基因MDR1高表达多药耐药肿瘤细胞对力达霉素的药物敏感性

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药学学报 -*WL 9QL31L*5UWO*L XOAO*L ’""H ， F! （ !’ ） ： !!FH E !!#!
基因 !"#$ 高表达多药耐药肿瘤细胞对力达霉素的药物敏感性
师以康，吴淑英，黄云虹，甄永苏 !
（ 中国医学科学院、 中国协和医科大学 医药生物技术研究所，北京 !"""#" ） 摘要：目的$ 利用经药物诱导获得的 !"#$ 基因高表达细胞株以及通过 !"#$ 基因转染建立的稳定高表达细胞 株， 研究多药耐药肿瘤细胞对力达霉素 （ %&!"’( ） 的药物敏感性。方法 $ 构建 !"#$ 重组真核表达质粒 )*+,-./ ! 0 利用脂质体转染技术， 获得 !"#$ 高表达 45)6’ 肝癌细胞。经 78&9%7、 细胞荧光免疫化学及罗丹明外排实验， 123! ， 鉴定了细胞的 !"#$ 表达水平和药物外排活性。:88 方法测定敏感细胞及相对应的多药耐药细胞对力达霉素等多 种抗肿瘤药物的药物敏感性。结果$ !"#$ 稳定转染细胞株 45)6’ 0 123! 、 多药耐药 ;<=’"" 细胞和 :%>&( 0 -+7 细胞 （ "/ "’" @ "/ "!! ）A1BC ・ D E ! ， （ "/ ’F @ "/ ’" ）A1BC ・ D E ! 和 （ "/ "’G @ "/ "!! ）A1BC ・ D E ! 。 对力达霉素的 ?%#" 值分别为 相对于各自的敏感细胞， 多药耐药细胞 45)6’ 0 123! ， ;<=’"" 和 :%>&( 0 -+7 对力达霉素的抗药倍数分别是 !/ . ， H/ G 和 !/ H 倍， 对阿霉素的抗药倍数分别是 G/ G ， .(/ ’ 和 !G!/ . 倍， 对紫杉醇的抗药倍数分别是 F"/ . ，..H/ G 和 FI/ ’ 倍。 未表现出抗药性。 结论 !"#$ 高表达的多药耐药肿瘤细胞对力达霉素仍高度敏感， 关键词：多药耐药性；力达霉素；!"#$ 基因；9&糖蛋白 中图分类号：7IH.$ $ $ 文献标识码：-$ $ $ 文章编号： "#!. E FG(" （ ’""H ） !’ E !!FH E "H
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以及人口腔鳞癌 DE 细胞和 DEF;:: 细胞均由本实 验室保存。细胞于 W< \ ， Q] 9T; 条件下在含 7:] 小牛血清的高糖 0/I/ 培养液中培养传代。 重组真核表达质粒 !"#$%&’ ( ) *+,( 的构建、 酶切鉴定及基因序列测定 ! 根据 J1KL6$ 试剂盒说 明书从多药耐药乳腺癌 /9B3< C >01 细胞中提取总 1=>， 再根据 1J3291 一步法试剂盒操作步骤获得 !"#$ 基因的全长 .0=> 片段。分别以 !"#$ 基因的 Q^端和 W^端基因序列为引物， 并且在引物 Q^ 端分别 加入 =V* K 和 _V6 K 酶切位点。上游引物为 Q^3H9J >H9 >JH H>J 9JJ H>> HHH H>93W^， 下游引物为 Q^39J9 H>H J9> 9JH H9H 9JJ JHJ J3W^。把 1J3 291 产物上 样 于 ;] 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳， 切取 !"#$ 基因对应的条带， 用玻璃奶回收试剂盒提取获 得 !"#$ .0=>；同时，用 限 制 性 内 切 酶 =V* K 和 _V6 K 双酶切质粒 4.0=>W[ 7 ， 电泳， 玻璃奶回收酶 切后的线性 4.0=>W[ 7 ， 最后在室温用 JA 0=> 连接 酶把 !"#$ 基因和酶切后的 4.0=>W[ 7 连接成重组 质粒 4.0=>W[ 7 C "’(7 。把该重组质粒转化到感受 态的 %& ’()* 0GQ ! 大肠杆菌中，在 8E 琼脂平皿中 W< \ 培养过夜， 挑取单克隆于 8E 液 7[ Q "8 中摇菌 过夜， 提取质粒， 酶切鉴定。对酶切鉴定阳性的克隆 进行基因测序分析。 !"#$ 基因高表达人肝癌 -.!/0 稳定转染细胞 株 -.!/0 ) *+,( 的获得与鉴定 ! 经基因测序 !"#$ 基因序列完全正确的重组真核表达质粒 4.0=>W[ 7 C "’(7 用转染级别的质粒提取试剂盒提取后， 按照脂 质体 8&46P*.%,"&-* ;::: 转染操作说明书把该质粒 转染到 !"#$ 低表达的人肝癌 G*4H; 细胞，用7 :::
67&).45)：6($$ 8B OA=5SWO[LW5 WQ5 *Q51BS5ASOWO=OWR WB CO2L1R*OA（ %&!"’( ）OA !"#$ [5A5 B=535M& )35SSOA[ *LA*53 *5CC COA5S 5SWLVCOSQ52 VR 23U[ OA2U*WOBA LA2 VR [5A5&W3LAS^5*WOBAJ 8#)"%1& $ +,- _LS *CBA52 VR 78&9%7 LA2 WQ5A 5UZL3RBWO* 5M)35SSOA[ 35*B1VOALAW )CLS1O2 )*+,-./ ! 0 123! _LS *BASW3U*W52J ]SOA[ DO)B^5*WL1OA5 ’""" ，L SW3LOA B^ SWLVCR W3LAS^5*W52 QU1LA Q5)LWB1L *LA*53 *5CCS，45)6’ 0 123! ，_LS BVWLOA52J 8Q5 !"#$ 17,- C5=5C，9&[CR*B)3BW5OA（ 9&[)）C5=5C LA2 WQ5 L*WO=OWR B^ 9&[) WB 5MW3U25 23U[S OA *LA*53 *5CCS _535 25W531OA52 VR 78&9%7，O11UAB^CUB35S*5A*5 LALCRSOS LA2 3QB2L1OA5 !’. 5^^CUM LSSLRJ 8Q5 *Q51BS5ASOWO=OWR B^ *LA*53 *5CCS _OWQ CB_ B3 QO[Q !"#$ 5M)35SSOBA WB CO2L1R*OA LA2 BWQ53 LAWOWU1B3 23U[S _LS W5SW52 VR :88 LSSLRJ 9#&23)& $ 8Q5 !"#$ 17,- LA2 9&[) C5=5CS OA ;<=’"" ，:%>&( 0 -+7， LA2 SWLVCR W3LAS^5*W52 45)6’ 0 123! *5CCS _535 1U*Q QO[Q53 WQLA WQLW OA 35S)5*WO=5 )L35AW ;< ，:%>&( LA2 45)6’ *5CCSJ 8Q5 ?%#" =LCU5S B^ CO2L1R*OA ^B3 ;<=’"" ， :%>&( 0 -+7 LA2 45)6’ 0 123! *5CCS _535 （ "/ ’F @ "/ ’" ） A1BC ・ D E ! ， （ "/ "’G @ "/ "!! ） A1BC ・ D E ! ， LA2 （ "/ "’" @ "/ "!! ） A1BC ・ D E ! ， 35S)5*WO=5CRJ %B1)L352 _OWQ )L35AWLC *5CCS，WQ5 =LCU5S B^ 35SOSWLAW ^BC2 ^B3 ;<=’"" ，:%>&( 0 -+7 LA2 45)6’ 0 123! *5CCS WB CO2L1R*OA _535 H/ G ，!/ H LA2 !/ . ^BC2；WB L23OL1R*OA _535 .(/ ’ ，!G!/ . LA2 G/ G ^BC2；WB WLMBC _535 ..H/ G ，FI/ ’ LA2 F"/ . ^BC2，35S)5*WO=5CRJ !%’532&(%’$ DO2L1R*OA OS QO[QCR L*WO=5 WB 1UCWO23U[ 35SOSWLAW *LA*53 *5CCSJ 8Q5 *Q51BS5ASOWO=OWR B^ WQBS5 35SOSWLAW *LA*53 *5CCS WB CO2L1R*OA OS L))3BMO1LW5CR LW WQ5 SO1OCL3 C5=5C LS WQLW B^ )L35AW *LA*53 *5CCSJ :#+ ;%.1&：1UCWO)C5 23U[ 35SOSWLA*5；CO2L1R*OA；!"#$ [5A5；9&[CR*B)3BW5OA
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。本研究利用经药物诱导
获得的多药耐药乳腺癌 /9B3< C >01 细胞、 人口腔 鳞癌 DEF;:: 细胞以及通过构建 !"#$ 重组真核表 达质粒、 获得 !"#$ 高表达的稳定转染肝癌细胞株 G*4H; C "’(7 ， 探讨 80/ 对 !"#$ 高表达的多药耐药 肿瘤细胞的生长抑制作用， 为 80/ 的临床应用及其 分子作用机制研究提供依据。
师以康等： 基因 !"#$ 高表达多药耐药肿瘤细胞对力达霉素的药物敏感性 ! ! 肿瘤细胞多药耐药 （ "#$%&’(#) (*+&+%,-.*， /01 ） 是影响肿瘤化疗效果的重要因素之一， 而肿瘤细胞 （ 23)$5.64(6%*&- ） 多药耐药基因 !"#$ 编码的蛋白 23)4