人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞的形态学观察与功能研究

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树突状细胞体外分离扩增技术研究进展

树突状细胞体外分离扩增技术研究进展彭卫斌１综述；沙卫红２＋审校摘要：树突状细胞（ＤＣ）是目前所知的体内功能最强的专职抗原呈递细胞，是机体免疫反应的始动者，被称为机体防御病原微生物侵袭的重要“哨兵”，在移植排斥、抗肿瘤、抗病毒感染和自身免疫疾病中发挥着重要作用。

获得大量高纯度且表型、功能典型的ＤＣ是上述基础和临床研究的前提。

从直接分离提取到添加细胞因子诱导扩增ＤＣ研究获得很大进展，成为当今免疫学及肿瘤治疗学等相关学科的研究热点。

本文对ＤＣ体外分离、纯化及扩增方法作一简要综述。

关键词：树突状细胞；分离；扩增；细胞培养中图分类号：Ｑ８１３文献标识码：Ａ文章编号：１００４－２３６９１２００９）１１－０６７９－０４ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏＰＥＮＧＷｅｉ－ｂｉｎ。

ＳＨＡＷｅｉ—ｈｏｎｇ”．１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ，ｓｔｔｏｓｐｉｔａｌ，ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＧｕａｎｇｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎ磐ｚｈｏｕ５１０１８０．Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００８０，Ｃｈｉｎａ；‘Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｈ－ｓｈａ＠１６３．ｅｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ（ＤＣ）ｗｈｉｃｈｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎａｌｌｏｇｒａｆｔｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ，ａｎｔｉ—ｖｉｒａｌｉｎ－ｆｅｅｔｉｏｎｓａｎｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓｉｓｋｎｏｗｎａｓｔｈｅｍｏｓｔｐｏｗｅｒｆｕｌａｎｄｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌｉｎｖｉ—ＶＯ．ＨｏｗｔｏｃｕｌｔｉｖａｔｅａｎｄｐｕｒｉｆｙＤＣｗｉｔｈｈｉ。

树突状细胞

令人遗憾的是，洛克菲勒大学当日晚些时候证实，2011年诺贝尔生理学或医学奖得主加拿大细胞生物学家拉尔夫·斯坦曼于9月30日（上周五）逝世，享年68岁。洛克菲勒大学称：“4年前，拉尔夫·斯坦曼被诊断患有胰腺癌，他利用自己发明的基于树突细胞的免疫疗法，延长了生命。”欣慰的是，我们可以从中看到树突状细胞（DC）在治疗癌症等病症的广阔前景。
谢谢观看
DC与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+ T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。
树突状细胞(17张)DC抗肿瘤的机制如下：①DC可以高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，MHC分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，并递呈给T细胞，从而启动MHC-I类限制性CTL反应和MHC-Ⅱ类限制性的CD4+ Thl反应。同时，DC还通过其高表达的共刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。②DC与T细胞结合可大量分泌IL-12、IL-18激活T细胞增殖，诱导CTL生成，主导Th1型免疫应答，利于肿瘤清除；激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用；③DC分泌趋化因子(Chemotactic Cytokines， CCK)专一趋化初始型T细胞促进T细胞聚集，增强了T细胞的激发。保持效应T细胞在肿瘤部位长期存在，可能通过释放某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。
树突状细胞
血液细胞
01 简介
03 来源 05 荣誉
目录
02 分布 04 功能
树突状细胞（也称DC细胞）是由加拿大学者Steinman于1973年发现的，是功能最强的抗原提呈细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。

DC细胞的体外诱导培养方法与前体细胞的选择

DC在机体免疫监视机制中起着哨兵作用，它能对肿瘤抗原进行识别、处理和提呈，从而启动机体对肿瘤的特异性免疫应答。

目前制备的以DC为基础的肿瘤疫苗就是利用DC这一特性，因此有效地在体外扩增培养DC是制备DC肿瘤疫苗的重要前提。

以下我们将就DC前体细胞选择以及DC培养所需细胞因子进行介绍。

一、DC前体细胞的选择1.直接分离骨髓、脐带血或外周血中DC：DC在组织中含量甚微，在血液中仅占单个核细胞总数的0.5％～1.0％，难以分离、纯化，且呈高度分化状，体外不易长期培养，更难建系。

因此该分离方法目前仅用于DC免疫活性，表面标志及DC亚型功能差异的研究；2.从人骨髓或脐带血的CD34+造血干细胞诱导DC：我们通常所指的DC均为髓系DC，其来源于人CD34+造血干细胞。

CD34+造血干细胞是具有多向分化潜能和大量增生能力的细胞，其可从人骨髓或脐带血中分离，在体外通过联合GM—CSF、SCF、IL—6、IL—3等多种细胞因子培养，诱导扩增生成大量的DC，但其缺点在于取材不方便，不利于广泛使用；3.分离外周血中CDl4+单核细胞：此方法为目前最常选用的分离获取DC前体细胞的途径。

通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，利用免疫磁珠分选出CDl4+单核细胞，采用GM—CSF与IL—4(或IL—13，其与IL—4具有相似性质)联合培养体系，经7～10天即可诱导出大量的典型的DC；4.由高度纯化的中性粒细胞前体细胞诱导DC：利用高度纯化乳铁蛋白阳性的中性粒细胞前体细胞，在培养体系中加入6MCSF，IL—4和TNF—d，可得到DC样形态及具有DC相关表面分子的细胞。

从功能上比较，这些中性粒细胞诱生的DC特征与经典DC的群体相似；5.从人外周血或脐血CD34+前体细胞诱导DC：由于CD34+造血干细胞含量非常少，因此应用受到限制。

为克服这一难点，有人即采取分离外周血或脐血中含量较高的CD34+前体细胞联合细胞因子大量培养扩增，诱导生成DC；6.由白血病细胞诱导分化生成DC：目前的研究发现，可将白血病细胞诱导分化为功能成熟的DC，且这些白血病细胞来源的DC可提供大量的白血病相关抗原并进行肿瘤抗原呈递，而无需体外预激过程，从而减少了污染的机会，这种体外扩增的方法在临床治疗应用上极具吸引力。

树突状细胞分类及调节性树突状细胞获取方式的研究进展

第１０卷　第２期２０１９年３月Ｖｏｌ．　１０Ｎｏ．　２Ｍａｒ．　２０１９器官移植Ｏｒｇａｎ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ【摘要】树突状细胞（DC ）虽然数量少，但其在机体免疫系统中发挥的作用却逐渐受到认可和重视。

研究表明DC 由不同的亚群组成，具有不同的处理抗原的能力和激活不同效应淋巴细胞等能力。

其中，调节性树突状细胞（DCreg ）是一群具有负向免疫调控功能的DC 亚群。

DCreg 能够通过不同的机制诱导机体免疫耐受，在器官移植、自身免疫性疾病、肿瘤等不同领域均发挥着重要作用。

但DC 在体内分布广泛，且含量少，生理情况下半衰期短，建立成熟的DC 培养技术，特别是如何获取足量的DCreg ，是目前免疫学界研究的重要领域。

本文就DC 的分类和DCreg 体外获取方式进行综述。

【关键词】树突状细胞；调节性树突状细胞；细胞因子；间充质干细胞；免疫抑制剂；凋亡；基因工程技术【中图分类号】R392，R789 【文献标识码】A 【文章编号】1674-7445（2019）02-0014-04·综述·众所周知，树突状细胞（dendritic cell ，DC ）最主要的功能是抗原提呈，它也被认为是功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting cell ，APC ）。

几十年来，在学者的不断探索中，不同的DC 亚群及其免疫功能被认识。

DC 不但能提呈抗原、激活免疫反应，更重要的是其还能诱导自身免疫耐受。

正因如此，DC 开始作为免疫治疗的一种新手段，在感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等领域崭露头角。

近年来的研究表明，不同来源、不同部位、不同发育阶段的DC 往往具备不同的细胞表型，分泌不同的细胞因子，发挥不同的免疫作用，成为不同的DC 亚群。

其中，调节性树突状细胞（regulatory DC ，DCreg ）则是一群具有负向免疫调控功能的亚群，它能够通过不同的机制诱导自身免疫耐受，成为免疫学界关注的对象。

树突状细胞研究进展 (带参考文献)

树突状细胞研究进展摘要：树突状细胞（dendritic cells ,DC）是目前已知的功能最强的专职性抗原呈递细胞（APC），1973年Steiman和Cohn首次从脾脏中分离出一类与粒细胞、巨噬细胞、和淋巴细胞形态和功能都不相同的白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树突状突起，故命名为树突状细胞。

DC膜表面高度表达MHC的I类和MHCⅡ类分子以及其他多种与免疫应答有关的细胞因子，DC能有效摄取、加工、提呈抗原，并能显著刺激初始型T淋巴细胞的增殖分化和成熟，并在免疫应答中起着重要作用，本文就DC的免疫应答研究进展作一综述。

关键词：树突状细胞结构功能免疫激活免疫耐受近年来随着免疫学与分子生物学的最新进展，人们认识到树突状细胞是机体抗原提呈细胞中最主要的和最有效的成分，在调控机体细胞免疫中起重要的作用。

树突状细胞是开启免疫反应的始动细胞，也是机体免疫应答反应过程中的关键环节。

因此对DC的生物学特征研究越来越受到人们的关注。

1 DC的生物学特征1.1 DC的来源在研究中人们发现DC的来源主要起源于两种途径：1）骨髓来源的DC，大多数DC 来源于骨髓，由骨髓CD34+细胞分化而来，数量较少仅占外周血单核细胞的1％以下。

骨髓CD34+具有双潜能，由M-CSF可诱生为巨噬细胞，而由Ⅵ-CSF／TNF-α可诱生为DC。

骨髓来源的DC 分布广泛，外周血中存在有骨髓来源的DC前体细胞，DC前体细胞进入外周血后进一步分化成熟。

2）淋巴组织来源的DC，是胸腺中分离的前体细胞发育而来，表达低水平的CD34，无其他T细胞标志，主要分布于胸腺髓质T细胞居留区，这类细胞可能与自身及外来抗原的免疫耐受有关。

1.2 DC的形态特征及表面标志不同发育阶段的DC具有不同的形态特征，谢遵江等在体外培养小鼠骨髓树突状细胞的观察研究中，在无菌条件下提取小鼠骨髓细胞进行分化增殖，在光镜下观察。

培养7天后可见，细胞体积增大，周边刺突十分明显，突起较粗大，分支较明显，细胞形态似星形或梭形，细胞核明显，细胞聚集生长。

体外活性实验

体外活性试验相关知识以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC ），分别负载多肽抗原，产生特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL ），以探讨其对靶细胞的杀伤作用。

抗原肽诱导CTL 制备：① 外周血单核细胞（PBMC ）的分离：分别选取（经BCG 免疫，PPD 阳性）HLA-A2.1+、HLA-A3+ 人抗凝外周全血，通过淋巴细胞分离液分离获得PBMC 。

② 树突状细胞的诱导：将PBMC 在24孔板中贴壁培养，分离贴壁的单核细胞，每孔加含FBS 、GM-CSF 和IL-4的1640培养基，于37℃、5%CO2孵箱中，培养至第5天加LPS 诱导成熟，用相差显微镜观察DC 诱导培养过程中的细胞形态学变化。

通过流式细胞术检测CD1a 、CD83、CD80、HLA-DR 的表达。

③ 细胞毒T 淋巴细胞（CTL ）的体外诱导：DC 诱导至第5天，加入待测肽，第7天收获DC 。

于24孔板中加入用免疫磁珠分选的CD8+ T 淋巴细胞作为反应细胞，DC 作为刺激细胞，第2天加IL-2，置37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。

用肽负载的DC 按前述方法再重复刺激3次。

收获CTL 用于检测。

细胞毒性分析：④细胞毒活性检测：CTL杀伤实验用MTT法和4小时51Cr释放法。

以抗原肽诱导CTL为效应细胞(E)，负载抗原肽的T2细胞作为靶细胞(T)。

MTT法按效靶比20:1加入96孔板中，靶细胞每孔1×103个，设单独靶细胞孔和单独CTL孔，每组3复孔，每孔200 μL。

37 ℃、5 %CO2孵育48 h后,加入MTT 0.2 mg/孔，继续培养4-6 h，去上清，加入DMSO 100 μL/孔，显色，酶标仪于波长570 nm下读数。

按以下公式计算杀伤率。

同时以不相关肽诱导的CTL作为阴性对照。

杀伤率=[1－（试验孔A值-效应细胞孔A值）/靶细胞孔A值]×100% 4h51Cr释放法MTT 实验中与阴性对照比较杀伤作用存在显著性差异的候选肽使用更精确的4h51Cr 释放法来验证。

不同诱导方法对人外周血树突状细胞体外成熟的影响

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【ｂｔｃ】ＯｊｃｖＴｖｓｇｔｔｍｎｙｅｅｆｉｅｎｃｔｉｎｉｍｔｅＡｓａｔｒｂｅｔｅｏｉｅｉｅｈｉｕｉｆｃｏｄｆｅｔｙｋｅｏａｒｉｎｔａｅｍｔｆｔｆｒｏｎｍｕ
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・
不同诱导方法对人外周血树突状细胞体外成熟的影响
刘璐李琳伍衡闵军王捷曾育杰褚忠华
探讨不同诱导方式对于体外培养的树突状细胞（ｅｄｔｌ，Ｃ免疫刺激ｄｎｒｉｃｌＤ）ｉｅｓｃ
通过ｒＧＣＦ和Ｉ一ｈＭ．ＳＬ４体外诱导的人外周血单核细胞来源的Ｄ分别用肿瘤Ｃ，
标记小鼠抗人Ｃ８与ＨＬ．Ｄ３ＡＤＲ、异硫氰酸（ｕｒｃｉｉｔｉｃａａｅＦＴ）ｌｆｏｅｅｎｓｈｏｙｎｔ，ＩＣ标记小鼠抗人Ｃ８、ｏＤ６

人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究

第１１卷第８期
・５６１・
人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究
张秀敏曲萍郭风袁媛王净王超王慧（１第四军医大学基础部病理与病理生理学教研室；四军医大学教学实验中心；２第３第四军医大学西京消化病医院陕西西安７０３）１０２
ａａｈｓｎｏＣｐｅｕｓｒｔｒｍｏｅｓｓｅｄｎｅｌａｄｓｏｇｙａｈｓｅｃｌ；Ｄｅｅｉｌｔｏｕａｅｐｅａｂｏｄｗｔｅｉ— ｌｄｅｉｆｒｃｒｓｏｅｖｕｐｎｉｃｌｔｎｌｄｅｉｅｌ ④ ＣｗｒｏａｄｆｍｈｍｎｐｒｈｒｌｌｉｔｏＤｏｇｓｎｒｖｓｓｅｒｉｈｈｎｄｃｉｆｍｎｎｅａｅｌｂｅｏｂｎｔｈｍａｒｎｌｃｔ／ｃｐａｅｃｌｙｓｍｌｔｇｆｃｏｎｅｏｂｎｎｈｍａｔｒｕｉ４ｕｔｎｏｏｏｕｌｒｌｙｒｃｍｉａｕｎｇａｕｏｙｅｍａｒｈｇｏｏｔｕａｉａｔｒａｄｒｃｍｉａｔｕｎｉｅｌｋｎ．⑤ ｏｅｃｓｎｏｎｉｎｎｅ
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天津ＴＤ研究所，ＳＢＢＡＣ试剂盒购自武汉博士德公司。
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维普资讯
实用医学杂志２０年第２卷第４０５１期
３ｌ６
・
基础研究・
人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞的形态学观察与功能研究
史毓杰江振友董军
摘要目的：探讨从人外周血单核细胞体外培养扩增的树突状细胞（ｅｄｉｃｃｌ，ＣｄｎｒｉｅｌＤ）形态学特征及其活ｔ性。方法：人外周血常规分离单个核细胞，附６ｈ后去除悬浮细胞，以细胞因子粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子粘（Ｍ—Ｓ）白细胞介素一（一）ＧＣＦ、４Ｉ４进行诱导培养７ｄ，Ｌ并进行形态学特征，细胞表型和淋巴细胞刺激能力鉴定。结果：培养１周即可得到大量Ｄ形态学观察可见细胞形态不规则，Ｃ，细胞表面大量突起，为典型的ＤＣ特征，免疫组化和间接免疫荧光显示ＣｌＤａ阳性表达率达８％～５，０９％并能刺激同种淋巴细胞增殖反应。结论：外周血单核细胞可经人
５％Ｃ．Ａｆｒ６ｈｕｓｎｎｄｅｅｔｃｌｅｅｇｎｌｅＯ２ｔｏｒ．ｏａｈｒｎｅｌｗｒｅｔｒｍｍ．ａｄｔｅａｈｒｎｅｌｗｒｕｔｒｄｉｄｕｉｅｓｙｅｄｎｈｄｅｅｔｃｌｅｅｃｌｕｅｎｍｅｉｍｗｔｓｈ
维普资讯
实用医学杂志２０年第２巷第４０５１期
呈圆形、椭圆形、不规则形等，体积比单核细胞大１～细胞并鉴定。１５图１．．倍（）１３瑞氏染色收集细胞，．涂片、干燥后丙酮固定，２２形态学观察瑞氏染色细胞染成蓝色，体积稍．ＰＳ２次，Ｂ洗空气干燥，氏染液染ｌｉ后加蒸馏水大，瑞ｎａｒ核深染，形态不规则，细胞膜边界不清．表面有毛混匀，染色１ｉ，０ｒｎ流水冲洗，ａ干燥后中性树胶封片，刺样或树突样突起（２扫描电镜见细胞形态不规图）镜检则，表面有大量突起。１４扫描电镜细胞接种盖玻片（．用多聚赖氨酸处理）干燥后ＰＳ清洗５ｍｎ次ｘ，．％戊二醛固定，Ｂｉｔ／２５３２ｈＢ清洗５ｒｎ次ｘ，酒精梯度睨水（Ｏ、．ＰＳｉ／ａ５５％
Ｇｒｕｃｔ／ａｒｐａｅｏｏ）ｓｍｕｔｇｆｔｒＧ — Ｓ）ｎｔｒｕｉ一（Ｌ４ａ３ ℃ ．ｕｄｆｄ％Ｃ２ｏｏｅａｌｙｅｍｃｏｈｇｌｎ一ｉｌｉｃ（ＭＣＦａｄｉｅｅｋｎ４Ｉ一）ｔ７ｎｏｃ，ｔａｎａｏｎｌｈｍｉｉｉｅ５Ｏｒｒｆｍ
ｍｏ／，ｍｌＬ青霉素、链霉素各１０Ｕｍ，００／Ｌ１％小牛血清）调整细胞数２ｍ，１／Ｌ加入６孔板，Ｘ０每孔２Ｌ３ｃ，７ｍｃ
５Ｃ２％０培养箱培养６ｈ吸弃上清，ＰＳ，用Ｂ轻洗２，次去除非粘附细胞，每￣；人含１％新鲜小牛血清的ＬｇＪ０１４培养液２ｍ及细胞因子Ｇ —Ｓ、Ｉ一（６０ＬＭＣＦＬ４终浓度
１资料与方法
１２正常人外周血Ｄ．Ｃ体外诱导培养无菌取新鲜
人外周血５Ｅ来自广州市中心血站）肝素抗凝（００ｍ（，２Ｕｍ）用生理盐水１１／Ｌ，：比例稀释后缓慢沿离心管管壁加到淋巴细胞分离液上，离心（８０ｇｍｎ２ｉ）１０／ｉ，ｍｎ０取中间白色云雾层细胞，生理盐水洗涤２（００ｇ次１０／
ＧＣＦ１０ｎ／，一０ｎ／）置３ ℃ ５Ｃ２Ｍ— Ｓ０ｇｍＬＩ４５ｇｍＬ，７Ｌ％Ｏ
作者单位：１６２广州市，５０３暨南大学微生物与免疫学教研室（史毓杰，振友）病理生理教研室（江，董军）
培养箱继续培养，每隔３ｄ半量换液，加入全量细胞因
（ｔｅｒｅｔｇｅ，Ｐ）在机体的免疫应答中ａｉｎｐｅｎｉｌＡＣ，ｎｇｓｎｃｌ起关键的调节作用。但是由于Ｄ在组织中含量极少，Ｃ
在血液中仅占单个核细胞总数的０１～１０＿，．％．％】难１以分离、纯化，因此限制了ＤＣ的研究和应用。本研究从正常外周血获取贴壁单核细胞，在细胞因子作用下培养扩增出Ｄ，Ｃ并通过对其形态、表面标记及功能进行鉴定，Ｄ为Ｃ的进一步研究提供必要条件。
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１１主要试剂重组人粒细胞一．巨噬细胞集落刺激因子（Ｇ —Ｓ）重组人白细胞介素一（ｌ一）自ｒＭＣＦ，ｈ４ｒＬ４购ｈ深圳晶美公司，鼠抗人Ｃ１单克隆抗体购自京中Ｄａ北山生物技术公司，小牛血清（Ｃ）自杭州四季青公ＦＳ购
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ＧＣＦＩ一导培养成Ｄ，Ｍ—Ｓ、Ｌ４诱Ｃ具有典型的树突状细胞的形态学特征及抗原呈递能力。关键词单核细胞树突细胞粒细胞巨噬细胞集落刺激因子白细胞介素４