DNA重组与克隆总结
基因重组知识点总结
基因重组知识点总结一、基因重组的原理基因重组的原理是在DNA分子水平上，通过切割和重组DNA的不同片段，形成新的DNA 序列。
基因重组可以实现DNA片段的互换、合并、删除或插入操作，从而改变DNA的序列，并且产生新的基因组合。
基因重组的原理主要涉及到DNA的结构、酶的作用和DNA片段的互补配对等方面。
1. DNA的结构DNA是由四种碱基（腺嘌呤A、胞嘧啶T、鸟嘌呤G、胞嘧啶C）组成的双链分子，它的结构在空间上呈现出双螺旋的形态。
每一条DNA链都由磷酸和脱氧核糖组成，而这些单元组成了DNA的主干。
而碱基对（A-T、G-C）则连接了两条DNA链，形成了DNA的双链结构。
2. 酶的作用在基因重组的过程中，酶起着至关重要的作用。
例如，核酸酶能够切割DNA分子，使得DNA的特定区域被切割成不同的碱基序列；而连接酶则能够将不同的DNA片段连接起来，形成新的DNA序列。
此外，一些重组酶还可以通过其催化作用来促进DNA分子的重组。
这些酶的作用在基因重组的过程中起着关键的作用。
3. DNA片段的互补配对在DNA重组的过程中，DNA分子的互补配对起着非常重要的作用。
DNA的双链结构使得其具有互补配对的性质，即A会与T形成氢键，而G则会与C形成氢键。
这种互补配对性质使得DNA片段能够通过互补配对的方式进行连接或重组。
综上所述，基因重组的原理涉及到DNA的结构、酶的作用和DNA片段的互补配对等方面。
通过这些原理，我们可以实现DNA分子中某一段DNA片段的与同一DNA分子或不同DNA分子中的另一段DNA片段重新组合成新的DNA序列。
二、基因重组的方法基因重组的方法主要包括DNA重组、基因克隆、基因组编辑和CRISPR-Cas9等。
这些方法可以分别用于不同的应用领域，并且在现代生物技术中有着重要的价值。
1. DNA重组DNA重组是指通过DNA片段的切割和重组来形成新的DNA序列。
这一方法主要依赖于核酸酶的切割作用和连接酶的连接作用。
基因克隆的原理
基因克隆的原理基因克隆是一种重要的生物技术手段，可以通过复制和传递DNA 分子，实现对特定基因的扩增和增殖。
基因克隆的原理是利用DNA 重组技术，将所需基因的DNA片段插入到载体DNA上，然后将重组的DNA转化到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆的过程可以分为DNA分离、DNA切割、DNA连接和DNA转化等几个步骤。
需要从源生物体中提取目标基因所在的DNA。
DNA分离是基因克隆的第一步，通常使用细菌或真菌等生物作为DNA的来源。
提取DNA的方法有很多种，常见的有碱裂解法和酚氯仿法等。
这些方法能够将DNA从细胞中释放出来，获得纯净的DNA溶液。
接下来，通过DNA酶切割技术将目标基因从DNA中剪切出来。
DNA酶切割是基因克隆的关键步骤，通过使用特定的限制性内切酶，可以将DNA分子切割成特定的碎片。
限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在特定的酶切位点上切割DNA，产生具有粘性末端的DNA片段。
然后，将目标基因与载体DNA进行连接。
载体是一种能够自我复制的DNA分子，可以将目标基因插入到载体中进行复制和表达。
常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
连接的方法有多种，常见的是使用DNA连接酶将目标基因与载体DNA连接起来。
连接后的DNA分子称为重组DNA。
将重组DNA转化到宿主细胞中。
转化是指将重组DNA导入到宿主细胞中，使其能够进行复制和表达。
常用的转化方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
转化后，宿主细胞将能够复制和表达重组DNA 中的目标基因。
基因克隆技术的应用非常广泛。
通过基因克隆，可以获得大量目标基因的DNA，用于研究基因的结构和功能，以及开发新的药物和治疗方法。
此外，基因克隆还可以用于制备重组蛋白、产生转基因生物和进行基因治疗等领域。
总结起来，基因克隆的原理是利用DNA重组技术将目标基因插入到载体DNA中，然后将重组DNA转化到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆技术的应用非常广泛，对于研究基因和开发生物技术具有重要意义。
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。
作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。
供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。
以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
生物基因工程知识点总结
生物基因工程知识点总结一、概述生物基因工程是指利用生物学、生物化学、分子生物学等多学科知识和技术手段对生物体的基因进行改造和调控的科学技术。
通过对基因的修饰、转移和表达，可以改变生物体的遗传特性，实现对生物体的功能和性状的改良。
生物基因工程在农业、医药、环境保护等领域具有广泛的应用前景。
二、基因工程的主要技术1.重组DNA技术重组DNA技术是指利用DNA分子重组、剪接和合成等手段，将来自不同生物体的DNA片段进行组合，构建新的DNA分子。
重组DNA技术的核心是DNA的克隆，包括DNA片段的插入、DNA连接和DNA复制等步骤。
重组DNA技术为基因工程的实施提供了基础和工具。
2.基因克隆技术基因克隆技术是指通过重组DNA技术将目标基因从一个生物体中提取并扩增，然后将其插入到另一种生物体的染色体中，使目标基因在新的宿主中得到表达。
基因克隆技术可以用于基因的纯化、基因的表达以及基因功能的研究等方面。
3.基因转导技术基因转导技术是指将外源基因导入到目标细胞或生物体中的技术。
常用的基因转导技术包括病毒介导的基因转导、质粒介导的基因转导和基因枪介导的基因转导等。
基因转导技术可以用于将特定基因导入到细胞中，实现基因表达或基因敲除等目的。
4.基因编辑技术基因编辑技术是指通过直接修改生物体的基因组，实现对基因的精确编辑和修饰。
常用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALEN 和ZFN等。
基因编辑技术可以实现基因的插入、删除、修改和替换等操作，用于研究基因功能和治疗基因相关疾病具有重要意义。
三、应用领域1.农业领域生物基因工程在农业领域的应用主要包括转基因作物的培育和农业生物技术的开发。
转基因作物通过引入抗虫、抗病、抗逆性等基因，提高作物的产量和品质，降低农药使用量，改善农业生产环境。
农业生物技术的开发包括农业生物育种、无性繁殖和抗病虫害等方面的技术创新。
2.医药领域生物基因工程在医药领域的应用主要包括基因药物的研发和基因诊断技术的应用。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
第十三单元 重组DNA技术
【执业】1．限制性内切酶是一种
A.核酸特异的内切酶
B. DNA特异的内切酶
C.DNA序列特异的内切酶
D.RNA特异的内切酶
E.RNA序列特异的内切酶
答案：C
【执业】2．限制性内切酶的作用是
A.特异切开单链DNA
B.特异切开双链DNA
C.连接断开的单链DNA
D.切开变性的DNA
E.切开错配的DNA
答案：B
二、发展新药物
利用基因工程技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界上的一项重大产业。目前已经或正投入市场的基因工程产品有胰岛素、生长素、促红细胞生成素、因子VIII、白介素-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肥大细胞生长因子及白血病抑制因子等。
三、DNA诊断
DNA诊断又称基因诊断，目前已发展成为一门独具特色的诊断学科——DNA诊断学。DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平上分析、鉴定遗传性疾病所涉及的基因的置换、缺失或插入等突变。目前用于DNA诊断的方法很多，但其基本过程相似：首先分离、扩增待测的DNA片段，然后利用适当的分析手段，区分或鉴定DNA的异常。目前广泛用于待测基因的分离及扩增技术是PCR技术，其次是连接酶链反应。常用的DNA分析手段有限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、核酸分子杂交、变性梯度胶电泳、核酸酶A技术以及DNA序列分析等。
五、遗传病的防治
受累疾病基因克隆不仅为医学家提供了重要工具，使他们能深入地认识、理解一种遗传病的发生机制，为寻求可能的治疗途径、预测疗效提供了有力手段；更重要的是可以利用这成果进行极有意义的产前诊断，而后通过治疗技巧与治疗、预防能力的结合，从根本上杜绝遗传性疾病的发生和流行。
DNA重组(DNA recombination)技术：DNA重组与鉴定-1
DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组与鉴定-1重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。
重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称基因克隆。
重组的DNA分子也能够在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质的表达。
一、DNA重组重组DNA分子的构建所需的目的基因或DNA片段可来自基因组DNA、cDNA以及人工合成的DNA片段；载体最常用的是质粒、噬菌体及逆转录病毒等；它们在限制性内切酶的作用下，可形成粘性末端或平齐末端，在DNA连接酶的作用下可连接成一个DNA 重组体。
（一）目的DNA片段与载体的连接主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体遗传性状的目的。
DNA克隆的一项关键技术就是DNA重组技术，所谓DNA重组，就是指把外源目的基因“装进”载体过程，即DNA的重新组合。
这种重新组合的DNA叫做重组体，因为是由两种不同来源的DNA组合而成，所以又称异源嵌合DNA。
载体在DNA克隆中是不可缺少的，目的基因片段与之共价连接形成重组体后，才能进入合适的宿主细胞内进行复制和扩增。
作为载体DNA分子，必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达能力，这样，外源目的基因装入该载体后，才能在载体的带动下一起复制，达到无性繁殖的目的；载体分子不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯；载体上应具有两个以上的容易检测的遗传标记，以区分阳性重组分子和阴性重组分子。
选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成嗜菌斑的能力等；载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点，以便从中选出一种酶，使它在目的基因上没有切点，保持目的基因的完整性。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
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发生在DNA分子内或分子间的遗传信息重 新组合，称为遗传重组(recombination)或基因重 排，重组产物称为重组体DNA(recombinant DNA)。 真核生物基因重组的主要途径，是减数分 裂时同源染色体之间的交换。 细菌的基因组为单倍体，虽然不进行减数 分裂，也可通过多种形式进行遗传重组，如质 粒DNA插入宿主的染色体均是典型的1条 链在相同的位置被特异性的内切 酶切开。 (2) 交叉和连接 被切开的链交 叉，并与另一个分子的同源链连 接，分子弯曲形成Holliday连接。 (3) 拆分 水平方向的切割(WE 裂解)，由此产生的重组体制交 换了DNA的一个小片段，称补 丁重组体(patch recombinant heteroduplex)。垂直方向的切割 (NS裂解)，由此产生的重组体有 一条链由两个DNA分子的链拼 接而成，称拼接重组体(splice recombinant heteroduplex)。
6.1.1.2 单链断裂模型(the singlestranded break model)， 单链断裂模型认为，在同源 区时，只有供体分子产生一个单 链切口，形成DNA单链，并入侵 受体DNA分子，形成Holliday结 构。其后进行的交叉点移动，和 Holliday结构的拆分，与Holliday 模型相同。单链断裂模型能很好 的解释细菌的接合作用和转化等 原核生物的同源重组，以及DNA 损伤的重组修复。
6.1.2 细菌的基因转移与重组
6.1.2.1 细菌的接合作用(conjugation)
细菌的细胞相互接触时，遗传信息可在接 合质粒的参与下，由一个细胞转移到另一细胞， 称为接合作用。
能够促使染色体基因转移 的接合质粒称为致育因子 (fertility factor)，简称性因子
6.1 同源重组
同源重组(homologous recombination)发生在同源 DNA片段之间，是在两个DNA分子的同源序列之间 直接进行交换的一种重组形式。不同来源或不同位 点的DNA，只要二者之间存在同源区段，都可以进 行同源重组。由于其广泛存在，亦称一般性重组 (general recombination)。 细菌的接合(conjugation)、转化(transformation) 和转导（transduction)，以及真核细胞减数分裂时同 源染色体之间发生的交换等都属于同源重组。
DNA重组对生物进化，物种多样性和种群
内的遗传多样性起着关键的作用。 基因突变: 有利突变，有害突变 生物如何积累有利突变，淘汰有害突变？ DNA重组能迅速增加群体的遗传多样性 (diversity)，通过优化组合(optimization)积累有利 突变，推动生物进化。
用人工操作构建DNA重组体，将其导入 受体细胞扩增或表达，称DNA克隆或分子克隆 (molecular cloning)，也可称作重组DNA技术， 或基因工程。 基因工程技术制造生物制品。 定向改变生物的遗传特性，使生物体获得 某些优良性状。转基因食品安全? 基因治疗, 安全性?
6.1.1.3 双链断裂模型 双链断裂模型(the double-stranded break model, DSB) 认为，受体双链(recipient duplex)两条链的断裂 启动了链的交换，不产生断裂的被称为供体双链 (donor duplex)。随后发生的DNA修复合成以及切口 连接导致形成两个Holliday连接。 DNA受到的双链断裂损伤，可以通过同源重组 来修复，在修复损伤的同时，进行基因重组。 真核生物的细胞减数分裂时的同源重组，符合 双链断裂模型。
接 重 组 体
5´ 片 3´ 段 重 组 5´ 体 3´
5´
5´
3´
目录
Potter和Dressler在电镜下看到的Holliday 中间体的结构(图6-2)，是对Holliday模型强有 力的支持。
尽管Holliday模型能解释重组的许多特征， 但也有某些不足。其一，DNA重组时，通常有一 个分子是供体，另一个是受体，而Holliday模型 无法区分供体和受体。其二，Holliday模型需要 两个DNA分子各有一条链在同一位置被切割，目 前尚未发现完成这一过程的确切机制。
(1) 内切酶切开受体双链DNA分子同源 区的两条链，启动重组过程(图6-3a) 。 (2) 在外切酶的作用下，双链切口扩大， 产生两个具有3'-末端的单链区，并形成一个 缺口(图6-3b)。 (3) 一个自由的3'-端入侵供体双链DNA 分子的同源区，形成异源双链，供体双链的 一条链被取代，产生取代环(a displacement loop, D环, 图6-3c)。 (4) 人侵的3‘-端引发以被人侵DNA链为 模板的DNA合成，导致D环扩大。以D环的 单链为模板，填补受体链上的缺口(图6-3d)。 (5) DNA连接酶连接切口，形成两个 Holliday连接，即联结体x和联结体y(图6-3e)。 (6) Holliday连接的拆分有4种可能。
5´ 3´ 3´ 5´
Holiday中间体
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´
内切酶 (ruvC)
3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´
内切酶 (ruvC)
5´ 3´
3´
5´
5´ 3´
5´ 拼
5´
3´
DNA 连接酶
3´
DNA 连接酶 3´
3´
5´
5´3´ 3´
6.1.1 同源重组的分子模型 6.1.1.1 Holliday模型 Holliday模型由美国科学家Holliday于1964年提 出。 (1) 切割 2条同源DNA各有1条链在相同的位置 被特异性的内切酶切开。 (2) 交叉和连接 被切开的链交叉，并与另一个 分子的同源链连接，分子弯曲形成Holliday连接。 (3) 拆分，产生重组体 补丁重组体(patch recombinant heteroduplex)。 拼接重组体(splice recombinant heteroduplex)