绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用
绿色荧光蛋白在细胞成像中的应用
绿色荧光蛋白在细胞成像中的应用生物医学研究中，细胞成像的应用非常广泛。
而绿色荧光蛋白(GFP)因为可溶性、稳定性、表达方便等优点，已成为生物荧光成像研究中较为常见的标记基因。
下面我们从GFP的来源、结构、特点以及在细胞成像中的应用等几个方面来分析这一常用工具。
GFP的来源及结构GFP最初被从荧光海葵(Aequorea victoria)中发现，并被用于标记蛋白质的表达。
GFP经过多年的研究，现在已经应用于生物医学研究中的细胞成像、NGS等领域。
GFP分子由238个氨基酸组成，可以折叠成11个β转角和一个层状的环形。
其中β转角通过大量蛋白质交联形成β桶结构，环形结构中则存在一个由三个氨基酸组成的柔性环（5-8咪单元环），它能够在荧光染色分子进入柔性环的情况下，自发地形成苯环，同时改变自己的电子排布，从而发出强烈的绿色荧光信号。
GFP的特点与其他荧光染色物相比，GFP有以下几个特点：1. 可重复性：GFP的表达是稳定的，可以在不同的实验中使用。
2. 可控性：GFP标记可以通过表达载体进行控制，允许调整GFP的表达水平和特定部位的表达。
3. 可视性：GFP标记可直接被观察到，无需显微镜观察或临床检查，对于生物诊断和治疗研究具有很大的价值。
4. 可变化性：GFP有多种突变的形式，因此可以用于定量研究。
5. 无毒性：GFP标记物不会对健康产生影响。
GFP在细胞成像中的应用由于GFP的绿色荧光强度和GFP蛋白质的表达量之间的相对线性关系，因此GFP被广泛用于细胞成像的研究。
GFP也可以同时标记多个蛋白质，以便研究他们之间的交互作用。
在细胞成像中，GFP可以用来确定细胞形态、位置、运动和信号传导等特定事件。
例如，GFP透过标记膜蛋白的方法，可以标记出特定结构如细胞膜、线粒体、内质网、细胞核、胞板等等。
此外，GFP可以标记蛋白质酶、膜转运蛋白、核酸酶、激酶等多种细胞分子，具有非常丰富的变化形式，如分子翻译、效果、降解等等。
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白GFP的研究与应用摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。
通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。
关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用1 引言发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。
1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequoria victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。
1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白（即GFP）。
2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien)，他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。
2 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
GFP性质极其稳定，耐高温，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
更重要的是，它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。
绿色荧光蛋白——结构及应用
绿色荧光蛋白——结构及应用孙艺佩【摘要】绿色荧光蛋白(GFP)有稳定、灵敏度高、无毒害、载体便于构建等优点,因此在各个领域已经有了广泛的应用,在细胞生物学与分子生物学领域中,基因常被用作一个报导基因作为生物探针,拿来映证某些假设的实验方法;在医学领域,常用利用绿色荧光蛋白观测肿瘤发生、生长和转移等过程.本文就绿色荧光蛋白的发现与应用背景、结构、生色机理、相对于其他荧光分子的优点和在各领域的应用进行了综述.【期刊名称】《化工中间体》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】2页(P124-125)【关键词】绿色荧光蛋白(GFP);荧光生色机理;生色团;技术应用【作者】孙艺佩【作者单位】山东省实验中学山东 250000【正文语种】中文【中图分类】Q绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，1962年，下村修等人于维多利亚管状水母中第一次发现并提取出了绿色荧光蛋白。
1994年，马丁·查尔菲首次在实验中成功表达GFP基因，向人们展示了绿色荧光蛋白作为遗传标签的价值。
同年，钱永健与其同事提出GFP生色团发光机理并改造GFP，使其更易作为标记物应用于各类试验。
2008年，诺贝尔化学奖授予钱永健、马丁·查尔菲和下修村，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白。
这一发现成果为生命科学的进步提供了更便捷的渠道。
从维多利亚多管水母中分离出来的野生型GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。
它具有β-桶的结构，几乎是个直径2.4nm，长4.2nm的完美圆柱。
11个β-折叠链形成β-筒的外周，筒两端分别被一些分子量较小的短α-螺旋覆盖，组成生色团的三个残基（Ser65-Tyr66-Gly67）与α-螺旋共价相连，位于圆筒中央螺旋中部。
β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入,生色团被严格保护在筒内，因此其性质稳定，不易被淬灭。
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种从水母Aequorea victoria中分离出来的荧光蛋白质，可以发射绿色荧光。
由于GFP具有结构简单，对细胞无毒性和较强稳定性等特点，因此被广泛应用于细胞生物学和生命科学研究中。
以下是关于GFP及其在细胞生物学研究中的应用的介绍。
一、荧光蛋白及GFP的来源荧光蛋白质是一种含有环状芳香族氨基酸残基的蛋白质，能够吸收外部能量并将其转化为荧光发射。
GFP最初是在1955年，美国南加州大学的Osamu Shimomura研究水母发光机制时发现的。
GFP由238个氨基酸组成，分子量约27kDa。
GFP基因被克隆后即可在其他生物中表达，使它成为了生物体内最常用的荧光标记物之一。
二、GFP的结构和原理GFP的荧光由3个氨基酸残基Tyr（酪氨酸）、Ser（丝氨酸）和Gly（甘氨酸）构成的环状结构决定。
当氧气与Tyr形成共轭键时，便使荧光激发能量被吸收，并在GFP分子腔内缓慢扩散，直至荧光发射。
三、GFP在细胞生物学中的应用1、荧光定位GFP被广泛用于生命科学中细胞定位的研究。
由于GFP具有细胞膜透性和结构稳定性等特性，可以将其组装到生物体内，使其具有明亮的绿色荧光。
通过转化所需的基因序列来表达GFP，可以使研究人员直接在活细胞中观察到融合GFP蛋白质的定位和空间分布状况。
2、蛋白质交互作用GFP也被用作蛋白质交互作用的研究工具。
在这种情况下，GFP被连接到研究的蛋白质上，而研究人员观察到GFP与其他蛋白质结合的情况，从而确定蛋白质之间是否相互作用。
3、表达和异常行为GFP还可用于研究蛋白质的表达和异常行为。
通过表达GFP基因，可以探究研究对象的分泌情况、活动状态、质量控制和分解情况等。
4、细胞轨迹追踪GFP被广泛应用于细胞追踪研究中。
通过转染GFP基因，可以实时跟踪特定细胞类型的运动和位置，比如细胞分裂、游走和迁移等。
绿色荧光蛋白标记技术及其在基础临床研究中的应用
【 要 】 绿 色荧 光 蛋 白 （ ｒｅ ｌｏ ｅｃ ｎ ｒ ｔｉ ， Ｆ ） 为 一 个 监 测 完 整 细 胞 和 组织 内基 因表 达及 蛋 白定 位 的理 摘 ｇｅ ｎ ｆ ｒｓ ｅ ｔ ｏ ｅ Ｇ Ｐ 作 ｕ ｐ ｎ
想标记 物， 在受 到 紫 外 光 或蓝 光激 发 时可 高 效 发 射 清 晰 可 见 的 绿 光 ， 荧 光 性 质 稳 定 ， 其 它 标 记 物 相 比 ， 有 明 显 优 且 与 具 势 。 因而 广 泛 应 用 于 转 基 因 动 物 的 研究 、 合 标 记 、 因治 疗 、 白在 活 细 胞 内功 能 定 位 及 迁 移 变 化 、 原 菌侵 入 活 细 胞 融 基 蛋 病 的分 子 过 程 等 。Ｇ Ｐ作 为 新 一 代 的 基 因 转 移 报 告 物 和 ／ 定 位 标 记 物 ， 生命 科学 研究 中越 来越 受 到关 注 。 察 检 测 ， 细 胞 几 乎 无 伤 对
大 吸 收 峰 为 ３ ５ ｍ， 一 小 吸 收 峰 为 ４ ０ ｍ， 大 发 射 峰 为 ９ｎ 另 ７ｎ 最 ５ ９ ｍ， ５ ０ ｍ 处 有 一 肩 峰 。 由于 Ｇ Ｐ有 高 能 量 的 Ｂ态 和 ０ｎ 在 ４ｎ Ｆ
【 关键 词 】 绿 色荧 光蛋 白 基 础 与临 床 研 究
１ ９ 年 Ｐ ａｈ ｒ等¨ ９２ ｒｓｅ １ 隆 到 ＧＦ 的 ｃ Ａ， ９ ４ 年 克 Ｐ ＤＮ １９ Ｃ ａｆ 等 首 次 在 大肠 杆 菌 细 胞 中 表 达 了 能 发 射 绿 色 荧 光 的 ｈｌｅ ｉ 绿 色荧 光 蛋 白 ， 创 了 应 用 绿 色 荧 光 蛋 白 标 记 技 术 的 先 河 。 开 Ｇ Ｐ主 要 来 自两 种 海 洋 无 脊 椎 动 物 一 西 南 太 平 洋 水 母 （ ｅ Ｆ Ａ— ｑ ｏｅ ｉ ｏｉ） 佐 治 亚 沿 海 水 域 的 三 色 堇 （ ｅ ｉａ ｒｎｆ— ｕ ｒａ ｃ ｒ 和 ｖｔ ａ Ｒ ｎ ｌ ｅｉ ｌ ｏ ｍｉ Ｌ 。它 是 一 类 存 在 于 腔 肠 动 物 体 内 的 发 光 蛋 白 ， ｓ３ ） 当受 到 紫 外 光 或 蓝 光 激 发 时 ， 发 射 清 晰 可 见 的 绿 色 荧 光 ， 荧 光 性 质 能 且 稳 定 ， 种 属 限制 。其 次 ， Ｐ 的 检测 极 其 方 便 ， 它 与 目的 基 无 ＧＦ 将 因 连 接 后 ， 染 进 细 胞 ， 合荧 光 显 微 镜 、 式 细胞 仪 或 激 光 共 转 结 流
dfhbi 1t类绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种具有绿色荧光的蛋白质，广泛应用于生物学领域的标记和成像技术中。
绿色荧光蛋白的研究和应用已经成为生命科学领域中的热点和前沿课题。
在这篇文章中，我们将深入探讨绿色荧光蛋白的种类、结构、功能和应用。
1. 绿色荧光蛋白的种类绿色荧光蛋白是由Aequorea victoria（水母）发光器官中分离出来的一种蛋白质。
根据不同的来源和结构特点，绿色荧光蛋白可以分为多种类别，包括标准GFP、改良GFP、超变荧光蛋白和环状GFP等。
每种类型的绿色荧光蛋白都具有不同的荧光特性和适用范围。
2. 绿色荧光蛋白的结构绿色荧光蛋白的结构是其功能的基础。
它是一个由238个氨基酸组成的蛋白质，包括一个β桶结构和一个共轭双键序列。
在特定的条件下，它可以通过自发性氧化反应形成荧光色团，并发出绿色的荧光。
绿色荧光蛋白的结构和光学特性为其在生物标记和成像领域的应用奠定了基础。
3. 绿色荧光蛋白的功能作为一种生物标记物，绿色荧光蛋白的主要功能是在转基因生物中标记特定的细胞、器官或组织，以便于研究者对其进行观察和分析。
通过转基因技术，研究人员可以将绿色荧光蛋白基因导入到目标生物体中，从而实现对其活体成像和实时监测。
绿色荧光蛋白在蛋白质定位、蛋白质-蛋白质相互作用和基因表达调控等方面也发挥着重要作用。
4. 绿色荧光蛋白的应用绿色荧光蛋白的广泛应用领域包括但不限于以下几个方面：a. 细胞成像与实时监测：通过转基因技术将绿色荧光蛋白标记到感兴趣的细胞中，可以实现对其活体成像和实时监测，从而揭示生物体内细胞的运动、分化和凋亡等过程。
b. 蛋白质定位与跟踪：通过融合绿色荧光蛋白与感兴趣蛋白质，可以实现对蛋白质在生物体内的定位与跟踪，从而研究其功能和代谢途径。
c. 蛋白质-蛋白质相互作用研究：利用双融合蛋白技术或FRET技术，可以实现对蛋白质-蛋白质相互作用的实时观察和分析，为研究蛋白质分子机制提供了有力工具。
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白分子标记在环境微生物学研究中的应用摘要：荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。
近年来，来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。
其中绿色荧光蛋白(G reen fluorescent protein ，G F P ，来源于水母) 具有独特的应用价值。
G F P 及G F P 突变体在微生物降解污染物、生物膜菌群构架、环境生态学和环境检测生物传感器等研究领域取得了很好的应用效果。
关键词：绿色荧光蛋白，环境微生物，分子标记自然界中的许多生物都具有发光的能力，如细菌、真菌、萤火虫、深海鱼类和腔肠动物等。
它们的发光能力是由一类称为“荧光蛋白”的蛋白质赋予的。
G F P 标记系统是首次发现的不需要其他辅助条件的生物发光标记系统。
G F P 的激发光谱和发射光谱在活体和离体条件下完全相同，而虫荧光酶素的发射光谱在离体和活体条件下并不相同[1]。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用[1]2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。
天然的G F P 是一种多肽，由23 8 个氨基酸组成，分子量27 k u 。
能够将蓝光转化成绿色荧光[2-3]。
C orm ack 等用定点突变的技术将包围S er—T yr—G ly 生色团的2 0 个氨基酸进行突变，得到一系列吸收峰红移的突变体。
这些突变体相对于野生型蛋白具有更高的折叠效率，荧光强度增强3 0 ～100 倍，使G F P 的应用前景更加广阔[5]。
绿色荧光蛋白
GFP作为标记蛋白的优点
①荧光稳定 ②检测方便 ③无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制 ④GFP对受体细胞基本无毒害 ⑤易于构建载体，不受假阳性干扰 ⑥不需任何反应底物和辅助因子 ⑦可制成永久标本
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白的分子生物学 及其应用
绿色荧光蛋白的研究史
1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria) 中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。
维多利亚水母 (Aequorea Victoria)
A test tube containing a sample of a cyan (greenish-blue) fluorescent protein from a sea anemone illuminated by ultra-violet light from below.
பைடு நூலகம்
GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分 直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境 的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通 常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得 到了保护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或 丝氨酸）自发形成。
绿色荧光蛋白的研究史
1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了 GFP，开创了GFP应用研究的先河。
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绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用田 涛,王 琦3(中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100094)摘 要 荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。
近年来,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。
其中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP,来源于水母)具有独特的应用价值。
在活体研究中,GFP相对于其它报告蛋白(如β2半乳糖苷酶)在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。
对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。
关键词 绿色荧光蛋白;标记;微生物;表达中图分类号 Q93-31 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2005)01-0068-06The Application of G reen Fluorescent Protein(GFP)asMolecular Marker in MicrobiologyTIAN Tao,WAN G Qi(Coll.of A gron.&Biotech.Chi na A gric.U niv.Beiji ng100094)Abstract The application of fluorescent dyes in microbiology has been paid close extensive attention.Recently,flu2 orescent proteins originated from bioluminescent organisms have enriched research means in microbiology,among them green fluorescent protein(GFP)stemmed from jellyfish possesses unique application values.Study in vivo, GFP has many superiorities over other reported proteins,sayβ2galactosidase,in microbio2physiological and biochemi2 cal studies in situ and real time.In this paper,the applications of GFP as molecular marker in microbiology were re2 viewed,the applications of it on interactions between microbes and hosts,bio2membrane,biodegradation,interac2 tions between bacteria and protozoa,gene transfer,gene expression,protein location,as well as biosensors were also discussed.S ome observation and quantitative analysis methods applied on fluorescence were also briefly introduced. K eyw ords green fluorescent protein(GFP);marker;microbe;expression 自然界中的许多生物都具有发光的能力,如细菌、真菌、萤火虫、深海鱼类和腔肠动物等。
它们的发光能力是由一类称为“荧光蛋白”的蛋白质赋予的。
这些蛋白质由不同基因编码,不具有同源性,其发光机制在进化上也不相同。
GFP标记系统是首次发现的不需要其他辅助条件的生物发光标记系统。
GFP的激发光谱和发射光谱在活体和离体条件下完全相同,而虫荧光酶素的发射光谱在离体和活体条件下并不相同[1]。
天然的GFP是一种多肽,由238个氨基酸组成,分子量27ku。
能够将蓝光转化成绿色荧光[2,3]。
Inonye和Tsuji证实GFP的活性发色团是一个三肽,其成熟过程需要有氧的参与[4,5]。
野生型的GFP无论是在发光生物中,还是在提纯后的溶液中都具有395nm的最大吸收峰和510nm的最大发射峰[6]。
Cormack等用定点突变的技术将包围Ser2Tyr2G ly生色团的20个氨基酸进行突变,得到一系列吸收峰红移的突变体。
收稿日期:2004-03-20 作者简介:田涛 男,硕士。
现从事植病生防与植物微生态学方向研究工作。
3 通讯作者86微生物学杂志 2005年1月第25卷第1期 JOURNAL OF MICROBIOLO GY Jan.2004Vol.25No.1这些突变体相对于野生型蛋白具有更高的折叠效率,荧光强度增强30～100倍,使GFP的应用前景更加广阔[5]。
作为报告基因,gf p基因具有很多优良的特性:它表达出来的GFP折叠效率高,可以在多种生物体内表达;无论是直接表达还是以融合蛋白形式表达,GFP对宿主细胞或组织均无毒害作用;GFP的激发不消耗生物能量,不需要任何底物或辅因子;稳定性好,能耐受穿透、毒素、光漂白等不利因素,在甲醛固定、65℃处理0.5h以及p H值6～12范围内均十分稳定;用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计等仪器,可以对标记的目标微生物进行实时、原位的监测,或定量计算其荧光强度[7]。
上述特性使得GFP作为分子标记物在基因工程微生物(G enetically engineered microorgan2 isms,GEMs)中得到广泛的应用。
目前GEMs在有害生物综合治理、有毒化学物质及重金属污染修复、污水处理等领域发挥着重要的作用。
GEMs处理相对于化学或物理的处理更加经济有效,并且可以降低给环境带来的潜在的危害。
虽然如此,基于安全性考虑,GEMs进入自然环境后的命运引起研究人员的关注。
过去由于缺乏有效的手段区分GEMs和土著微生物,有关GEMs在自然环境中的存活与扩展并不清楚。
近来分子生物学的发展为我们带来全新的技术手段去区分、检测、计量接种到含有大量土著菌的自然环境中的GEMs。
例如基因探针、分子杂交、PCR、报告基因等。
这些分子生物学的方法有助于我们监测有特定表型或序列的GEMs。
其中gf p基因以其特有的性质引起研究人员的更多兴趣。
现已建立起来一套成熟的gf p基因标记系统[8]。
本文回顾了GFP作为分子标记物应用于微生物学研究的进展。
1 GFP在微生物与宿主相互作用研究中的应用早期的研究者用荧光抗体检测宿主中的微生物,后来发明了用荧光染料直接包被微生物以研究其在活体细胞中的作用方式。
由于这些方法严重影响微生物的生理功能,而且在细菌裂殖的过程中荧光信号会不断的减弱,所以很难实现对微生物的长期跟踪[9]。
GFP标记系统和荧光显微镜的出现,使研究者能够对微生物和宿主相互作用进行长期的监测。
Raphael等在1995年构建了两套gf p基因表达系统,分别在鼠伤寒杆菌和海分枝杆菌中高效表达GFP,并结合使用落射式荧光显微镜对病菌侵染其哺乳动物宿主吞噬细胞的过程进行实时追踪。
实验表明,GFP的表达没有对细菌的存活造成不利影响,也没有降低其侵染能力及在吞噬细胞中的存活能力[10]。
G age等借助穿梭载体p TB93F在苜蓿根瘤菌里组成型表达gf p基因,并观察到根瘤菌侵染根系及根瘤形成的全过程[11]。
Epel等将gf p基因与烟草花叶病毒运动蛋白基因在烟草花叶病毒中融合表达,观察到病毒运动蛋白与宿主细胞肌动蛋白的结合,通过植物的亚细胞结构-胞间连丝完成细胞间的侵染循环。
表明是病毒与植物组分间的相互作用促进了病毒在植物体内的局部传播[12]。
1997年,Tombolin等用自杀质粒将吸收峰红移的突变gf p基因整合到荧光假单胞菌的染色体上。
由于使用了强启动子(PpsbA)和荧光增强型gf p基因,其表达宿主的荧光更强也更稳定,他们利用激光共聚焦扫描显微镜在忘忧树根的表皮观察到单个的标记细胞[13]。
Qazi等(2000)把从枯草芽孢杆菌中克隆到的核糖体识别位点、木聚糖启动子(PxylA)与gf p基因连接,在革兰氏阳性菌中(李斯特单核增生菌、金黄葡萄杆菌、枯草芽孢杆菌等)成功表达出GFP,并对李斯特单核增生菌侵染哺乳细胞的全过程进行跟踪[14]。
近年来,我国科研人员也成功地用gf p基因标记对固氮菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌进行研究[15,16]。
本实验室成功地用gf p 基因标记蜡质芽孢杆菌A247等,并对其与宿主间的相互作用进行研究。
由于天然的GFP不易被细胞内的蛋白酶系统降解,所以在使用GFP标记系统研究基因的瞬时表达方面受到限制。
K eiler等证明:蛋白质C 末端特定的寡肽延伸使一些稳定的蛋白质容易被细胞内原有的蛋白酶系统降解[17]。
Qazi等把不同的寡肽连接到GFP的C末端,构建出一系列半衰期的短GFP突变体。
其半衰期从60min到300min不等。
为研究微生物与宿主间的蛋白质961期 田涛等:绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用 相互作用提供了有力的工具[14]。
2 GFP在研究开放环境中微生物的应用 近年来,研究人员已经构建出多种GFP表达系统,用于在开放环境中微生物的研究。
1996年,Burlge等用Tn5转座子将gf p基因插入恶臭假单胞菌的染色体,以研究细菌的迁移规律。
实验证明,可以成功地利用荧光分光光度计精确地检测细菌的迁移率。
Eberl等(1997)用gf p基因标记恶臭假单胞菌以研究其在活性污泥中的存活。
在接种后,很快就观察到在活性污泥絮状物间自由游动的接种菌。
2min后观察到原生动物捕食标记的细菌。
但是3d后,虽然在絮凝物中有大量的微生物,但是在絮凝物之外却几乎观察不到标记的细菌。
这表明絮凝物起到保护细菌不被原生动物捕食的作用[18]。
Olofsson等结合使用落射荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜,研究gf p基因标记的大肠杆菌和粘质沙雷氏菌在活性污泥中的定殖。
研究发现,菌体表面的疏水性物质是决定其在絮凝物上粘附能力的关键因子;三维的图像显示,2种菌在絮凝物上的附着模式完全不同;细菌可以通过孔洞穿过絮凝物。
他们的研究揭示了细菌在活性污泥中的附着机制,有助于提高污水处理的效率[19]。
1999年Unge 等使用gf p2l ux双标记系统对标记菌的代谢活性和荧光强度同时进行原位检测,展示了双标记系统在环境样本原位检测中的应用前景[20]。