＜0.05).本方法简单、快速、灵敏、特异,适用于血浆Hcy的临床定量测定.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2012(030)006【总页数】5页(P613-617)【关键词】高效液相色谱;荧光检测;同型半胱氨酸;血浆【作者】唐秀芳;甄乾娜;樊子勉;冯成亚;丁敏【作者单位】重庆医科大学检验医学院,临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆400016;重庆医科大学附属第一医院内分泌内科,重庆400016;重庆医科大学检验医学院,临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆400016;重庆医科大学检验医学院,临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆400016;重庆医科大学检验医学院,临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆400016【正文语种】中文【中图分类】O658同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种含硫氨基酸，为甲硫氨酸(methionine，Met)代谢过程中的重要中间产物。
新型荧光衍生试剂用于尿样中痕量游离雌二醇和雌三醇的 …
$ $ B94< 93"0@0? & ，5C* B%0D,0 ! ， ，EF4 :0"? ! ， ，5C* E3,13? & ，5C< G’3#30 ! ， !! :F G3(0? ! ，G<C H0?/"’ & ，
（ ! $ %&’ ()*+,)-+,’ +. (/.&01,2)3/4 53)6’7/7 +. !8)39+32 :,+;/34& ，<+66&2& +. <8&=/7-,’ !4/&34& ， >?.? #+,=)6 @3/;&,7/-’ ，>?.? "#$!%& ，<8/3) ；" $ #+,-8A&7- :6)-&)? B37-/-?-& +. C/+6+2’ ， -8& <8/3&7& 54)9&=’ +. !4/&34&7 ，D/3/32 ’!(((! ，<8/3) ；$ $ E,)9?)-& @3/;&,7/-’ +. <8/3&7& 54)9&=’ +. !4/&34&7 ，C&/F/32 !((()* ，<8/3) ）
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
柱前荧光衍生2高效液相色谱法测定尿和血清中的环境雌激素毛丽莎 孙成均3 李永新 吴德生 赵剑虹(四川大学华西公共卫生学院,成都610041)摘 要 建立了同时测定人尿和血清中环境雌激素双酚A 、42壬基酚、17α2乙炔基雌二醇及内源性雌激素雌三醇、17α2雌二醇和17β2雌二醇的对硝基苯甲酰氯柱前荧光衍生2高效液相色谱测定方法。
尿样经酸水解、固相萃取柱浓缩、净化分离;血清样品经乙腈沉淀蛋白后,用乙醚萃取游离态雌激素,N 2气流挥干、在无水条件下,雌激素与对硝基苯甲酰氯反应生成荧光产物,用高效液相色谱法定量。
检出限为2.7～8.3μg/L;加标回收率尿样为78.0%～102.5%,血清样为72.6%～98.6%;方法精密度为1.29%～4.52%。
应用本法对20份尿样和10份血清样进行了测定,结果满意。
关键词 柱前荧光衍生,高效液相色谱法,固相萃取,尿样,血清,环境雌激素 2003212210收稿;2004205217接受本文系国家自然科学基金重点资助项目(No .30030120)1 引 言近年来,关于外源性化学物质干扰人类和动物内分泌系统,影响健康和生殖的研究日益增多。
这些外源性化学物质中有一类具有雌激素活性,可模拟内源性雌激素的生理、生化作用,或具有拮抗雄性激素的效应,被称为环境雌激素(envir on mental estr ogens )[1]。
目前已报道的主要有人工合成的药用雌激素、植物性雌激素、真菌性雌激素、农药、工业化学物质等。
另外,有些内源性雌激素,如雌二醇、雌三醇等也可通过人类和动物的代谢产物排入环境,对水体生物产生不良影响。
环境雌激素不易降解,可通过水、食物、空气等介质直接或间接进入人或动物体内,干扰内分泌系统的功能,从而对机体的生殖发育、神经系统和免疫系统等产生多方面的影响。
所以,测定尿样和血清中的环境雌激素水平,可反映人体接触状况,为正确评价人体环境雌激素暴露水平提供科学数据。
环境雌激素的化学测定法主要有气相色谱法[2]、高效液相色谱法[3～5]、气相色谱2质谱联用法[6]和液相色谱2质谱联用法[7]等。
柱前荧光衍生2高效液相色谱法测定环境雌激素鲜有报道。
在作者前期工作[8]的基础上,利用荧光试剂对硝基苯甲酰氯(p 2nitr obenz oyl chl oride )作衍生剂,与上述被测化合物进行柱前衍生,然后用高效液相色谱法进行分离测定。
本法具有衍生反应可于室温下进行,反应速度快,方法简便快速,灵敏准确和操作步骤较简单等特点。
适宜于尿样和血清样品中雌激素的测定。
2 实验部分2.1 仪器及试剂HP1100型高效液相色谱仪(美国Agilent 公司),附荧光检测器;Luna 5μC 18色谱柱:5μm ,250mm ×4.6mm 、保护柱(美国Phenomenex 公司)、E NV 218型C 18SPE 柱、固相萃取装置(美国Supelco 公司)。
乙腈(色谱纯);甲醇(色谱纯);0.10g/L 对硝基苯甲酰氯(分析纯)乙腈溶液;M ili pore 超纯水(1812M Ω・c m );标准溶液:准确称取双酚A 、42壬基酚、17α2乙炔基雌二醇、雌三醇、17α2雌二醇、17β2雌二醇(均为Sig ma 试剂)各1.00mg,于10mL 容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度作为标准贮备液,临用前用甲醇稀释成10mg/L 混合标准应用液;其它试剂均为市售分析纯。
2.2 色谱条件流动相为乙腈2水,梯度洗脱条件为30%乙腈(V /V )0～12m in 线性增加至70%,12～12.3m in 从70%变为100%。
流速1mL /m in,荧光检测,采用波长切换,在0～8.4m in,激发波长282nm ,发射波长315n m ,8.4m in 后激发波长切换为228n m ,发射波长为316n m 。
进样量20μL 。
第33卷2005年1月 分析化学(FE NX I HUAXUE ) 研究报告Chinese Journal of Analytical Che m istry 第1期33～362.3 标准曲线制备分别取0.0、10.0、20.0、40.0和100.0μL 混合标准应用液置于5支2mL 刻度离心管中,弱氮气流挥干。
各加入0.10mL 对硝基苯甲酰氯乙腈溶液,摇匀后于暗处放置30m in,再加入0.40mL 30%乙腈2水,离心后,取上清液进样。
2.4 样品预处理2.4.1 尿样 吸取尿样0.50mL 置于10mL 具塞离心管中,依次加入0.05mL 浓盐酸,0.50mL 甲醇,于80℃水浴中作用1h 后取出,用5mol/L Na OH 溶液调溶液pH 至3左右。
每次调pH 前,须用对照尿样估计所用Na OH 溶液量。
样液过ENV 218SPE 小柱(过柱前,SPE 小柱分别用10mL 甲醇和5mL 水活化)。
然后用二氯甲烷5.0mL 分两次洗脱,合并洗脱液,过无水硫酸钠小柱脱水,氮气挥干。
然后 图1 标准及样品色谱图Fig .1 Chr omat ogram s of standards and sa mp les 1.雌三醇(estri ol ); 2.双酚A (bis phenol A );3.17β2雌二醇(17β2estradi ol ); 4.17α2雌二醇(17α2estra di ol ); 5.17α2乙炔基雌二醇(17α2ethinylestradi ol ); 6.42壬基酚(42nonyl pheonl )。
按2.3节所述方法进行衍生。
2.4.2 血清 吸取血清0.50mL 于10mL 具塞离心管中,加入2.0mL 乙腈沉淀蛋白后,再加入1.0mL 1mol/L HCl,1100mL 甲醇和2.0mL H 2O,用8.0mL 乙醚分3次液液萃取,合并提取液,于40℃水浴弱N 2流下挥干。
然后以2.3节所述方法进行衍生。
衍生后的样品按标准曲线制备方法进样测定。
标准及样品色谱图见图1。
3 结果与讨论3.1 色谱条件的选择3.1.1 检测波长的选择 分别对各标准衍生产物的激发和发射波长进行扫描,结果显示,两种异构体雌二醇、雌三醇的最大激发和发射波长分别为282和315nm;双酚A 、42壬基酚、17α2乙炔基雌二醇的最大激发波长和发射波长分别为228和316n m 。
由于双酚A 、17β2雌二醇、17α2雌二醇、17α2乙炔基雌二醇的保留时间接近,因本次实验的主要目的是测定3种环境雌激素,另外样品中雌二醇含量较高,所以选择雌三醇的激发波长为282nm ,发射波长为315nm;其余激发和发射波长均分别设置为228和316nm 。
3.1.2 流动相组成、柱温和流速的选择 流动相的组成对保留时间影响很大。
实验考察了甲醇2水和乙腈2水两种流动相。
由于甲醇2水不能完全分离6种衍生物,且峰型不理想,而乙腈2水分离效果好,故选择乙腈2水作流动相。
研究了不同的梯度洗脱条件对分离的影响。
经过多次实验,最后选择0～12m in 乙腈由30%(V /V )增加至70%,在12～12.3m in,乙腈由70%快速增加至100%,并保持至20m in 。
通过梯度洗脱,可以在20m in 内同时基线分离6种衍生物。
保持其他条件不变,对柱温(15℃～30℃)、流动相流速(0.8～1.5mL /m in )进行实验,根据最终的峰型和分离情况,选择柱温25℃和流速1.0mL /m in,分离度满足要求,且峰型也好。
3.2 衍生化反应条件的选择所研究的6种被测化合物除42壬基酚和双酚A 外,其余4种化合物本身的荧光强度较弱,直接荧光检测的灵敏度低。
故采用对硝基苯甲酰氯为荧光衍生剂,与6种雌激素在无水环境中发生荧光衍生化反应,生成具有强荧光物质。
衍生化后,17α2乙炔基雌二醇、雌三醇和两种异构体雌二醇的荧光效率明显提高。
3.2.1 衍生化反应时间的选择 保持衍生化的温度和衍生剂用量不变,将同一浓度混合标准溶液与衍生剂反应不同时间后测定。
结果表明,反应30m in,各化合物峰面积达最大且趋于稳定,故本法选择反应衍生化时间为30m in 。
3.2.2 衍生化反应温度的选择 衍生化反应温度对衍生物的产率和稳定性有显著影响。
固定其它反43 分析化学第33卷应条件不变,在不同温度下进行衍生化反应后测定。
结果表明,在4～50℃,各衍生物峰面积可达最大,超过50℃后,峰面积逐步下降,本法选择衍生化温度为室温(25℃)。
3.3 样品处理条件实验3.3.1 尿样 雌二醇在尿液中主要与硫酸或葡萄糖醛酸生成的结合形式存在[7],雌激素游离态低于10%。
故需把结合态水解成游离态。
水解方法主要有酶水解法和酸水解法,本实验采用酸水解。
对水解时间(10m in、30m in、1h、2h)、水解温度(25℃、50℃、70℃、100℃)、水解酸度(0.2mol/L、0.6mol/L、1.0mol/L、2.0mol/L)进行三因素四水平的正交实验,对各条件进行最优化选择。
实验结果表明,当水解时间为1h,水解温度为70℃,水解酸度为0.6mol/L时,水解效率达最高。
3.3.2 血清 本研究拟对血清中游离态雌激素的含量进行测定。
采取有机溶剂提取血清中的雌激素,实验了甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、二氯甲烷和正己烷的提取效率。
结果显示,除乙醚外,其他有机溶剂的提取效率均不理想。
经乙醚提取3次后,除雌三醇提取效率为70.6%、42壬基酚为73.0%外,其余均达99%以上,所以本法采用乙醚溶剂提取3次。
3.4 衍生产物稳定性实验将衍生后的溶液分别放置0h、1h、2h、4h、1d及2d后测定,结果显示,在24h内,衍生产物峰面积无显著变化。
3.5 方法的线性范围和检出限 在最佳实验条件下,本法线性范围上限至少可达1.0×104μg/L;相关系数达0.999以上。
以2倍信噪比(S/N=2)作为方法的检出下限,双酚A、17β2雌二醇的检出限为2.7μg/L、42壬基酚为2.9μg/L、17α2雌二醇和17α2乙炔基雌二醇为4.6μg/L、雌三醇为8.3μg/L。
3.6 精密度实验本法确定的实验条件下,将不同浓度的混合标准溶液于同一天内连续5次测定,根据峰面积计算得到42壬基酚、双酚A、17α2乙炔基雌二醇、雌三醇、17α2雌二醇、17β2雌二醇的相对标准偏差分别为4152%、3.92%、2.99%、1.29%、2.60%和3.31%。
3.7 标准加入回收实验对不同尿样进行不同浓度水平的加标回收实验,结果表明,本法回收率范围尿样为78.0%～10215%;血清样为72.6%～98.6%。
4 样品分析用本法对20份正常人尿样和10份血清样品进行了测定,结果见表1。