【源版】分子生物学——基因工程与基因体外表达
生物学优质课分子生物学与基因工程
生物学优质课分子生物学与基因工程生物学优质课：分子生物学与基因工程随着科学技术的不断发展和进步，生物学作为一门重要的学科，经历了许多重大的突破和变革。
其中，分子生物学与基因工程作为生物学的重要分支，对于人类和其他生物的研究具有广泛的意义和影响。
本文将以分子生物学与基因工程为主题，探讨其在生物学领域的重要性和应用。
一、分子生物学的基本原理分子生物学是研究生物体内各种生物分子（如DNA、RNA和蛋白质等）的结构、功能和相互作用的学科。
它通过研究生物体内的基因组成、蛋白质合成和代谢途径等方面，揭示了生命活动的分子基础。
人们通过对分子生物学的研究，不仅可以深入了解生命现象的本质，还可以为基因工程和生物技术的发展提供理论支持。
二、基因工程的概念与应用基因工程是通过操作和改变生物体内的基因来实现对其性状的改良和调控的技术。
它充分利用了分子生物学的原理和技术，可以对生物体内的基因进行修改和调整，从而产生预期的目标物质或性状。
在生物农业、医学、工业以及环境保护等领域，基因工程的应用非常广泛。
例如，转基因作物的培育可以提高作物的抗病虫害能力和产量；基因治疗可以用来治疗遗传性疾病和某些癌症等。
三、分子生物学与基因工程在医学领域的应用分子生物学和基因工程在医学领域的应用非常丰富多样。
通过分子生物学技术，人们可以检测和诊断疾病的基因突变，以及寻找新的疾病标志物。
同时，基因工程技术也为疾病的治疗和预防提供了新的思路和方法。
例如，基因治疗可以用于修复受损的遗传物质，为某些无法根除的疾病提供治愈的可能。
四、分子生物学与基因工程在生物农业领域的应用在生物农业领域，分子生物学和基因工程的应用可谓广泛而深入。
通过合成新的基因组合，科学家们成功培育了许多具有抗虫、抗病和耐逆性等特点的转基因作物。
这些转基因作物具有更高的产量和更好的品质，为解决全球粮食安全等问题提供了重要的途径和手段。
五、分子生物学与基因工程在环境保护领域的应用除了在农业和医学领域，分子生物学和基因工程也在环境保护中发挥着重要的作用。
基因工程与体外表达
的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。
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2. DNA聚合酶Ⅰ大片段
DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌 蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片 段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。
Published by AAAS
Synthetic Genome Brings New Life to Bacterium (2010/5/20)
E. Pennisi Science 328, 958-959 (2010)
Life re-created. Blue colonies (top) indicate a successfully transplanted genome, with selfreplicating bacteria revealed in an electron micrograph.
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Genetically modified crops
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E. Stokstad Science 328, 295-a (2010) (2010)
Going green. Rather than plowing, farmers can control weeds by spraying biotech crops with herbicides, which lessens soil erosion and reduces fuel costs.
5. 几个小时之内，受体细菌内原 有DNA的全部消失，人造细胞不 断繁殖。新的生命诞生了。
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第一节 基因克隆的工具酶
一、限制性核酸内切酶
(完整版)分子生物学与基因工程
绪论分子生物学 广义：研究蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能，也就是从分子水平阐明生命现象和生物学规律。
狭义：研究生物体主要遗传物质——基因或DNA 的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。
基因工程：是指将一种或多种生物体的基因或基因组提取出来, 或者人工合成的基因, 按照人们的愿望, 进行严密的设计, 经过体外加工重组, 通过一定的方法, 转移到另一种生物体的细胞内, 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。
里程碑事件：1944年，Avery 在肺炎双球菌转化实验中证实了DNA 是遗传的物质基础，标志着分子生物学的诞生。
1953年，Watson 和Crick 提出DNA 双螺旋模型，为分子生物学的发展奠定了坚实的基础。
1961年，法国科学家Jacob 和Monod 提出了乳糖操纵子模型。
1972年，Berg 构建了世界上第一个重组DNA 分子，开辟了生物学新领域——遗传工程。
1983年，Mullis 发明了聚合酶链式反应（PCR ）技术，极大地推动了分子生物学的发展。
90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”。
目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。
第二讲核酸的化学成分：核酸是一种高分子的化合物，它的构成单元是核苷酸，是核苷酸的多聚体。
核苷酸分子由三个部分组成：碱基：嘧啶、嘌呤 五碳糖：核糖或脱氧核糖 磷酸…………………………………………脱氧核糖核酸（DNA ）和核糖核酸（RNA ）（1）DNA 含的糖分子是脱氧核糖，RNA 含的是核糖；（2）DNA 含有的碱基是腺嘌呤（A ）、胞嘧啶（C ）、鸟嘌呤（G ）和胸腺嘧啶（T ），RNA 含有的碱基前3个与DNA 完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U ）所代替；（3）DNA 通常是双链，而RNA 主要为单链；（4）DNA 的分子链一般较长，而RNA 分子链较短。
分子生物学方法在基因工程中的应用
分子生物学方法在基因工程中的应用基因工程是一门涉及改变生物体遗传信息的科学领域，它利用分子生物学的方法来研究、处理与操纵基因。
分子生物学方法在基因工程中被广泛应用，对于基因的克隆、表达、编辑等方面发挥着重要作用。
本文将介绍几种常见的分子生物学方法，并阐述它们在基因工程中的具体应用。
首先，PCR（聚合酶链反应）是基因工程领域中最常用的技术之一。
PCR通过体外扩增特定DNA序列，可以快速大量复制目标DNA片段。
PCR 涉及到三个主要步骤：变性、引物结合和扩增。
变性使得DNA双链解旋形成单链，引物结合使引物与目标序列相互配对，而扩增阶段则利用DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
PCR方法可以在短时间内扩增出大量DNA片段，从而为基因工程研究提供了充足的DNA材料。
例如，研究人员可以利用PCR扩增特定基因片段，然后进行克隆、定点突变或表达分析。
其次，限制性内切酶是另一种基因工程中常用的分子生物学工具。
限制性内切酶能够识别DNA特定序列并切割成片段，这些片段可以用于基因的克隆、测序或分析。
限制性内切酶根据酶切的模式和目标DNA的序列特征可分为三种：切割双链DNA、仅切割一个链和产生粘性或平滑末端。
通过合理选择适当的限制性内切酶，研究人员可以实现特定DNA片段的识别和切割。
例如，利用限制性内切酶，可以将目标基因与载体DNA酶切产生互补的末端，从而实现目标基因的插入和克隆。
第三，DNA测序技术是基因工程领域中的关键方法。
DNA测序技术用于确定DNA序列的准确顺序，已成为基因工程和基因组学研究的重要工具。
Sanger测序是最早也是最常用的DNA测序方法之一。
其基本原理是利用DDNTP（二氧侧笨三磷酸核苷酸）与DNA链中底物的链延伸反应，并通过羰化终止子（DDATP、DDCTP、DDGTP和DDTTP）使产生的扩增链中断裂，从而实现DNA序列的测定。
通过Sanger测序技术，研究人员可以准确获得目标DNA序列信息，从而深入了解基因的结构和功能，进而为基因编辑、基因突变和遗传病研究提供基础。
5基因工程与体外表达
葡聚糖（ （三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法 葡聚糖 ） 外源DNA或重组质粒 或重组质粒DNA与DEAE葡聚 外源 或重组质粒 与 葡聚 糖混合， 糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学 葡聚糖带有大量正电荷的化学 基团，可与 中带负电荷磷酸基团结合， 基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合，并 中带负电荷磷酸基团结合 粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源 粘附于细胞表面， DNA进入细胞。此法简单、快速、有效，常用 进入细胞。此法简单、快速、有效， 进入细胞 于外源基因的短暂表达研究。 于外源基因的短暂表达研究。
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二、表达载体 (一) 原核表达载体 一 表达载体中含有复制起始位点、 表达载体中含有复制起始位点、抗性 基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结 合位点和转录终止信号. 合位点和转录终止信号
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(二) 真核表达载体 二
载体中含有原核复制起始位点、 载体中含有原核复制起始位点、抗生素 抗性基因、多克隆位点。 抗性基因、多克隆位点。还含有真核表达 元件,包括启动子 增强子和poly (A) 加尾 包括启动子、 元件 包括启动子、增强子和 信号。 信号。
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2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 聚合酶Ⅰ 聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of 聚合酶Ⅰ大片段 聚合酶 DNA polymerase I)为DNA聚合酶 用枯草杆菌 聚合酶I用枯草杆菌 为 聚合酶 蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片 裂解后产生的大片段， 蛋白酶 裂解后产生的大片段 段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 片段（ 段也称为 片段 ）。
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基因工程与体外表达课件
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
5.同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
A+
TCTAG
GATCT A
二、其他常用的工具修饰酶
• DNA聚合酶Ⅰ • DNA聚合酶Ⅰ大片段 • 反转录酶 • T4DNA连接酶 • 碱性磷酸酶：去除5’端磷酸基团 • 末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)：将dNTP加到DNA
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
四、人工化学合成
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
二的混合 体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一 个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA 分子引入宿主细胞并进行的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
（三） PCR扩增特定基因 TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业试剂
第十三章-基因工程与基因体外表达
第十三章基因工程与基因体外表达第一节基因克隆一．限制性核酸内切酶二．基因克隆中具有不同功能的工具酶第二节基因克隆中特定的DNA载体一．常用克隆载体（质粒和病毒）二．表达载体将外源基因带入宿主并进行表达第三节基因克隆的过程一．获取目的基因二．选择和准备载体三．DNA片段的连接四．重组DNA导入宿主细胞进行扩增五．筛选与鉴定第四节真核细胞基因转染一．真核细胞转染的方法与原理二．转染细胞利用抗性标记进行筛选第五节利用重组DNA技术对基因进行改造一．对特定基因的定点诱变二．利用基因定点诱变技术改变基因工程蛋白的特性第六节克隆基因在适当的宿主细胞表达一．大肠杆菌表达系统二．哺乳动物细胞外源基因的表达三．其他宿主细胞中也表达制备真核蛋白第七节电子克隆本章重点:掌握：DNA克隆概念，限制性内切酶的定义及其特点，基因载体的种类。
重组DNA技术的基本过程，目的基因获取的方法，外源基因与载体的连接方式，重组DNA分子导入受体菌的方式，重组体筛选的方法。
熟悉：基因组DNA文库和cDNA文库的概念，目的基因表达体系的种类及其特点了解：自然界基因转移的方式：接合作用、转化及转导作用、转座；重组有两种类型，即位点特异性的重组和同源重组本章难点两种类型基因重组的机理；限制性内切酶的作用特点，基因载体的种类；重组DNA技术的基本环节中，目的基因的获取方法，外源基因与载体连接的方法，重组DNA导入受体菌的方法，重组体的筛选方法，以及原核和真核表达体系的优缺点比较核心词：DNA重组基因克隆载体宿主细胞基本概念：DNA重组（DNA recombination）：不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。
基因克隆（gene cloning）：主要是进行制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制，扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝的过程。
基因工程（genetic engineering）：基因克隆后，利用克隆基因表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程。
基因工程与体外表达
通过融合标签、调节表达条件等方法解决产物不稳定性和聚集问题。
发展前景和研究方向
1. 开发更高效的表达系统 2. 研究蛋白质折叠和组装机制 3. 优化蛋白质后翻译修饰 4. 应用多维组学技术解析产物结构和功能
蛋白质生产
体外表达可用于大量制备重组蛋白，用于医药和工业领域。
药物筛选和特异性抗体制备
体外表达可以用于药物筛选和特异性抗体的制备，为疾病治疗和诊断提供重要工具。
பைடு நூலகம்
常见的基因工程表达系统
大肠杆菌
是最常用的表达系统之一，具 有易操作、高表达的优点。
酵母
常用于表达复杂蛋白和进行药 物筛选。
哺乳动物细胞
可用于表达大型蛋白和进行临 床前研究。
体外表达系统的优缺点
1 优点
高效、可扩展、质量可控、表达产物天然结构和活性。
2 缺点
特异性低、成本高、难以表达复杂蛋白、不适用于大规模生产。
体外表达中的关键因素和挑战
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选择合适宿主细胞
不同细胞具有不同的表达能力、转化效率和产量。
2
优化表达系统
包括选择合适的启动子、改进转染技术和优化培养条件。
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克服产物聚集和稳定性问题
基因工程与体外表达
基因工程是利用分子生物学和基因组学的知识进行人为干预的技术。体外表 达是将外源基因导入宿主细胞中，通过细胞内机制使该基因产生表达产物。
基因工程的原理和技术
• DNA重组技术 • 质粒构建和转染技术 • CRISPR基因编辑技术 • 基因递送系统
体外表达的意义和应用
研究基因功能
通过体外表达，可以探究特定基因的功能和作用机制。
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6. 末端脱氧核苷酸转移酶
（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT )
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第一节 基因克隆的工具酶
一、限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 从双链DNA内部特异位点识别并且裂
解磷酸二酯键。
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1. 限制性核酸内切酶的特点
类型 限制性 修饰作用 识别位点
切割位点
Ⅰ型 有
有
特异
识别位点下游109/10/30
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2. DNA聚合酶Ⅰ大片段
(large fragment of DNA polymerase I)
DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin) 裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow 片段（Klenow fragment）。
(3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。
(4) DNA序列分析。
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3. 逆转录酶（reverse transcriptase）
一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA 为模板合成DNA， 合成方向为5ˊ→3ˊ延伸， 无3ˊ→5ˊ外切酶活性。
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是由λ噬菌体的黏性末端（cos区）与质 粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其 克隆容量可达40～50 kb。
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(四) M13噬菌体 (M13 phage)
一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌 后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型 M13可用作克隆载体。
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5 ́ -CCCGGG-3 ́ 3 ́ -GGGCCC-5 ́
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5 ́ -CCC 3 ́ -GGG
GGG-3 ́ CCC-5 ́
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二、其他常用的工具酶
1. DNA聚合酶Ⅰ (DNA polymerase I)
● 聚合酶活性 ● 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 ● 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
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(五) 病毒载体
逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、 EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒 载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病 毒启动子、包装元件、选择性遗传标记， 以及pBR322的复制子组成。
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二、表达载体
(一) 原核表达载体
表达载体中含有复制起始位点、抗性基 因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点 和转录终止信号。
（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。
（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主 细胞进行选择，如抗生素抗性基因，
β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。
（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便
于外源基因的插入。
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第八章 基因工程与体外表达
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基因工程是指在体外对DNA分子按 照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和 重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而 能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产 物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究 基因表达的调节因子，以及研究基因的功 能等。
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特异
可知、固定
Ⅲ型 有
有
特异
识别位点附近切割DNA，
切割位点很难预测。
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2．限制性内切酶的命名
EcoRⅠ E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株
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3．限制性内切酶的识别和切割位点
通常是4～6个碱基对、具有回文序列 （palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位 切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末端（sticky end）。 如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端：
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4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）
催 化 双 链 DNA 一 端 3ˊ-OH 与 另 一 双 链 DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键， 使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接 起来。
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5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）
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(二)λ噬菌体
噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌 的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种。
λ噬菌体 M13噬菌体
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λZiplox载体
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(三)黏性质粒（cosmid）
5ˊ→3ˊ聚合酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
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Klenow片段的主要用途有：
(1) 补齐双链DNA的3ˊ末端。
(2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。
5ˊ-G-OH 3ˊ-CAATT-OH
Klenow
d*ATP,dTTP
5ˊ-GTT*A*A-OH 3ˊ-CAA T T-OH
第二节 基因克隆的载体
载体是携带目的基因，使其在宿主细 胞内复制或表达的DNA分子。
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一、常用的克隆载体
(一)质粒（plasmid） 是存在于多数细菌和某些真核生物染
色体外的双链环状的DNA分子。一般只能 容纳小于10 kb的外源DNA片段。
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作为克隆载体的质粒应具备下列特点：
5 ́-GAATTC-3’ 3 ́-CTTAAG-5’
5 ́-G
AATTC-3 ́
3 ́-CTTAA
G-5 ́
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PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端：
5 ́ -CTGCAG-3 ́ 3 ́ -GACGTC-5 ́
5 ́ -CTGCA
G-3 ́
3 ́ -G
ACGTC-5 ́
有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端 或钝端（Blunt end）, 如SmaⅠ：