绿色荧光蛋白gfp标记方法

System
一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验 2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作 3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波加热 至透明倒 入制胶板中 b.2 μl质粒+2 μl单染料滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察 结果，并记录
三.电击转化及荧光观察
1.用250μlPEB洗涤液冲洗最后一次离心的菌体，分别分装到50μl的
离心管中
2.取50μl感受态细胞+1μl质粒（梯度分别为1μl，2.5μl，5μl）置于电 转杯上，用枪头轻轻吹吸，冰上冷却 3.电转仪电击 4.立即用LB培养液活化（1ml），转移到离心管中，震荡培养 1h(120r,37℃) 5.取转化后的菌液，分别取10 ，50， 100μl菌液涂布于含有 100μg/ml壮观霉素的LB固体培养基上，30℃培养 6.取相关切片在荧光显微镜下观察是否标记上。
二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600 2.收集生长中期的培养物于冰水浴中放置20 min 后，用PEB洗涤液冲洗细胞4 次 。具体过程： 用50ml PEB洗涤液冲洗离心过的菌体，轻轻混 匀，然后放于离心机（8000r,5min）离心，重 复四次。这些过程都需要随时放在冰盒上，保 持冷却。
纤维素降解菌X-3的GFP标记
试验路线
gfp质粒的提取
X-3感受态细胞的制备
gfp质粒+X-3感受态细胞 电击转化 X-3-gfp标记菌
Байду номын сангаас
经过传代培养验证其稳定性，同时检测其 相关理化特性（ph，温度，含氧量，转 速等）是否受到影响，确定gfp标记的细 菌可以用于进一步研究
GFP标记
油镜观察
菌落观察
本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4 3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA