β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法课件
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β地中海贫血基因检测反向点杂交法ppt课件
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩 增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交， 一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、 简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体 检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测 等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
杂交膜条
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
反应条件按照试剂盒要求
影响PCR的因素见理论课内容
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管
地中海贫血诊断检查ppt课件
*
地贫筛查后哪些情况 需做地贫基因检测？
1.Hb正常或轻度下降，MCV下降和 （或）MCH下降，但电泳没有阳性 发现的（HbA2检测误差，轻型或静 止型α 地贫 ），要做地贫基因检 测。 2.夫妇双方一方确定为α （β ）地 贫 ，另一方做地贫基因。
地贫的基因分析局限性
1.由于分子诊断技术本身的局限性， 地贫基因诊断的误诊及漏诊率约2%。
诊断
临床特点＋实验室检查＋父母调查
阳性＋基因分析
地中海贫血检查 1.血细胞分析 2.红细胞脆性试验 3.血红蛋白分析 4.地贫基因检测
第1-3项为筛查项目
地中海贫血初筛检查
1.血细胞分析
MCV < 80fl 和（或）MCH <27pg CV）<80fl为地贫表型阳 性，β地贫和中间型、轻型α地贫和部分静 止型α地贫基因携带者均为阳性，但有部分 静止型α地贫基因携带者是正常的。
地贫地域分布
α地中海贫血多见于黑人(黑人中25%至少有 一个基因缺陷)，β地中海贫血多见于地中海 地区或东南亚。 我国以广东、广西、海南、四川、重庆等省 区发病率较高，在北方较为少见。
Thalassemia
中国南方不同高发地
区人群携带率 1 ~ 23%
地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一
δ 四个类型，以β 和α 地贫最常见。
地贫临床类型
临床上将地贫分为轻、中、重三个临床类型。 (1)轻型：轻度贫血或无症状，一般在调查家族史时发现。 (2)中间型：轻度至中度贫血，患者大多可存活至成年。 (3)重型：出生数日即出现贫血、肝脾肿大进行性加重，黄 疸，并有发育不良，其特殊表现有：头大、眼距增宽、马鞍 鼻、前额突出、两颊突出，其典型的表现是臀状头，长骨可 骨折。骨骼改变是骨髓造血功能亢进、骨髓腔变宽、皮质变 薄所致。少数患者在肋骨及脊椎之间发生胸腔肿块，亦可见 胆石症、下肢溃疡。常见并发症有急性心包炎、继发性脾功 能亢进、继发性血液病。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法ppt课件
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循 环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍。
1.DNA获取（已准备好了）
2.PCR扩增 ： 反应液管（做好记号） 5000rpm，2秒 加入 2ul DNA溶液
总体积25微升
50℃， 95℃， 94℃， 55℃， 72℃， 72℃，
PCR扩增条件
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
3.杂交 ：
结果判断
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点杂交技 术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一 次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代 固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式， 具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、 基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。
地中海贫血基因诊断PPT课件
临
床 中间型地贫：(+(高F)／ +(高F) 、+／+)
类
型 遗传性胎儿血红蛋白持续增多症(HbFα 2γ 2)
地中海贫血基因诊断
A.重型β 地中海贫血
患者不能合成β 链 α 链过剩而沉降到红细胞膜上，引起膜的性能改
变，发生严重的溶血反应，引起肝脾增大。 组织缺氧，促进红细胞生成素分泌，刺激骨髓增
珠蛋白基因的结构及表达
1.珠蛋白基因的结构
α 珠蛋白基因簇 16p13 β 珠蛋白基因簇 11p15
地中海贫血基因诊断
地中海贫血的分型
·α地中海贫血：根据造成人贫血病情的严重性将
其分为4种类型。
·β地中海贫血：根据造成病情的严重性分为3种类
型： ·重型地中海贫血 ·中间型地中海贫血 ·轻型地中海贫血
PCR 扩增
基因型分析
α地中海贫血的 基因诊断结果
地中海贫血基因诊断
PCR 扩增
缺失型突变检测PCR 反应条件为:95℃预变性5min， 98℃ 45s，66℃ 30s，72℃ 3 min，35个循环，最 后72℃延伸5 min。 非缺失型突变检测PCR反应条件为:94℃预变性5 min， 94℃ 60s，55℃ 30s，72℃60 s，35个循环，最后 72℃延伸5min。
地中海贫血基因诊断
反向点杂交( reversedot-blot, RDB)
将上述PCR扩增产物与膜条100变性10min,42℃杂 交4h以上,洗膜,加入酶标抗生物素蛋白,再次洗膜, 加入酶底物显色,观察结果。具体步骤按说明书进 行操作。
地中海贫血基因诊断
杂交结果判定
地中海贫血基因诊断
杂交结果判定
地中海贫血基因诊断
β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法)
pcr扩增
DNA提取
利用特定的试剂从血细胞中提取出DNA。
pcr扩增
使用聚合酶链式反应（PCR）技术对DNA进行扩增，使其数量增加，便于后续 的检测。反向点Fra bibliotek交制备探针
将目标基因序列设计成特定的探针，并固定在尼龙膜上。
杂交反应
将扩增后的DNA与固定在膜上的探针进行杂交，通过碱基互 补配对原则，将目标基因序列特异性地结合在膜上。
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术提高检测的灵敏度和特异性，降 低检测误差。
要点二
基因组编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因组编辑技术，对β-地中海贫血基因 进行精确编辑和修复，从根本上治疗地中海贫血。
临床应用的拓展
早期筛查
将β-地中海贫血基因检测纳入新生儿筛查 计划，实现早期发现和干预，降低疾病对 患儿的影响。
β-地中海贫血基因检测(pcr反向点杂交法)
• β-地中海贫血基因检测介绍 • pcr-反向点杂交法介绍 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)流程 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)的临床意义
• β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点 杂交法)的未来发展
01
β-地中海贫血基因检测介绍
03
耗时长：需要进行PCR扩增和杂交反应， 整个过程需要一定时间。
04
对实验条件要求高：需要严格控制实验条 件，避免交叉污染和假阳性结果。
03
β-地中海贫血基因检测(pcr-反 向点杂交法)流程
样本采集和处理
血液样本采集
从患者静脉抽取适量血液，用于 后续的基因检测。
样本处理
将采集的血液进行离心，分离出 血浆和血细胞，保留血细胞用于 后续的DNA提取。
血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血
５ ｎ。 ｍｉ
北 京六 一 仪 器厂 Ｄ Ｙ一 Ｃ型 电泳 仪 、 海精 密 Ｙ ８ 上 科学 仪器 有 限公 司 ７ ２分 光光 度计 。 ２
１２２方 法 ．＿
本 文采用 醋酸 纤维 薄膜 电泳 法 。参照 临床 检验
操 作 规 程第 二 版回 用 生理 盐 水 洗 涤 红细 胞 ４次， ， 四 氯 化碳 萃 取后 制 备 Ｈ ｂ液 。 经适 当稀 释 后调 整 Ｈ ｂ含 量 ８ １ｇＬ 进行 点样 电泳 、 色 、 ～ ２ ／。 染 洗脱 和 比色 检测 出 Ｈ Ｆ和 Ｈ Ａ ，若 Ｍ Ｖ＜ ０ ， ｂ ２３２ ｂ ｂ２ Ｃ ８ ％ Ｈ Ａ＞ ． ％，或 Ｈｂ ＞ Ｆ ３１ ， 判为 Ｂ 地 中海贫 血表 型 阳性 【 ． 则 ％ 一 ３ Ｊ 。 １３ 一 中海 贫血 基 因检 测 ． Ｂ 地
６ ４ Ｃ Ｔ ｗ ｓ ｎｔｅｔ ｓ Ｃ ｎ ｌｓ ｎＴ ｅＰ Ｒ ｔ ｈ ｉｕ ｎ ｅｔ ｈ ｉｕ ｆ ｅ ｅｓ ｏ ｂｏ （ Ｄ ） ｒ ｔｅ ５ （ — ） ａ ｐｌ ｔ ｏ ｃ ｉ ：ｈ Ｃ ｃ ｎｑ ｅａ ｄｔ ｃ ｎｑ ｅｏ ｖｒｅｄ ｔ ｌｔＲ Ｂ ａｅ ｈ ｏ ｈ ｏ ｉ． ｕ ｏ ｅ ｈ ｅ ｒ
年 ５月 门诊及 住 院患者 的血 红 蛋 白电泳及 反 向斑 点 杂交 结果 进行 分析 报道 如下 。 １ 对 象与方 法
１１ 对 象 ．
病 例 来 自我 院 ２ １ ０ ０年 ｌ １月 至 ２ １ 年 ５月 住 ０１ 院与 门诊 患 者 ，均经 血 常规 检查 Ｈ ＜ ｌ ｇＬＭＣ ｂ １ Ｏ／ ， Ｖ＜
关 键词 ８ 地 中 海贫 血 ； 红 蛋 白 电泳 ； ｃ 反 向斑 点杂 交 一 血 Ｐ Ｒ一 中 图分 类号 Ｒ ９ ．３ Ｒ ５ ３ ４３ ； ５ ６ 文 献 标 识码 Ａ 文章 编 号 １ ０ — ６ ９ ２ １ ） － ２ １ ０ ０ ０ ２６ （０ ２ ３ ０ ９ － ３
北 京六 一 仪 器厂 Ｄ Ｙ一 Ｃ型 电泳 仪 、 海精 密 Ｙ ８ 上 科学 仪器 有 限公 司 ７ ２分 光光 度计 。 ２
１２２方 法 ．＿
本 文采用 醋酸 纤维 薄膜 电泳 法 。参照 临床 检验
操 作 规 程第 二 版回 用 生理 盐 水 洗 涤 红细 胞 ４次， ， 四 氯 化碳 萃 取后 制 备 Ｈ ｂ液 。 经适 当稀 释 后调 整 Ｈ ｂ含 量 ８ １ｇＬ 进行 点样 电泳 、 色 、 ～ ２ ／。 染 洗脱 和 比色 检测 出 Ｈ Ｆ和 Ｈ Ａ ，若 Ｍ Ｖ＜ ０ ， ｂ ２３２ ｂ ｂ２ Ｃ ８ ％ Ｈ Ａ＞ ． ％，或 Ｈｂ ＞ Ｆ ３１ ， 判为 Ｂ 地 中海贫 血表 型 阳性 【 ． 则 ％ 一 ３ Ｊ 。 １３ 一 中海 贫血 基 因检 测 ． Ｂ 地
６ ４ Ｃ Ｔ ｗ ｓ ｎｔｅｔ ｓ Ｃ ｎ ｌｓ ｎＴ ｅＰ Ｒ ｔ ｈ ｉｕ ｎ ｅｔ ｈ ｉｕ ｆ ｅ ｅｓ ｏ ｂｏ （ Ｄ ） ｒ ｔｅ ５ （ — ） ａ ｐｌ ｔ ｏ ｃ ｉ ：ｈ Ｃ ｃ ｎｑ ｅａ ｄｔ ｃ ｎｑ ｅｏ ｖｒｅｄ ｔ ｌｔＲ Ｂ ａｅ ｈ ｏ ｈ ｏ ｉ． ｕ ｏ ｅ ｈ ｅ ｒ
年 ５月 门诊及 住 院患者 的血 红 蛋 白电泳及 反 向斑 点 杂交 结果 进行 分析 报道 如下 。 １ 对 象与方 法
１１ 对 象 ．
病 例 来 自我 院 ２ １ ０ ０年 ｌ １月 至 ２ １ 年 ５月 住 ０１ 院与 门诊 患 者 ，均经 血 常规 检查 Ｈ ＜ ｌ ｇＬＭＣ ｂ １ Ｏ／ ， Ｖ＜
关 键词 ８ 地 中 海贫 血 ； 红 蛋 白 电泳 ； ｃ 反 向斑 点杂 交 一 血 Ｐ Ｒ一 中 图分 类号 Ｒ ９ ．３ Ｒ ５ ３ ４３ ； ５ ６ 文 献 标 识码 Ａ 文章 编 号 １ ０ — ６ ９ ２ １ ） － ２ １ ０ ０ ０ ２６ （０ ２ ３ ０ ９ － ３
β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法) ppt课件
β-地中海贫血基因检测
（PCR-反向点杂交法）
β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于β珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基 因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致， 是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42(-TCTT)、 CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox28(A→G)等位点。因本病多为点突变所致，故常 用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液 洗膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置 显色液避光显色20min
杂交反应条件按照试剂盒要求
结果判断 杂交膜条 β-28/βN标本
β-28/ β-28标本 βIVS-II-654/ βN标本
β CD41-42/ βN标本 βCD17/ βN标本
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；
（PCR-反向点杂交法）
β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于β珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基 因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致， 是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42(-TCTT)、 CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox28(A→G)等位点。因本病多为点突变所致，故常 用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液 洗膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置 显色液避光显色20min
杂交反应条件按照试剂盒要求
结果判断 杂交膜条 β-28/βN标本
β-28/ β-28标本 βIVS-II-654/ βN标本
β CD41-42/ βN标本 βCD17/ βN标本
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；
地中海贫血筛查及基因示意图培训课件
β+ / β+
（重型） β0和β+双重杂合子
（重型）
（中间型）
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β
β-地中海贫血基因型
β-地中海贫血基因位于第11号染色体上（2条单体
分别来自父母双方），每条染色单体分别有1个β基因。 突变型β地贫:β0 (只能合成部分) 缺失型β地贫:β+ (完全不能合成)
11号染色体
β /β
β0 / β
β+ / β
（正常型）
β+ / β0
（轻型）
β0 / β0
（轻型）
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特点
地域性疾病
溶血性疾病
遗传性疾病
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热带、亚热带-丛林地区-沿海洋地带：蚊虫、疟疾。 突变的地贫基携因带者红细胞能抵御疟原虫的侵袭
中间型（- - / α α、- α / - α）小细胞低色素贫血，无自觉症状，
标准型（- - / - α）小细胞低色素贫血，骨髓代偿性溶血性贫血表现。
重型（- - / - -）死胎、产后半小时内即死亡。“水肿胎”
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α-地中海贫血基因型
α1 α2
α-地中海贫血基因位于第16号染色体上（2条单体 分别来自父母双方），每条染色单体分别有2个α基因。
16号染色体
αα/αα -α/αα -α/-α
（重型） β0和β+双重杂合子
（重型）
（中间型）
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β
β-地中海贫血基因型
β-地中海贫血基因位于第11号染色体上（2条单体
分别来自父母双方），每条染色单体分别有1个β基因。 突变型β地贫:β0 (只能合成部分) 缺失型β地贫:β+ (完全不能合成)
11号染色体
β /β
β0 / β
β+ / β
（正常型）
β+ / β0
（轻型）
β0 / β0
（轻型）
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特点
地域性疾病
溶血性疾病
遗传性疾病
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热带、亚热带-丛林地区-沿海洋地带：蚊虫、疟疾。 突变的地贫基携因带者红细胞能抵御疟原虫的侵袭
中间型（- - / α α、- α / - α）小细胞低色素贫血，无自觉症状，
标准型（- - / - α）小细胞低色素贫血，骨髓代偿性溶血性贫血表现。
重型（- - / - -）死胎、产后半小时内即死亡。“水肿胎”
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α-地中海贫血基因型
α1 α2
α-地中海贫血基因位于第16号染色体上（2条单体 分别来自父母双方），每条染色单体分别有2个α基因。
16号染色体
αα/αα -α/αα -α/-α
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35cycles
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
4.洗膜 ： 50ml塑料管
B液 40ml
42预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进 行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩 增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的 拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循 环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际 反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序 列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐 积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入 线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种 效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的 种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数 情况下，平台期的到来是不可避免的。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环 的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
【原理】
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，将产物同固定在尼 龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快 速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检 测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方面，具有潜在的临床应用价值
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
【目的】
1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握反向点杂交技术原理及方法，熟悉其应用
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建 立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就 将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取 大量单 一核酸片段的技术在分子生物学研究中 具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学 的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术， 而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能 检测中具有重要的应用价值。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点杂交技 术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一 次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代 固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式， 具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、 基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。
42洗涤15min
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液洗 膜2次，各5分钟。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
结果判断
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
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β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法Βιβλιοθήκη 【原理】PCR技术原理
⑴PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、 引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过 一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。 在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核 苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿 模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
β-地中海贫血基因检测
（PCR-反向点杂交法）
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
β地中海贫血是指β链的合成受部分或完全 抑制的一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故 常用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。我国 各民族的β地贫基因突变情况有一定差异，南方 汉族的突变基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、 IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox-28(A→G)为主，占 85%～90% 。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
【操作步骤】
1.DNA获取（已准备好了）
2.PCR扩增 ： 反应液管（做好记号） 5000rpm，2秒 加入 2ul DNA溶液
总体积25微升
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
50℃， 95℃， 94℃， 55℃， 72℃， 72℃，
PCR扩增条件
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min