western blot条带分析

近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。

特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。

其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。

限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。

Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。

我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。

再无，则压过夜。

共3张片，根据每次结果调整。

其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。

这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。

然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。

取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。

在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。

荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。

现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因- - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物*注6高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足- - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长- - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高- - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) -- -- 精细操作*注13 --- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带- - --- - ---使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑- - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。

如果没有背景则就是原因3的现象。

在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。

如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。

也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。

还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。

其分析和解决同上。

*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。

如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。

如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。

但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。

但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。

原因1和3若如是则解决也是一样的。

*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。

主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。

可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。

除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。

也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。

这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。

*注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。

关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。

(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章)，超过此量可能会导致条带变形。

条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。

但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限,而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。

所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。

比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了）*注5 对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。

但对于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。

对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。

*注6 测试HRP或底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各500ul，加入1ul HRP偶联二抗，若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好。

此外试剂公司还开发一些超级底物，其敏感度可达到pg级，但价格昂贵，对某些表达较低的蛋白效果会好些，而且也超级省抗体（其推荐抗体稀释比高达1:10,000以上）。

我用的是敏感度为ng级的底物，大部分western都还可以，pg级的还放在手里，没舍得用。

*注7 高背景原因是因为HRP偶联二抗结合到膜上，其原因包过直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗（主要指多抗中的杂抗体）间接结合、通过封闭物（与封闭物交叉反应）间接结合、洗脱不彻底等原因造成的。

在稀释抗体降低背景的同时也会降低对目的蛋白的结合效率，意即以牺牲信号强度为代价。

不过在此提出另外一种和稀释抗体恰相反的做法——提高抗体浓度。