植酸酶基因PhyB1的克隆及序列分析

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一种新植酸酶基因的克隆及其新型表达载体的构建(精)

一种新植酸酶基因的克隆及其新型表达载体的构建范守城1,2 霍丹群1 张云茹1 侯长军1（1重庆大学生物工程学院，国家教育部生物力学与组织工程重点实验室重庆,400044）(2重庆市养猪科学研究院重庆市重点实验室 4002460)摘要：目的：利用PCR 法从本实验室自行筛选、鉴定的一株黑曲霉菌株（F246）直接扩增植酸酶基因phy A,再将PCR产物重组于大肠杆菌表达载体pET30 a+和乳酸菌/大肠杆菌穿梭表达载体pMG36e ，构建工程菌JM109-pET30a +-phy A 和JM109-pMG36e-phy A 。

方法：直接以黑曲霉菌株（F246）基因组为模板，进行PCR 扩增植酸酶基因（phy A ）的成熟肽（分子量为1 347bp ），再将PCR 产物克隆入ｐMD18T 质粒，经DNA 测序鉴定正确后，亚克隆入表达载体pET30 a+和pMG36e ，构建phyA 基因两种新型表达载体。

国内目前还没有用pET30a+和pMG36e 表达植酸酶研究的报道。

结论：植酸酶phy A 基因两种新型表达载体的构建，为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下基础。

关键词：植酸酶克隆表达载体乳酸菌[中图分类号] Ｑ94 [文献标识码] ＡThe cloning of a phytase gene and the forming of two new types of theexpression vectorFan Shoucheng 1,2 Huo Danqun 1 Zhang Yunru 1 Hou Changjun 1（1College of Bioengineering , Key Laboratory for Biomechanics & Tissue Engineering of the State Ministry of Education,Chongqing University Chongqing,400044）(2Chongqing Pig Breeding Science Research Institute Fan Shoucheng,Chongqing,402460)Abstract: Aim: This research amplified the phytase gene of Aspergillus niger F246 by the polymerase chain reaction(PCR),Which is selected and identified by us in our laboratory.Then the product of PCR combined respectively with the expression vector pET30 a+ and pMG36e to construct the engineering stain of JM109-pET30a +-phyA and JM109-pMG36e-phyA.Method: The gene of the F246 strain was the template for PCR,And the amplified fragmnt was subcloned into p MD18T .After sequncing the coding region for 1506 bp and the amature peptide of 448 aminoacid .,the product of PCR was cutted from p MD18T and subcloned into pET30a+ and pMG36e for two types ofexpression vector .Now,no article about the phyA gene with the vector of pET30a+ and pMG36e were reported .Resuilt: The construction of new expression vector for the phyA gene is the base of the study on obtaining large and high active phytase and developing the new Microbial ecologicalagent.Supported by Fan ShouchengCorresponding author: Huo Danqun Tel:139******** E-mail:houcj@ Key words: phytase cloning expression vector lacotobacillus 植酸酶（Phytase ）是催化植酸及其盐类物质水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称。

植酸酶基因phyA的克隆及在毕赤酵母中的高效表达的开题报告

植酸酶基因phyA的克隆及在毕赤酵母中的高效表达的开题报告摘要：植酸酶（phytase）是一种可降解植物中磷酸盐形式的酶，对提高畜禽饲料的磷利用效率具有重要作用。

本研究以几种源自不同植物的植酸酶序列作为参考，设计出特异性引物并进行PCR扩增，成功克隆了一段来自小麦中的phyA基因序列。

随后将该基因序列与毕赤酵母表达载体进行连接，并利用基因工程技术将其表达于毕赤酵母中，经过优化后获得了高效的表达结果。

本研究的结果为进一步研究phyA基因的功能及其在工业上的应用奠定了基础。

关键词：植酸酶；phyA基因；PCR扩增；毕赤酵母；表达。

1. 研究背景植酸酶是一种能将植物中的植酸磷酸化合物水解成可被动物利用的无机磷化合物的酶。

在畜禽饲料中添加植酸酶可以提高饲料磷的利用率，减少磷污染对环境的影响，也减轻了饲料制造成本。

因此，植酸酶在畜禽饲料工业中具有广泛的应用前景。

phyA基因编码植酸酶，目前已在多种植物和微生物中被克隆和表达。

但是，要获得高效的植酸酶生产菌株，必须对phyA基因进行进一步研究。

因此，本研究旨在克隆phyA基因，并将其表达于毕赤酵母中，为进一步研究植酸酶的功能和工业应用提供基础。

2. 研究方法2.1. 引物的设计以已公布的几种植酸酶基因序列为参考，利用生物信息学工具设计了一对特异性引物。

引物的序列为：5'ATG CTG TGT TCA CGT GGC3'（向前引物）和5'CGA GAA TCG ACG AGA ATC TGC3'（向后引物）。

2.2. PCR扩增以小麦DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环。

2.3. 克隆和序列分析将PCR产物分离、纯化、连接到pGEM-T Easy载体上，转化到E. coli JM109中筛选正常克隆。

使用ABI 3730 DNA序列分析仪对克隆物进行测序，并用DNAstar软件进行序列分析。

四个肠杆菌植酸酶基因的克隆、表达及性质研究

四个肠杆菌植酸酶基因的克隆、表达及性质研究植酸酶（肌醇六磷酸酶）是能够将植酸分解为肌醇和无机磷的一类酶的总称，在饲料工业上的应用可以提高单胃动物对饲料中磷的利用率，降低植酸磷对环境的污染，并降低饲料成本。

此外植酸酶还可应用于医药、食品工业。

微生物是植酸酶的主要来源，从微生物中筛选新的、性质优良酶蛋白是植酸酶研究的一个重要方向。

本研究根据HAP类植酸酶的保守序列设计简并引物，从肠杆菌科微生物Hafnia alvei B125、Dickeya dadantii B187、Dickeyaparadisiaca B188菌中扩增出植酸酶基因片段，利用TAIL-PCR的方法得到了这三个基因的完整序列，分别命名为B125appA，B187appA，B188appA。

此外根据鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）全基因组测序结果设计引物，通过PCR克隆得到另外一个植酸酶基因Y1appA。

克隆的四个植酸酶基因之间的核苷酸一致性最高为75％（B187appA与B188appA），最低为48％（B188appA与B125appA，B188appA与Y1appA）。

通过序列比对分析，B125appA编码蛋白与变形肥杆菌（Obesumbacterium proteus）来源的植酸酶氨基酸序列一致性为95％，虽然二者一致性较高，但它们在最适温度和热稳定性方面有较大的差异。

B187appA和B188appA编码蛋白与软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）中一个假定的磷酸酶蛋白氨基酸序列一致性分别达到53％和52％，与肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）来源的植酸酶氨基酸序列一致性分别为50％和49％。

说明克隆得到的B187appA，B188appA为两个新的植酸酶基因。

Y1appA编码蛋白与中间型耶尔森氏菌（Yersinia intermedia）来源的植酸酶氨基酸序列一致性为81％，二者在性质上有所差异。

植酸酶phy A基因克隆表达研究

植酸酶ｐｈｙＡ基因克隆表达研究摘要通过PCR从黑曲霉（Aspergillus niger）WY49基因组中扩增出植酸酶phy A基因，将其转入毕赤酵母GS-115中，整合到酵母染色体上进行诱导表达，并对表达条件进行了优化。

利用蛋白质分离纯化技术纯化重组酶并进行SDS-PAGE，结果表明，蛋白质分子量约为61kDa。

植酸酶基因表达产物的理论值为50kDa，说明该植酸酶在酵母中有一定程度的糖基化。

最后测定了表达产物的酶学性质，结果表明，表达产物的最适pH值为5.5，最适温度为55℃，且具有良好的pH值稳定性和热稳定性。

关键词黑曲霉；植酸酶；毕赤酵母GS-115植酸（Phytic Acid or Inositol Hexakis-phosphate）是维生素B族的一种肌醇六磷酸，植酸及其盐类广泛存在于植物组织和粮食产品中，占其总量的3％左右，其中磷含量占植物总磷的70％～90％。

但是植酸形式的磷不能被单胃动物所消化利用，而且抑制多种营养成分的吸收和利用。

植酸酶可以分解植酸，变为可以吸收利用的磷元素。

但由于天然植酸酶菌株产酶水平较低，不能满足商业化需求，一般是用天然菌株采用基因工程技术手段进行改造获得基因工程菌，提高酶产量。

王红宁[1]等提取出了黑曲霉N25的基因组DNA，采用聚合酶Advangage?蛳HF扩增到去除信号肽的内含子后约1.4kb 片段，构建pPIC9k?蛳phyA载体，经G418抗性筛选获得了高效表达的转化子并具有良好的遗传性。

贝锦龙等[2]将人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶酶基因导入毕赤酵母表达系统，成功表达了植酸酶。

2003年，熊爱生等[3]将化学合成的植酸酶基因连接在含有不同分泌信号序列表达载体上，导入Pichia pastoris中，研究了不同的信号序列对Pichia pastoris表达外源植酸酶的影响。

本试验克隆了黑曲霉WY49的植酸酶基因，并研究其在毕赤酵母GS?蛳115中的表达，纯化重组酶并研究其性质，以期获得有商业生产能力的基因工程植酸酶。

微生物植酸酶的克隆及表达[发明专利]

专利名称：微生物植酸酶的克隆及表达
专利类型：发明专利
发明人：罗伯特·F·M·V·哥修穆,威廉·V·哈里金思德,皮特勒斯·A·V·帕里顿,阿尼玛里·E·伏恩思塔,鲁道夫·G·M·尤坦,
吉拉多斯·C·M·西尔坦
申请号：CN90108977.X
申请日：19900927
公开号：CN1051058A
公开日：
19910501
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：对一种编码植酸酶的核苷酸序列进行了分离和克隆。

将编码序列插入表达体中，后者又被插入到能转化微生物表达寄主的载体中。

转化的微生物寄主可以用于工业规模经济地生产植酸酶。

通过本发明生产的植酸酶可以用于多种需要将植酸盐转化成肌醇和无机磷酸盐的方法中。

申请人：吉斯特·布罗卡德斯股份有限公司
地址：荷兰德夫特
国籍：NL
代理机构：中国国际贸易促进委员会专利代理部
代理人：李英
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耐热植酸酶及其基因的克隆和表达[发明专利]

专利名称：耐热植酸酶及其基因的克隆和表达专利类型：发明专利
发明人：刘丽丽,陈立新,杨文博
申请号：CN03129985.7
申请日：20030603
公开号：CN1552872A
公开日：
20041208
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种耐热植酸酶及其基因的克隆和表达。

解决了现有植酸酶耐温性较差及营养无利用流失和必须营养的“添加浪费”等问题。

技术方案：筛选耐热性植酸酶天然菌株，利用分子生物学的手段，将编码此产物的基因进行基因克隆；该基因全长1152核苷酸，编码383个氨基酸；N 端的26个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+26位的丙氨酸之后；构建耐热植酸酶基因的工程菌株SDLiuTP01，表达基因产物。

本发明的耐热植酸酶在较宽温度范围内具有生物活性、能促进植物生长、增加土壤肥力、不破坏农作物品质；降解食品和饲料中的不溶性磷、提高磷的利用、减少有机磷对环境的污染。

申请人：天津师范大学,天津市农业生物技术研究中心
地址：300222 天津市卫津路241号
国籍：CN
代理机构：天津市学苑有限责任专利代理事务所
代理人：李宏伟
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曲霉来源植酸酶基因phyA的克隆及原核表达

曲霉来源植酸酶基因phyA的克隆及原核表达刘开泉;李玲;郭峰【摘要】The supplementation of phytase in animal feed can increase the bioavailability of phosphorus and mineral elements in monogastric animals and reduce the phosphorus pollution to environment. Therefore, phytase has an extensive application in the feedstuff industry. In this article, an A. Niger strain producing ex-tracellular phytase was isolated and the phyA gene was cloned. The gene was inserted into prokaryotic expres-sional vector pET21b and pET30a, and then the recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli strain BL21 (DE3) by heat shock. A large amount of phytase protein could be obtained via induction of the engineering strains.%在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,具有广泛的应用前景.本试验以自行分离得到的黑曲霉菌株基因组DNA为模板,克隆得到植酸酶phyA基因,并将其连接到原核表达载体pET21b、pET30a上,利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21 (DF3)中,构建植酸酶大肠杆菌工程菌株.工程菌株在经诱导后可以产生大量的植酸酶蛋白.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2012(044)002【总页数】5页(P5-8,14)【关键词】植酸酶;克隆;原核表达【作者】刘开泉;李玲;郭峰【作者单位】山东农业大学生命科学学院,山东泰安271018;山东农业大学生命科学学院,山东泰安271018;山东省农业科学院高新技术研究中心,山东济南250100;山东省农业科学院高新技术研究中心,山东济南250100【正文语种】中文【中图分类】Q785植酸酶即肌醇六磷酸水解酶，是能将植酸及其盐类降解为肌醇和磷酸(或磷酸盐)的一类酶的统称。

玉米PHYB1 基因的克隆、改造及其在拟南芥中的功能分析

生物技术进展２０１９年㊀第９卷㊀第４期㊀３５０~３５６ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０１９￣０４￣１０ꎻ接受日期:２０１９￣０４￣２６㊀基金项目:国家自然科学基金项目(３１５００２３９ꎻ３１６０１３１９)资助ꎮ㊀作者简介:马晓净ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为植物分子生物学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｍａｘｉａｏｊｉｎｇｓｈｅｎｇｗｕ＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:王海洋ꎬ教授ꎬ主要从事玉米高产耐密遗传基础和分子机理解析㊁玉米耐密理想株型分子设计等研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｗｈｙａｎｇ＠ｓｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ玉米ＰＨＹＢ１基因的克隆㊁改造及其在拟南芥中的功能分析马晓净１ꎬ２ꎬ㊀赵斌斌１ꎬ２ꎬ㊀刘㊀扬１ꎬ㊀马梦迪１ꎬ㊀王海洋３∗１.中国农业科学院生物技术研究所ꎬ北京１０００８１ꎻ２.中国农业科学院研究生院ꎬ北京１０００８１ꎻ３.华南农业大学生命科学学院ꎬ亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室ꎬ广州５１０６４２摘㊀要:光是一个重要的环境因子ꎬ影响植物生长发育的诸多方面ꎮ植物通过多种光受体感受环境中的光信号ꎬ其中以红光与远红光受体光敏色素的研究最为透彻ꎮ研究表明ꎬ将拟南芥ｐｈｙＢ的１０４位点与３６１位点的酪氨酸(Ｙ)残基改造为苯丙氨酸(Ｆ)残基可增强其活性ꎮ为了研究玉米光敏色素Ｂ１(ＰＨＹＢ１)的功能ꎬ构建了玉米光敏色素Ｂ１基因的３种重组质粒:ｐＺｍＰＨＹＢ１ɨＺｍＰＨＹＢ１ＷＴ㊁ｐＺｍＰＨＹＢ１ɨＺｍＰＨＹＢ１Ｙ９８Ｆ(对应拟南芥Ｙ１０４Ｆ突变)和ｐＺｍＰＨＹＢ１ɨＺｍＰＨＹＢ１Ｙ３５９Ｆ(对应拟南芥Ｙ３６１Ｆ突变)ꎬ并将其转入拟南芥ｐｈｙＢ￣９突变体中ꎬ然后对转基因株系进行表型分析ꎮ结果表明ꎬＺｍＰＨＹＢ１可抑制ｐｈｙＢ￣９突变体下胚轴及叶柄的伸长ꎻＺｍＰＨＹＢ１可与拟南芥ＡｔＰＩＦ５互作并诱导下游避荫反应响应基因和生长素合成基因的表达ꎻＹ９８Ｆ和Ｙ３５９Ｆ氨基酸的替换可增强ＺｍＰＨＹＢ１的活性ꎮ研究结果表明ＺｍＰＨＹＢ１在拟南芥中具有介导避荫反应的作用ꎬ同时也将为玉米耐密株型改良提供参考ꎮ关键词:ＺｍＰＨＹＢ１ꎻ下胚轴ꎻ避荫反应ꎻ光敏色素互作因子(ＰＩＦｓ)ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０１９.００３９ＣｌｏｎｉｎｇꎬＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＭａｉｚｅＰＨＹＢ１ｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ㊀ＭＡＸｉａｏｊｉｎｇ１ꎬ２ꎬＺＨＡＯＢｉｎｂｉｎ１ꎬ２ꎬＬＩＵＹａｎｇ１ꎬＭＡＭｅｎｇｄｉ１ꎬＷＡＮＧＨａｉｙａｎｇ３∗１.ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｏ￣ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓꎬＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＧｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４２ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒꎬｌｉｇｈｔａｆｆｅｃｔｓｍａｎｙａｓｐｅｃｔｓｏｆｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｐｌａｎｔｓｕｓｅｓｅｖｅｒａｌｃｌａｓｓｅｓｏｆｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｔｏｐｅｒｃｅｉｖｅｔｈｅｌｉｇｈｔｓｉｇｎａｌｓｉｎｔｈｅａｍｂｉｅｎｔｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ.Ａｍｏｎｇｔｈｅｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓꎬｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓꎬｗｈｉｃｈｓｅｎｓｅｒｅｄａｎｄｆａｒ￣ｒｅｄｌｉｇｈｔｓｉｇｎａｌｓꎬａｒｅｂｅｓｔｓｔｕｄｉｅｄｓｏｆａｒ.Ｐｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｎｔｈａｔｃｈａｎｇｉｎｇｔｈｅｔｙｒｏｓｉｎｅ(Ｙ)ａｔｐｏｓｉｔｉｏｎ１０４ａｎｄ３６１ｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｐｈｙＢｔｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ(Ｆ)ｃａｎｅｎｈａｎｃｅｉｔｓａｃｔｉｖｉｔｙ.ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｍａｉｚｅｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＢ１ꎬｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｒｅｅｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｓ:ＷｉｌｄｔｙｐｅｐＺｍＰＨＹＢ１ɨＺｍＰＨＹＢ１ＷＴꎬｐＺｍＰＨＹＢ１ɨＺｍＰＨＹＢ１Ｙ９８Ｆ(ｍｉｍｉｃｋｉｎｇＹ１０４ＦｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｐｈｙＢ)ａｎｄｐＺｍＰＨＹＢ１ɨＺｍＰＨＹＢ１Ｙ３５９Ｆ(ｍｉｍｉｃｋｉｎｇＹ３６１ＦｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｐｈｙＢ)ꎬａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｈｅｍｉｎｔｏｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｐｈｙＢ￣９ｌｏｓｓ￣ｏｆ￣ｆｕｎｃｔｉｏｎｍｕｔａｎｔ.ＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｅｓｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍａｉｚｅＰＨＹＢ１ｇｅｎｅｃａｎｌａｒｇｅｌｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｐｈｙＢ￣９ｍｕｔａｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｈｙｐｏｃｏｔｙｌｅｌｏｎｇａｔｉｏｎａｎｄｐｅｔｉｏｌｅｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ.ＦｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬＺｍＰＨＹＢ１ｃａｎｐｈｙｓｉｃａｌｌｙｉｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＰＩＦ５ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｓｈａｄｅａｖｏｉｄａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅａｎｄａｕｘｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ.ＴｈｅＹ９８ＦａｎｄＹ３５９ＦａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｃａｎｅｎｈａｎｃｅｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＺｍＰＨＹＢ１.ＩｎｓｕｍｍａｒｙꎬｏｕｒｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＺｍＰＨＹＢ１ｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｍｅｄｉａｔｉｎｇｓｈａｄｅａｖｏｉｄａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎬａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄｕｓｅｆｕｌｃｌｕｅｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｍａｉｚｅｐｌａｎｔａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｆｏｒａｄａｐｔｉｎｇｔｏｈｉｇｈ￣ｄｅｎｓｉｔｙｐｌａｎｔｉｎｇ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＺｍＰＨＹＢ１ꎻｈｙｐｏｃｏｔｙｌꎻｓｈａｄｅａｖｏｉｄａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅꎻｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ(ＰＩＦｓ). All Rights Reserved.㊀㊀对于植物而言ꎬ光是重要的能量来源及环境信号ꎬ几乎贯穿于植物的一生ꎬ对于植物的生长发育极其重要[１]ꎮ植物主要依靠四类光受体感知光的变化ꎬ其中以红光(Ｒ)及远红光(ＦＲ)(６００~７５０ｎｍ)受体光敏色素(ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓꎬｐｈｙｓ)的研究最为透彻ꎮ光敏色素是含有一个线性四吡咯发色团的同源二聚体ꎬ单体约１２０ｋＤａ[２]ꎮｐｈｙＢ在植物体内以两种可逆状态存在ꎬ即有活性的ＦＲ吸收态Ｐｆｒ和非活性的Ｒ吸收态Ｐｒ[３]ꎮ其通过与光敏色素互作因子(ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｓꎬＰＩＦｓ)互作来行使其功能[４~７]ꎮＮｉｔｏ等[８]认为将拟南芥ＰＨＹＢ的１０４位酪氨酸(Ｙ)残基改造为苯丙氨酸(Ｆ)残基可使其对红光超敏感ꎮＺｈａｎｇ等[９]研究表明ꎬ将拟南芥ＰＨＹＢＮ端３６１位的酪氨酸(Ｙ)残基突变为苯丙氨酸(Ｆ)残基可增强其活性ꎮ同时ꎬ光敏色素Ｂ还是避荫反应的抑制因子[１０]ꎮ避荫反应是一个十分复杂的过程[１１~１２]ꎬ通常认为红光与远红光的比例(Ｒ:ＦＲ)下降是触发避荫反应的因素ꎮ密植后(遮阴)植物之间相互遮挡ꎬ由于植物叶片对有效光的截留㊁吸收及反射等影响导致底层红光与远红光比例下降(低Ｒ:ＦＲ)ꎬ而影响植物的光合作用ꎮ在低Ｒ:ＦＲ生长条件下ꎬ拟南芥表现为茎和叶柄伸长㊁叶片上翘㊁叶面积变小㊁分枝减少㊁早花㊁根系弱㊁易感病㊁抗逆性减弱等适应性特征ꎬ这些反应统称为避荫反应(ｓｈａｄｅａｖｏｉｄａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅꎬＳＡＲ)[１３~１５]ꎮ在低Ｒ:ＦＲ生长条件下ꎬ单子叶植物也会出现茎秆徒长㊁分蘖显著减少㊁产量下降㊁易倒伏㊁雌雄间隔增大等特征ꎮ并且玉米中的ｐｈｙＢ１ｐｈｙＢ２双突变体和高粱中的ｐｈｙＢ突变体与拟南芥中的ｐｈｙＢ突变体类似ꎬ均表现出避荫反应的特征ꎬ如植株增高㊁节间增长㊁易倒伏㊁分蘖减少㊁早花等[１６~１９]ꎮ这一结果表明ꎬｐｈｙＢ也是禾本科植物中调控避荫反应的主要光受体[２０]ꎮ目前拟南芥中遮荫反应分子机理的研究已经相当完善ꎬ但在禾本科植物中的研究还十分有限[１９]ꎮ因此研究玉米的光敏色素Ｂ对于了解玉米避荫反应及光敏色素在单㊁双子叶植物避荫反应中的功能差异十分重要ꎮ玉米(ＺｅａｍａｙｓＬ.)由于广适性㊁高产㊁用途多样等特点ꎬ在全球范围内被广泛种植ꎮ２０１２年玉米已成为我国第一大谷物ꎮ研究表明[２１]ꎬ我国玉米单产水平与美国等国家相去甚远ꎮＤｕｖｉｃｋ等[２２]研究发现增加单位面积玉米的种植密度以增加果穗数是提高玉米单产的有效途径ꎬ但目前我国玉米的种植密度仅为美国的６０％左右ꎮ因此ꎬ我国在玉米种植密度上还有很大的提升空间ꎮ但在高密度种植情况下ꎬ避荫反应综合征是限制玉米产量提高的主要因素ꎬ因此解析避荫反应关键基因光敏色素的功能ꎬ对于深入了解玉米光信号遗传网络㊁指导玉米新品种培育具有重要作用ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料１.１.１㊀实验材料㊀玉米自交系Ｂ７３㊁拟南芥野生型Ｃｏｌ￣０㊁拟南芥突变体ｐｈｙＢ￣９㊁本生烟草(Ｎ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ)为本实验室保存ꎻ大肠杆菌ＤＨ５α感受态㊁农杆菌ＧＶ３１０１感受态㊁Ｐ１９菌株㊁ＡＴ￣Ｈｏｏｋ菌株为本实验室保存ꎻ改造后的ｐＣＡＭＢＩＡ载体为本实验室保存ꎮ１.１.２㊀实验试剂㊀快速质粒小提试剂盒(ＤＰ１０５￣０３)㊁反转录试剂盒(ＫＲ１０６￣０２)㊁通用型ＤＮＡ纯化回收试剂盒(ＤＰ２１４￣０３)㊁荧光定量试剂盒(ＦＰ２０５￣０２)购于天根生化科技公司ꎻＴｒｉｚｏｌ试剂盒购于赛默飞世尔试剂公司ꎻ限制性内切酶购于ＴａＫａＲａ公司和ＮＥＢ公司ꎻＩｎ￣ｆｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ购于Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司ꎻＫＯＤＦｘＰＣＲ扩增酶购于ＴｏＹｏＢｏ公司等ꎮ１.１.３㊀实验仪器㊀ＴＣ￣ＸＰ型ＰＣＲ仪购于广州博日科技公司ꎻＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３实时定量ＰＣＲ仪购于ＡＢＩ公司ꎻＴａｎｏｎ￣１００一体化凝胶成像系统购于上海天能公司ꎻ低温离心机购于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司ꎻＮＡＮＯＤＲＯＰ２０００Ｃ购于Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎻ三色光植物培养箱购于ＰＥＲＣＩＶＡ公司ꎻＳｔｅｍｉ５０８型体视显微镜购于蔡司公司ꎻＬＢ９８５型植物活体成像仪购于ＢｅｒｔｈｏｌｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司等ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀序列获得㊀在Ｔａｉｒ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ.ｏｒｇ/)和ＭａｉｚｅＧＤＢ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｍａｉｚｅｇｄｂ.ｏｒｇ/)中下载拟南芥及玉米光敏色素蛋白质序列ꎮ１.２.２㊀组织表达分析㊀利用Ｔｒｉｚｏｌ法提取ＲＮＡꎻ反转录(详见天根反转录试剂盒(ＫＲ１０６￣０２)说明书)ꎻ转基因株系中外源基因ＺｍＰＨＹＢ１的表达量１５３马晓净ꎬ等:玉米ＰＨＹＢ１基因的克隆㊁改造及其在拟南芥中的功能分析. All Rights Reserved.检测利用引物ｑＰＨＹＢ１￣Ｆ/Ｒ(表１)ꎬ内参引物参考Ｌｉｕ等[２３]的引物序列ꎬ进行实时定量ＰＣＲ(操作详见天根荧光定量试剂盒(ＦＰ２０５￣０２)说明书)ꎮ１.２.３㊀ＺｍＰＨＹＢ１序列的克隆及改造㊀利用ＣＴＡＢ法[２４]提取ＤＮＡꎬＲＮＡ提取同１.２.２ꎮ在ＭａｉｚｅＧＤＢ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｍａｉｚｅｇｄｂ.ｏｒｇ/)中检索ＰＨＹＢ１(ＧＲＭＺＭ２Ｇ１２４５３２)基因并下载其序列信息ꎬ设计克隆及位点改造所需的引物(引物序列见表１)ꎮＺｍＰＨＹＢ１启动子(ｐＺｍＰＨＹＢ１)由引物ＺｍＰＨＹＢ１￣ｐｒｏ￣Ｆ/ＺｍＰＨＹＢ１￣ｐｒｏ￣Ｒ以自交系Ｂ７３基因组ＤＮＡ为模板进行克隆ꎻ野生型Ｚｍ￣ＰＨＹＢ１(ＺｍＰＨＹＢ１ＷＴ)编码序列(ＣＤＳ)由引物Ｚｍ￣ＰＨＹＢ１￣Ｆ/ＺｍＰＨＹＢ１￣Ｒ以自交系Ｂ７３的ｃＤＮＡ为模板克隆ꎮ为了得到序列ＺｍＰＨＹＢ１Ｙ９８ＦꎬＺｍ￣ＰＨＹＢ１Ｙ３５９Ｆ(两个位点的确定详见２.１)ꎬ通过重叠ＰＣＲ的方法进行克隆ꎮ具体操作如下:以Ｚｍ￣ＰＨＹＢ１ＷＴ为模板ꎬ利用引物ＺｍＰＨＹＢ１￣Ｆ/Ｚｍ￣ＰＨＹＢ１￣９８￣Ｒ和ＺｍＰＨＹＢ１￣９８￣Ｆ/ＺｍＰＨＹＢ１￣Ｒꎬ分别进行富集ꎬ纯化回收ꎬ混合后作为模板ꎮ再以ＺｍＰＨＹＢ１￣Ｆ/ＺｍＰＨＹＢ１￣Ｒ进行重叠ＰＣＲꎬ获得ＺｍＰＨＹＢ１Ｙ９８Ｆꎻ以同样的方法获得ＺｍＰＨＹＢ１Ｙ３５９Ｆꎮ１.２.４㊀转基因及鉴定㊀将ｐＺｍＰＨＹＢ１与Ｚｍ￣ＰＨＹＢ１ＷＴ㊁ＺｍＰＨＹＢ１Ｙ９８Ｆ及ＺｍＰＨＹＢ１Ｙ３５９Ｆ分别融合ꎬ与改造后的ｐＣＡＭＢＩＡ载体重组获得重组子ꎮ将重组质粒转入拟南芥中研究其功能ꎮ转基因采用拟南芥花序浸染法[２５]ꎻ转基因阳性植株的鉴定采用喷洒Ｂａｓｔａ筛选法及特异引物ＰＣＲ检测法ꎮ特异引物ＰＣＲ检测法具体操作如下ꎬ提取转基因拟南芥基因组ＤＮＡ为模板ꎬ以鉴定引物ＺｍＰＨＹＢ１￣ｉｄｅｎｔｉｆｙ￣ＦＰ/ＲＰ(表１)进行ＰＣＲ扩增ꎬ若为阳性植株则可见１.４ｋｂ大小条带ꎬ阴性植株则无此条带ꎮ１.２.５㊀表型统计及分析㊀主要观测的表型包括下胚轴长度㊁叶柄长度㊁叶片长度等ꎮ每个材料取３０株进行表型的测量及统计ꎬ采用ｔ测验(Ｓｔｕｄｅｎｔｓｔｔｅｓｔ)进行显著性分析ꎮ下胚轴长度测量:人工气候室(光照/黑暗:１６ｈ/８ｈ)培养６~７ｄ后ꎬ体视显微镜下观察㊁拍照ꎻ用ＩｍａｇｅＪ软件测量３０株幼苗的下胚轴ꎬ统计分析ꎻ叶柄长度及叶片长度测量:取在长日照条件下生长２~３周材料的第３㊁４片叶ꎬ相机拍照ꎻＩｍａｇｅＪ软件测量３０个单株的叶柄长度及叶片长度ꎬ统计分析ꎮ１.２.６㊀蛋白互作研究㊀采用荧光素酶互补成像(ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｍａｇｉｎｇａｓｓａｙꎬＬＣＩ)实验[２３]进行验证ꎮ表１㊀本研究所用引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙ.引物名称引物序列(５ᶄң３ᶄ)引物用途ＺｍＰＨＹＢ１￣ｐｒｏ￣Ｆ５ᶄ￣ＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＣＡＡＣＣＧＡＧＡＡＡＧＧＣ￣３ᶄＺｍＰＨＹＢ１￣ｐｒｏ￣Ｒ５ᶄ￣ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＧＡＣ￣３ᶄ克隆启动子ＺｍＰＨＹＢ１￣Ｆ５ᶄ￣ＣＡＡＣＣＣＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＡＧＣＣＧＣ￣３ᶄＺｍＰＨＹＢ１￣Ｒ５ᶄ￣ＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＡＴＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧ￣３ᶄＺｍＰＨＹＢ１￣９８￣Ｆ５ᶄ￣ＣＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＣＣＡＧＣＧＣ￣３ᶄＺｍＰＨＹＢ１￣９８￣Ｒ５ᶄ￣ＧＧＣＧＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＧＧ￣３ᶄＺｍＰＨＹＢ１￣３５９￣Ｆ５ᶄ￣ＧＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＧＴＧＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＡＴＴ￣３ᶄＺｍＰＨＹＢ１￣３５９￣Ｒ５ᶄ￣ＣＴＧＴＧＣＡＴＧＡＣＡＣＣＣＧＴＧＴＧＧＡＧＣ￣３ᶄ克隆ＣＤＳ序列及改造位点ｑＰＨＹＢ１￣Ｆ５ᶄ￣ＧＣＴＣＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣ￣３ᶄｑＰＨＹＢ１￣Ｒ５ᶄ￣ＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡＴＣＴ￣３ᶄＺｍＰＨＹＢ１的表达量检测ＺｍＰＨＹＢ１￣ｉｄｅｎｔｉｆｙ￣ＦＰ５ᶄ￣ＧＣＴＣＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣ￣３ᶄＺｍＰＨＹＢ１￣ｉｄｅｎｔｉｆｙ￣ＲＰ５ᶄ￣ＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡＴＣＴ￣３ᶄ转基因鉴定２㊀结果与分析２.１㊀玉米ＰＨＹＢ１改造位点的确定已有研究发现ꎬ把拟南芥ＰＨＹＢ的１０４位与３６１位的酪氨酸(Ｙ)残基改造为苯丙氨酸(Ｆ)残基可以提高拟南芥ｐｈｙＢ的活性[８ꎬ９]ꎮ下载拟南芥㊁玉米㊁水稻㊁大豆㊁高粱等的ＰＨＹＢ全蛋白序列进行比对ꎮ结果如图１所示ꎬ通过序列比对ꎬ我们发现在以上物种中ꎬ这两个位点十分保守ꎮ最２５３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.终我们确定玉米中的９８位和３５９位酪氨酸(Ｙ)残基分别与拟南芥中１０４位和３６１位酪氨酸(Ｙ)残基相对应ꎮ图１㊀氨基酸突变位点Ｆｉｇ.１㊀Ａｍｉｎｏａｃｉｄｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｓ.ＺｍＰＨＹＢ１:玉米ＰＨＹＢ１ꎻＳｂＰＨＹＢ:高粱ＰＨＹＢꎻＺｍＰＨＹＢ２:玉米ＰＨＹＢ２ꎻＯｓＰＨＹＢ:水稻ＰＨＹＢꎻＡｔＰＨＹＢ:拟南芥ＰＨＹＢꎻＧｍＰＨＹＢ:大豆ＰＨＹＢꎮ２.２㊀转基因单拷贝纯合株系的筛选将构建好的ｐＺｍＰＨＹＢ１ɨＺｍＰＨＹＢ１ＷＴꎬｐＺｍ￣ＰＨＹＢ１ɨＺｍＰＨＹＢ１Ｙ９８Ｆ和ｐＺｍＰＨＹＢ１ɨＺｍＰＨＹＢ１Ｙ３５９Ｆ三种重组子分别转入拟南芥ｐｈｙＢ￣９突变体中ꎮ采用喷洒Ｂａｓｔａ溶液的方法ꎬ筛选阳性植株ꎮ最终得到单基因插入的纯合转基因植株ꎬ收取种子待用ꎮ为了确定转基因纯合株系的真实性ꎬ对以上植株进行ＰＣＲ鉴定ꎮ阳性转基因植株可见１.４ｋｂ的条带ꎬ而野生型(Ｃｏｌ￣０)及ｐｈｙＢ￣９无该条带ꎬ如图２ꎮ通过以上实验结果我们最终得到了确切的单基因插入的转基因纯合株系ꎮ图２㊀ＰＣＲ鉴定阳性转基因株系Ｆｉｇ.２㊀ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｌｉｎｅｓ.２.３㊀表达分析为了得到ＺｍＰＨＹＢ１基因的表达图谱ꎬ在线搜索了ＺｍＰＨＹＢ１的ＲＮＡ￣Ｓｅｑ数据[２６]ꎬ并对数据进行分析ꎬ结果如图３Ａ所示ꎻ同时针对２.２中得到的纯合转基因株系我们还进行了外源基因Ｚｍ￣ＰＨＹＢ１的实时定量ＰＣＲ检测ꎬ结果如图３Ｂ所示ꎮ通过以上结果发现ꎬＺｍＰＨＹＢ１基因在根㊁茎(节间)㊁叶㊁顶端分生组织(ＳＡＭ)㊁雄穗㊁花丝等组织中均有表达ꎬ但主要在叶子中表达ꎬ尤其是在Ｖ９时期的第１３片叶及未成熟叶片中表达量最高ꎮ此结果与光敏色素基因光受体的功能相符ꎮ由图３Ｂ还可以发现ꎬ在转基因株系中ꎬ转入的外源ＺｍＰＨＹＢ１可在ｐｈｙＢ￣９突变体中表达ꎮ图３㊀ＺｍＰＨＹＢ１基因的表达情况Ｆｉｇ.３㊀ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＺｍＰＨＹＢ１.Ａ.ＺｍＰＨＹＢ１基因在玉米不同组织中的表达情况ꎻＢ.拟南芥各转基因株系中ＺｍＰＨＹＢ１的表达水平ꎮＷＴ＃１/２㊁Ｙ９８Ｆ＃１６/２４㊁Ｙ３５９Ｆ＃３/１２名称中＃后面的数字表示转基因株系编号ꎮ２.４㊀转基因拟南芥植株表型分析２.４.１㊀转基因株系下胚轴长度统计分析㊀如图４Ａ所示ꎬｐｈｙＢ￣９突变体的下胚轴显著长于各转基因株系及野生型ꎮ图４Ｂ中统计数据也同样证实上述结果ꎮ对以上结果进行分析可以得出:①转入外源基因ＺｍＰＨＹＢ１可以使ｐｈｙＢ￣９突变体的下胚轴长度部分或完全恢复到野生型水平ꎬ即抑制突变体下胚轴伸长ꎻ②经过位点改造的转基因株系的下胚轴短于未经过位点改造的转基因株系ꎮ综上所述ꎬＺｍＰＨＹＢ１与拟南芥中ｐｈｙＢ具有３５３马晓净ꎬ等:玉米ＰＨＹＢ１基因的克隆㊁改造及其在拟南芥中的功能分析. All Rights Reserved.图４㊀转基因株系表型Ｆｉｇ.４㊀Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓ.注:Ａ.长日照条件下生长６天的植株的表型ꎻＢ.长日照条件下生长两周的叶片形态ꎻＣ.长日照条件下ꎬ下胚轴长度的测量及统计ꎻＤ.长日照条件下ꎬ第三㊁四片真叶叶片长度的测量及统计ꎻＥ.长日照条件下ꎬ第三㊁四片真叶叶柄长度的测量及统计ꎮ标尺为１ｍｍꎻ∗∗表示突变体ｐｈｙＢ￣９与各株系之间在Ｐ<０.０１水平上差异显著(ｔ检验ꎬｎ＝３０)ꎮ相似的功能ꎮ并且Ｙ９８Ｆ和Ｙ３５９Ｆ氨基酸的替换可增强ＺｍＰＨＹＢ１的活性ꎬ此结果与前人在拟南芥中的研究相符[８]ꎮ２.４.２㊀转基因株系叶片长度与叶柄长度统计分析㊀在长日照生长条件下ꎬｐｈｙＢ￣９突变体一般只有４片莲座叶且其叶片及叶柄显著伸长ꎬ因此我们选取Ｃｏｌ￣０㊁ｐｈｙＢ￣９㊁转基因株系的第３㊁４片叶ꎬ对其叶片长度㊁叶柄长度进行统计ꎬ如图４Ｃ￣Ｅ所示ꎮ从以上结果可以看出ꎬ转基因株系的叶片长度及叶柄长度均显著短于突变体ｐｈｙＢ￣９ꎬ即在拟南芥ｐｈｙＢ￣９突变体中转入外源ＺｍＰＨＹＢ１后ꎬ转基因材料的叶片及叶柄变短ꎮ由此可见ꎬＺｍＰＨＹＢ１可以抑制ｐｈｙＢ￣９突变体的伸长反应(下胚轴㊁叶片及叶柄的伸长)ꎬ这说明该基因可能是避荫反应的抑制因子ꎮ２.５㊀ＺｍＰＨＹＢ１与ＡｔＰＩＦ５互作研究表明ꎬ拟南芥的ｐｈｙＢ可以直接与光敏色素互作因子(ＰＩＦｓ)互作[５]ꎮ前期实验表明ꎬＺｍ￣ＰＨＹＢ１与拟南芥ｐｈｙＢ在功能上存在一定的保守性ꎮ推测其通过与拟南芥ＰＩＦｓ互作而行使功能ꎮ借助荧光素酶互补成像技术ꎬ可验证玉米ＰＨＹＢ１是否与拟南芥ＰＩＦｓ互作ꎮ选取ＡｔＰＩＦ５为代表进行验证ꎮ结果显示ꎬ三种形式的ＺｍＰＨＹＢ１(ＰＨＹＢ１ＷＴ㊁ＰＨＹＢ１Ｙ９８Ｆ㊁ＰＨＹＢ１Ｙ３５９Ｆ)均可以与Ａｔ￣ＰＩＦ５互作(图５)ꎬ表明ＺｍＰＨＹＢ１在拟南芥中可与ＡｔＰＩＦ５互作ꎬ进一步验证了ＺｍＰＨＹＢ１与拟南芥ＰｈｙＢ在功能上的保守性ꎮ２.６㊀转基因株系中避荫反应响应基因及生长素合成关键基因的表达模式ｐｈｙＢ是拟南芥中响应避荫反应的主要光受体ꎬ为了验证ＺｍＰＨＹＢ１是否参与拟南芥的避荫反应ꎬ我们对避荫反应信号通路中的一些重要响应基因的表达量进行了检测ꎮ如图６所示ꎬ通过ｑＲＴ￣ＰＣＲ检测避荫反应中的ｍａｒｋｅｒ基因(ＡＴＨＢ２)与生长素合成ｍａｒｋｅｒ基因(ＹＵＣ５)在转基因株系中的表达模式ꎬ对结果分析可以看出ꎬ拟南芥转基４５３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.图５㊀ＬＣＩ验证ＺｍＰＨＹＢ１与ＡｔＰＩＦ５互作Ｆｉｇ.５㊀ＬＣＩｖｅｒｉｆｉｅｓｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＺｍＰＨＹＢ１ａｎｄＡｔＰＩＦ５.图６㊀下游响应基因表达分析Ｆｉｇ.６㊀Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｓｈａｄｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓ.Ａ.ＡＴＨＢ２表达量变化ꎻＢ.ＹＵＣ５表达量变化ꎮ∗和∗∗表示突变体ｐｈｙＢ￣９与各株系之间在Ｐ<０.０５和Ｐ<０.０１的水平上差异显著(ｔ检验)ꎮ因株系中ＡＴＨＢ２及ＹＵＣ５的表达量均显著低于ｐｈｙＢ￣９突变体中的表达量ꎬ但均高于野生型ꎬ这也从一个侧面解释了我们的转基因株系为什么不能完全互补ｐｈｙＢ￣９突变体表型ꎮ以上结果进一步表明ＺｍＰＨＹＢ１在拟南芥中可以行使ＰＨＹＢ的功能抑制伸长反应ꎮ３㊀讨论在双子叶模式植物拟南芥中ＰＨＹＢ具有抑制避荫反应的功能[２７~２９]ꎮ在禾本科植物中ＰＨＹＢ也是调控避荫反应的主要光受体ꎬ但其在玉米避荫反应调控的遗传网络和分子机理鲜有研究[１９ꎬ３０~３１]ꎮ本研究表明ＺｍＰＨＹＢ１与拟南芥ＰｈｙＢ存在功能保守性ꎬ并且ＺｍＰＨＹＢ１可以参与调控拟南芥的避荫反应ꎮ作物的避荫反应是一种适应性反应ꎬ但其对农业生产十分不利ꎮ育种家经过不断地实践和总结ꎬ提出作物耐密理想株型以减弱或消除避荫反应ꎮ理想株型指标包括小雄穗㊁坚茎秆㊁株高适宜等[３２]ꎮ张世煌[３３]指出ꎬ高密度育种的首要目标在于增强自交系和杂交种的耐密植等抗逆性ꎮ研究表明[３４]ꎬ玉米的茎秆徒长(株高增加)是玉米避荫反应综合征的典型特征ꎮ此外ꎬ避荫反应所导致的植株徒长还会加重倒伏的发生以及减产[３５]ꎮ陈德龙[３６]认为ꎬ株高和穗位高与倒伏是高度正相关的ꎮ本研究结果表明ＺｍＰＨＹＢ１可以抑制拟南芥的伸长反应ꎬ故而推测在转基因玉米中同样会出现株高降低㊁穗位高降低等表型ꎮ拟南芥Ｙ１０４Ｆ(对应玉米Ｙ９８Ｆ突变)氨基酸的替换可增加植株对红光的敏感性[８]ꎬ因此推测玉米Ｙ９８Ｆ氨基酸的替换也可以使玉米对红光超敏ꎬ进而减弱由于密植造成的避荫反应ꎮ拟南芥Ｙ３６１Ｆ(对应玉米Ｙ３５９Ｆ突变)氨基酸的替换ꎬ可以加速ＰｈｙＢ由非活性形式转变为活性形式[９]ꎬ因此在Ｙ３５９Ｆ残基替换的转基因株系中ＰｈｙＢ的活性形式积累ꎬ降解避荫反应促进因子ＰＩＦｓꎬ增强了玉米的耐密性ꎮ总之ꎬ本研究为耐密植玉米新品种的培育提供了参考ꎬ同时也可以启发育种工作者筛选这两５５３马晓净ꎬ等:玉米ＰＨＹＢ１基因的克隆㊁改造及其在拟南芥中的功能分析. All Rights Reserved.个位点的自然变异ꎬ以改良玉米的株高㊁穗位高以及增强耐密性ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＫａｍｉＣꎬＳéｖｅｒｉｎｅＬꎬＨｏｒｎｉｔｓｃｈｅｋＰꎬｅｔａｌ..Ｃｈａｐｔｅｒｔｗｏ￣ｌｉｇｈｔ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].Ｃｕｒｒ.Ｔｏｐ.Ｄｅｖ.Ｂｉｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ９１:２９－６６.[２]㊀ＶｉｅｒｓｔｒａＲＤꎬＺｈａｎｇＪ.Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ:Ｓｏｌｖｉｎｇｔｈｅｇｏｒｄｉａｎｋｎｏｔｗｉｔｈｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｌａｔｉｖｅｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ.ꎬ２０１１ꎬ１６(８):４１７－４２６.[３]㊀ＬｉＪＧꎬＬｉＧꎬＷａｎｇＨＹꎬｅｔａｌ..Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｅｃｈ￣ａｎｉｓｍｓ[Ｊ].ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＢｏｏｋꎬ２００２ꎬ３(３):ｅ０１４８. [４]㊀ＡｎｄｒｅａＣꎬＧｉｏｖａｎｎａＳꎬＭａｓｓｉｍｉｌｉａｎｏＳꎬｅｔａｌ..Ｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｔｈｅｓｈａｄｅ￣ａｖｏｉｄａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ１６３(１):３３１－３５３.[５]㊀ＰａｂｌｏＬꎬＱｕａｉｌＰＨ.ＰＩＦｓ:Ｐｉｖｏｔａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｈｕｂ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ.ꎬ２０１１ꎬ１６(１):１９－２８. [６]㊀ＬｏｒｒａｉｎＳꎬＡｌｌｅｎＴꎬＤｕｅｋＰＧꎬｅｔａｌ..Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｓｈａｄｅａｖｏｉｄａｎｃｅｉｎｖｏｌｖｅｓｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｂＨＬＨｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２０１０ꎬ５３(２):３１２－３２３.[７]㊀ＳｔａｍｍＰꎬＫｕｍａｒＰＰ.Ｔｈｅｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅｓｉｇｎａｌｎｅｔｗｏｒｋｒｅｇｕ￣ｌａｔｉｎｇｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｇｒｏｗｔｈｄｕｒｉｎｇｓｈａｄｅａｖｏｉｄａｎｃｅ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２０１０ꎬ６１(１１):２８８９.[８]㊀ＮｉｔｏＫꎬＷｏｎｇＣＬꎬＹａｔｅｓＪꎬｅｔａｌ..Ｔｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＲｅｐ.ꎬ２０１３ꎬ３(６):１９７０－１９７９.[９]㊀ＺｈａｎｇＪＲꎬＳｔａｎｋｅｙＲＪꎬＶｉｅｒｓｔｒａＲＤ.Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ￣ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉ￣ｎｅｅｒｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂｗｉｔｈａｌｔｅｒｅｄｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｌｉｇｈｔｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ１６１(３):１４４５－１４５７.[１０]㊀ＨａｌｌｉｄａｙＫＪꎬＫｏｏｒｎｎｅｅｆＭꎬＷｈｉｔｅｌａｍＧＣ.ＰｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＢａｎｄａｔｌｅａｓｔｏｎｅｏｔｈｅｒｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｍｅｄｉａｔｅｔｈｅａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｆｌｏｗｅｒｉｎｇｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＬ.ｔｏｌｏｗｒｅｄ/ｆａｒ￣ｒｅｄｒａｔｉｏ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ１９９４ꎬ１０４(４):１３１１－１３１５. [１１]㊀ＫｕｔｓｃｈｅｒａＵꎬＢｒｉｇｇｓＷＲ.Ｓｅｅｄｌｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｂｕｃｋｗｈｅａｔａｎｄｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｔｈｅｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｓｈａｄｅ￣ａｖｏｉｄａｎｃｅｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ１５(６):９３１－９４０.[１２]㊀ＳｍｉｔｈＨꎬＷｈｉｔｅｌａｍＧＣ.Ｔｈｅｓｈａｄｅａｖｏｉｄａｎｃｅｓｙｎｄｒｏｍｅ:Ｍｕｌ￣ｔｉｐｌｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＥｎｖｉｒ.ꎬ２０１０ꎬ２０(６):８４０－８４４.[１３]㊀ＢｏａｒｄｍａｎＮＫ.Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｓｕｎａｎｄｓｈａｄｅｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ａｎｎ.Ｒｅｖ.ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ１９７７ꎬ２８(１):３５５－３７７. [１４]㊀ＭｉｄｄｌｅｔｏｎＬ.Ｓｈａｄｅ￣ｔｏｌｅｒａｎｔｆｌｏｗｅｒｉｎｇｐｌａｎｔｓ:Ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓａｎｄｈｏｒｔｉ￣ｃｕｌｔｕｒａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃ.ꎬｄｏｉ:１０.１７６６０/ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃ.２００１.５５２.９.[１５]㊀ＳｍｉｔｈＨ.Ｌｉｇｈｔｑｕａｌｉｔｙꎬｐｈｏｔｏｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎꎬａｎｄｐｌａｎｔｓｔｒａｔｅｇｙ[Ｊ].Ａｎｎ.Ｒｅｖ.ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ１９８２ꎬ３３(１):４８１－５１８. [１６]㊀ＢｅｎｎｅｔｚｅｎＪＬ.Ｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｇｒａｓｓｇｅｎｏｍｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎ[Ｊ].Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎ.ＰｌａｎｔＢｉｏｌ.ꎬ２００７ꎬ１０(２):１７６－１８１.[１７]㊀ＣｈｉｌｄｓＫＬ.ＴｈｅｓｏｒｇｈｕｍｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｇｅｎｅꎬＭａ３ꎬｅｎｃｏｄｅｓａｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＢ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ１９９７ꎬ１１３(２):６１１－６１９.[１８]㊀ＫｅｂｒｏｍＴＨꎬＢｒｕｔｎｅｌｌＴＰꎬＦｉｎｌａｙｓｏｎＳＡ.Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｏｒ￣ｇｈｕｍａｘｉｌｌａｒｙｂｕｄｏｕｔｇｒｏｗｔｈｂｙｓｈａｄｅꎬｐｈｙＢａｎｄｄｅｆｏｌｉａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＥｎｖｉｒ.ꎬ２０１０ꎬ３３(１):４８－５８.[１９]㊀ＫｅｂｒｏｍＴＨꎬＢｒｕｔｎｅｌｌＴＰ.Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｈａｄｅａｖｏｉｄａｎｃｅｓｙｎｄｒｏｍｅｉｎｔｈｅｇｒａｓｓｅｓｈａｓｂｅｇｕｎ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２００７ꎬ５８(１２):３０７９－３０８９.[２０]㊀ＷａｎｇＨꎬＷｕＧꎬＺｈａｏＢꎬｅｔａｌ..Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｏｄｕｌｅｓｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｅａｒｌｙｓｈａｄｅａｖｏｉｄａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍ.ꎬ２０１６ꎬ１７(１):２６９.[２１]㊀杨慧莲ꎬ韩旭东ꎬ郑风田.全球主产国(地区)玉米生产㊁贸易㊁消费及库存状况对比基于１９９６/１９９７－２０１６/２０１７产季数据测算[Ｊ].世界农业ꎬ２０１７(６):２８－３５.[２２]㊀ＤｕｖｉｃｋＤＮ.ＧｅｎｅｔｉｃｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｙｉｅｌｄｏｆＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｍａｉｚｅ(ＺｅａｍａｙｓＬ.)[Ｊ].Ｍａｙｄｉｃａꎬ２００５ꎬ５０(３):１９３－２０２. [２３]㊀ＬｉｕＹꎬＸｉｅＹꎬＷａｎｇＨꎬｅｔａｌ..ＬｉｇｈｔａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｔａｒｖａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｈｒｏｕｇｈｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＰＨＯＳＰＨＡＴＥＳＴＡＲＶＡＴＩＯＮＲＥ￣ＳＰＯＮＳＥ１[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１７ꎬ２９(９):２６８－２０１７. [２４]㊀ＭｕｒｒａｙＭＧꎬＴｈｏｍｐｓｏｎＷＦ.ＲａｐｉｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｐｌａｎｔＤＮＡ[Ｊ].Ｎｕｃｌ.ＡｃｉｄｓＲｅｓ.ꎬ１９８０ꎬ８(１９):４３２１－４３２５.[２５]㊀ＣｌｏｕｇｈＳＪꎬＢｅｎｔＡＦ.Ｆｌｏｒａｌｄｉｐ:Ａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２０１０ꎬ１６(６):７３５－７４３.[２６]㊀ＷａｌｌｅｙＪＷꎬＳａｒｔｏｒＲＣꎬＳｈｅｎＺ.Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｏｍｉｃｎｅｔｗｏｒｋｓｉｎａｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｔｌａｓｏｆｍａｉｚｅ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１６ꎬ３５３(６３０１):８１４－８１８.[２７]㊀ＦａｎｋｈａｕｓｅｒＣꎬＣａｓａｌＪＪ.Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｐｈｏ￣ｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｎｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２００４ꎬ３９(５):７４７－７６０. [２８]㊀Ｌóｐｅｚ￣ＪｕｅｚＥꎬＮａｇａｔａｎｉＡꎬＴｏｍｉｚａｗａＫꎬｅｔａｌ..Ｔｈｅｃｕｃｕｍｂｅｒｌｏｎｇｈｙｐｏｃｏｔｙｌｍｕｔａｎｔｌａｃｋｓａｌｉｇｈｔ￣ｓｔａｂｌｅＰＨＹＢ￣ｌｉｋｅｐｈｙｔｏ￣ｃｈｒｏｍｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ１９９２ꎬ４(３):２４１－２５１.[２９]㊀ＳｏｍｅｒｓＤＥꎬＳｈａｒｒｏｃｋＲＡꎬＴｅｐｐｅｒｍａｎＪＭꎬｅｔａｌ..Ｔｈｅｈｙ３ｌｏｎｇｈｙｐｏｃｏｔｙｌｍｕｔａｎｔｏｆａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉｓｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＢ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ１９９１ꎬ３(１２):１２６３－１２７４.[３０]㊀ＫｅｂｒｏｍＴＨꎬＢｕｒｓｏｎＢＬꎬＦｉｎｌａｙｓｏｎＳＡ.ＰｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＢｒｅ￣ｐｒｅｓｓｅｓｔｅｏｓｉｎｔｅｂｒａｎｃｈｅｄ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｎｄｕｃｅｓｓｏｒｇｈｕｍａｘ￣ｉｌｌａｒｙｂｕｄｏｕｔｇｒｏｗｔｈｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｌｉｇｈｔｓｉｇｎａｌｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２００６ꎬ１４０(３):１１０９－１１１７.[３１]㊀ＳａｗｅｒｓＲＪꎬＳｈｅｅｈａｎＭＪꎬＢｒｕｔｎｅｌｌＴＰ.Ｃｅｒｅａｌｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ:ｔａｒｇｅｔｓｏｆｓｅｌｅｃｔｉｏｎꎬｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ?[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ.ꎬ２００５ꎬ１０(３):１３８－１４３.[３２]㊀王元东ꎬ段民孝ꎬ邢锦丰ꎬ等.玉米理想株型育种的研究进展与展望[Ｊ].玉米科学ꎬ２００８ꎬ１６(３):４７－５０.[３３]㊀张世煌.论玉米高密度育种和生产上的密植[Ｊ].北京农业ꎬ２００９(２９):１－２.[３４]㊀ＤｕｂｏｉｓＰＧꎬＯｌｓｅｆｓｋｉＧＴꎬＳｈｅｒｒｙＦＧꎬｅｔａｌ..Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｎｄ￣ｏｆ￣ｄａｙｆａｒ￣ｒｅｄｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ１５４(１):１７３－１８６. [３５]㊀ＣｈｅｎＣＹꎬＨｏｕＹＨꎬＲｕｉＳꎬｅｔａｌ..Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｌａｎｔｉｎｇｄｅｎｓｉｔｙｏｎｙｉｅｌｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｄｄｅｎｓｉｔｙ￣ｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｍａｉｚｅｈｙｂｒｉｄｓ[Ｊ].ＡｃｔａＡｇｒｏｎ.Ｓｉｎ.ꎬ２０１０ꎬ３６(７):１１５３－１１６０. [３６]㊀陈德龙.不同抗倒能力玉米品种茎秆及根系等相关特征研究[Ｄ].长春:吉林农业大学ꎬ硕士学位论文ꎬ２０１５.６５３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。

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（ＣＰＲ）ｗｔｒｒｅｉｎｄａｃｒｉｇｔｔｅｓｑｅｃｓｉｅｅａｋＩｌａｌｅｒｇｎａｌｎｄａｄｓ・ｉｐｉｓｄｓｅｃｏｄｎｏｈｅｕｎｅｎＧｎＢｎ．，ｅｍｐｉｄｆｍｅｔＷｃｏｅｎｅｈｍｅｇ＇ｌｉｆａｓ
关键词：曲霉；Ｐｙ黑ｈＢ基因；Ｃ序列分析ＰＲ；中图分类号：７９ｏ８文献标识码：Ａ文章编号：００— ０１２７００１ｏ１０７９（加）２— ０４一４
ＣｌｎｎｇａｄＳｑｎｅＡｎｌｓｓｏｈｙＧｅｅｏｐｅｇｌｕｉｅ Ⅵ，ｏｉｎｅｕｅｃａｙｉｆｔｅＰｈＢｎｆＡｓｒｉｓｎｇｒｌＰｌ
ｔ华ＩｌＣＬＵＡ：＿哪Ｌ－１Ｉ ● Ｉ￥Ｈ ∞
北农学报・０７，２２１．７２０２（）：４１
植酸酶基因ＰｙＪ的克隆及序列分析ｈＢ
Ｋｉ — ｎ，Ｕｕ — ｎ，ＵＨｎ－ｅ，Ｉｉ — ｉＥＸａｊｇＧＯＲｎｆｇＹｏｇｗｉＪＡＹｎｍｎｏｉａｇ
（ｏｅｅｆｏｄＳｉｃ，ｇｃｌｒＵｉｒｔｏＨｂｉａｄｎ０１０，ＣｉａＣｌｇｏｃｎｅＡｒｕｔｅｎｖｓｙｆｅｅ，Ｂｏｉｇ７０１ｈ）ｌｏＦｅｉｕｅｉｎ
ＷＰｔｎｉｔｉｐｐｒｔｓｑｅｃａｅｎａｃｓｅｙＧｎＢｋ（ｃｅｓｎＤ８６６）１ｒｓａｅｓｅｕｎｅｈｂｅｃｅｓｄｂｅｅａｓａｎｈｉｉｓｎＡｃｓｉ：Ｑ３３０．ｏ
Ｋｅｒｓ：ｓｒｌｕｉｅｙｗｏｄＡｐｅｇｉｓｎｇｒ；ＰｈＢｅｅ；ＰＣＲ；Ｓｑｅｃａｙｉｌｙｇｎｅｕｎｅａｌｓｓｎ
ｑｎｅｕｅｃｄ．１１ｅｕｓｓｏｄｔａｈｏｉｇｒｇｏｓ１５０ｂｎｓｚ１ｅｒｓｈｈｗｅｈｔｔｅｃｄｎｅｉｎｗａ６ｐｉｉｅ，ｉｃｕｅｎｒｎ，ａｄｅｃｄｄａｐｐｉｅｏｎｌｄｓ３ｉｔｏｓｎｎｏｅｅｔｆｄ
４０ａｉｏａｉｒｉｕｓ．ｏｐｒｏｆｈｓｅｕｎｅｗｔｔｅＡｈｏｅａｒＡ．６ｍｎｃｓｅＣｍａｉｎｏｉｓｑｅｃｈｈｐｆｈｔｅｎｄｅｄｓｔｉｔｎｕＪｆＡ．ｏ
ＡＫ２３ＧｎＢｋＡｃｓＬ０４（ｅｅａｃｅ．ｎ
该基因长１６ｐ含有３内含子，编码４０个氨基酸，已报道的ＡＫ２３的植酸酶４ｈ基因（ｅｅａｋＡｃｓ０ｂ，５段共６与Ｌ０４ｐＧｎＢｎｃｅ．
ｓｎＩ２２）比较，码的氨基酸序列同源性为９．３，此将其命名为Ｐｙｌ该基因含有植酸酶保守序列ｉ：０４０相ｏＪ编９１％因ｈＢ。 “ ＨＸＸ ” “ Ｄ。黑曲霉ＷＰ植酸酶Ｐｙ，因序列已在国际基因库中注册，ＲＧＲＰ和Ｈ ” １ｈＢ基注册号为：Ｑ３３０。Ｄ８６６
柯晓静，润芳，宏伟，英民郭于贾
（北农业大学食品科技学院，北保定河河０１０）７０１
摘要：了进一步研究多种植酸酶之间的相互作用，用ＰＲ技术，黑曲霉ＷＰ为利Ｃ从１中克隆出植酸酶ＰｙｈＢ基因，
ｓｎＬ２２，ｈｗａｅｎｃｅｔｅｈｍｏｏｙｉ９７％，ｎｈｍｎｃｄｈｍｏｏｙｃｍｅｐｔ９．３．１１ｉ：０４０）ｓｏｓｔｔｔｕｌｏｉｏｌｇｓ６．９ａｄｔｅａｏａｉｏｌｇｏｓｕ９１％１ｅｏｈｈｄｉｏ
Ａｂｔａｔ，ｌＰｈＢ１ｅｃｄｎｈｔｓｆＡｐｒｉｕｒＷＰ１ｓｒｃ：Ｉｅ＇ｌｙｎｏｉｇｐｙａｅｏｓｅｇｌｓｎｌｗａｍｐｉｅｙｔｅｐｌｍｅａｅＣｈｉｅｃｉｎｓａｌｆｄｂｈｏｙｒａｎｒａｔｉｓｏ
植酸酶是将植酸及其盐类水解为肌醇和无机磷
盐的一类酶的总称。近年来随着饲料业、畜牧养殖
据ｕ１＿等报道：ＲＬ１５Ｐｙ的最佳ｐ１ｈ３ａＮＲ３３ｈＡＨ为５０但Ｐｙ．，ｈＢ的最佳ｐＨ是２５并且在ｐ．．，Ｈ５０时没有或者只有很少的活性。经本实验室测得，曲黑霉ＷＰ分别在ｐ．１Ｈ２５和ｐ．Ｈ５５处有２个酶活高峰，此，因预测黑曲霉ＷＰ１可能含有２种植酸酶基因。因此，根据文献报道，计筛选出２对引物，设从