REAL-TIMEPCR方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数

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利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究

利用实时荧光定量ＰＣＲ法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究摘要：转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键，利用高通量、快速、灵敏的SYBR Grcen I荧光定量实时PCR法，检测了转大麦烟酰胺合成酶基因(NAS1)水稻中外源基因拷贝数，以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为水稻的内源参照基因，通过梯度稀释法，分别获得了NA51和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线，相关系数分别为0.99976和0.99571，相关性高，通过目的基因NASl和水稻內源参照基因SPS起始模板数的比较，获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数，在8株转基因株系中，1株为假阳性，1株拷贝数为1，3株拷贝数为2，其余3株拷贝数分别为3、4和7，而阴性对照拷贝数为0，这种方法快速、简便、准确，可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择。

关键词：SYBR Creen I实时荧光定量PCR；烟酰胺合成酶基因；转基因水稻；拷贝数植物遗传转化是作物改良和新基因功能鉴定的常用方法，但在转基因植物中外源基因拷贝数常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性，因此，转基因研究中关键的一步就是检测外源基因的拷贝数，以筛选出拷贝数少或单拷贝的转基因植株供进一步的研究或育种利用，传统的转基因植株拷贝数检测主要是Southern 杂交法，但该方法工作量大，需要的DNA材料较多，费时费力，并且经常要用到放射性同位素等具有潜在危险的药品，近年来，利用高通量、快速、灵敏的定量PCR方法检测转基因拷贝数逐渐受到科研人员的青睐。

SYBR Green I实时荧光定量PCR法是在PCR反应体系中加入SYBR Green I 荧光染料，该染料能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域并具有受激发产生绿色荧光的能力，当它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生荧光，由于荧光信号强度的增加与PCR产物的增加完全同步，因此通过对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时检测，就可间接的获得PCR扩增数据，根据Ct(cycle thresholds)值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理，制作标准曲线，获得Ct值与起始模板数的相关性方程，将样品的Ct值代人该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与水稻内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数，内源参照基因一般选择拷贝数少，同一物种内的不同生态类型间具有稳定的序列结构和拷贝数的一类基因，Ding等通过对水稻、小麦、玉米、大麦等十几种作物的研究发现，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)基因是水稻特有的基因，并且为单拷贝，可以作为水稻的内源参照基因。

应用real-time PCR定量检测小麦条锈菌潜伏侵染量方法的建立

ＣＡ３４ＵＳ９６８，Ａ）
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植物病理学报
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应用ｒａ— ｅＰＲ定量检测小麦ｅｔＣｌｉｍ条锈菌潜伏侵染量方法的建立
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real-time pcr原理

实时聚合酶链式反应（Real-time PCR）是一种分子生物学技术，用于定量测量DNA或RNA的含量。

它可以用于检测、量化和分析特定基因的表达水平，也可以用于检测病原体、基因突变和许多其他应用。

下面是实时PCR的基本原理：1. **选择性扩增目标DNA/RNA**：实时PCR的第一步是选择性扩增目标DNA或RNA片段。

这通常涉及到设计一对特异性引物（引导片段）来诱导DNA合成。

引物是两个短的DNA片段，它们会结合到目标序列的两端。

2. **荧光探针**：为了实时检测PCR反应的进展，一种叫做荧光探针的特殊DNA分子被引入反应混合物中。

荧光探针是一个含有荧光染料的短链DNA片段，它的一端与一个荧光染料分子紧密相连，另一端与一个荧光阻尼器分子相连。

在初始PCR反应中，这两个分子紧密靠在一起，从而抑制了荧光的发射。

3. **PCR反应**：PCR反应开始后，DNA引物将目标序列进行扩增。

如果目标序列存在，PCR会不断复制它，导致DNA量指数级增加。

4. **荧光信号检测**：在每个PCR循环的末尾，荧光探针靠近的情况会改变。

当PCR过程中荧光探针结合到目标序列时，它被降解，荧光染料与阻尼器分离，导致荧光信号的释放。

荧光信号的强度与PCR反应中目标序列的数量成正比。

5. **实时监测**：荧光信号会在PCR过程中实时检测和记录。

这种监测可以通过特殊的仪器完成，该仪器测量荧光信号的强度并将其显示在一个图表中。

荧光信号的强度与PCR反应中目标序列的初始数量成比例。

因此，通过比较样本中的荧光信号与标准曲线或对照样本，可以定量测量目标DNA或RNA的含量。

总的来说，实时PCR允许科学家在PCR反应进行的同时实时监测和记录DNA或RNA的数量，因此它是一种非常有用的技术，用于定量和检测基因表达、基因变异、病原体等多种生物学研究和诊断应用中。

利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数_姜羽

1 材料与方法
1.1 材料与试剂转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19 材料由华中农
示意图。 1.3.3 引物和探针
实验中涉及的定性、实时荧光定量 PCR 扩增引物和探针通过软件 primer express v2.0 设计，由
业大学生命科学技术学院提供。转人乳铁蛋白基 Invitrogen 公司合成，具体序列见表 1。其中，转基因(human lactoferrin, HLF)山羊(Capra hircus)134 血因水稻 T1c-19 的外源基因杀虫晶体蛋白基因 (in-
Southern blot 和实时荧光定量 PCR 是常用的两种多功能酶标仪 (BioTek, 美国)。 QX100TM Droplet
外源基因拷贝数分析技术, 已广泛用于外源基因拷 DigitalTM PCR 系统(Bio-Rad, 美国, 包括微滴生成仪
贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如，和微滴读取仪)。 ABI 7900 定量 PCR 仪 (Applied
Abstract Droplet digital PCR(ddPCR) is a new absolutely quantitative method based on Poisson distribution, which shows huge potential applicability in accurate quantification of nucleic acid. Herein, we developed the ddPCR method to evaluate the exogenous gene copy number in genetically modified organisms (GMOs) as the example from genetically modified rice(Oryza sativa) T1c-19 and transgenic human lactoferrin gene goat(Capra hircus) 134 examples, and the results was also compared with those from quantitative Realtime PCR (qRT-PCR) and Southern blot. The results from qRT-PCR and ddPCR for cry1C* in T1c-19 were comparatively unanimous (~2 copies), while 1 copy was reported in literatures by Southern blot. The copy number from ddPCR was higher than that of qRT- PCR for bar gene in T1c- 19, 2.09 and 1.51 copies respectively. Same result (~1 copy) was obtained from qRT- PCR and ddPCR for HLF gene in goat 134. Therefore, the ddPCR was well developed as one novel method for estimating transgene copy number with high accuracy, and which may be widely used in the exogenous genes copy number analysis in GMOs. Keywords Droplet digital PCR(ddPCR), Genetically modified organisms(GMOs), Exogenous gene, Copy number

real-time pcr名词解释

real-time pcr名词解释
外文名【Real-time Quantitative polymerase chain reaction】
中文名【实时荧光定量多聚核苷酸链式反应】
中文简称【实时荧光定量PCR】
外文简称【RT PCR】
【实时荧光定量PCR技术】，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

·
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

【技术原理】
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

Real-timePCR实验原理与技术

实时荧光定量PCR技术原理
01
在实时荧光定量PCR反应中， DNA模板被扩增时，与荧光探针结合，产生荧光信号。
02
随着DNA的扩增，荧光信号逐渐增强，通过对荧光信号的实时监测和分析，可以计算出 DNA的起始浓度。
03
通过标准曲线或内参基因的校准，可以将起始浓度转化为目标基因的表达量或基因拷贝数。
实时监测荧光信号
实时监测荧光信号，确保PCR产物在指数扩增阶段被检测到。
标准化实验流程
建立标准化实验流程，确保实验结果的可靠性和可重复性。
未来展望
新技术应用
01
随着新技术的不断发展，如数字PCR、微流控PCR等，Real-
time PCR技术将得到进一步优化。
高通量检测
02
通过多重PCR和高通量检测平台，实现大规模样本的快速检测。
03
Real-time PCR 实验数据分析
数据收集与整理
数据收集
在实时PCR实验中，数据收集通常涉及记录每个循环的荧光信号强度。这些数据通常以图表形式表示，其中横轴表示循环数，纵轴表示荧光信号强度。
数据整理
收集到的原始数据需要经过整理，包括去噪、去除异常值和标准化等步骤，以确保数据分析的准确性。
自动化与智能化
03
实现Real-time PCR的自动化和智能化，提高实验效率，减少人
为误差。
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real-timepcr实验原理与技术
contents
目录
• Real-time PCR 实验原理 • Real-time PCR 实验技术 • Real-time PCR 实验数据分析 • Real-time PCR 实验应用 • Real-time PCR 实验注意事项与优化建

Real-time_PCR(从原理到实验方法及数据分析)

total RNA total RNA
cDNA
cDNA
cDNA
cDNA
相对定量：内对照 Endogenous Control
用以标准化样品操作
time t =0 t=12 t=24 t=48
total RNA total RNA
total RNA total RNA
cDNA
cDNA
cDNA
cDNA
线性图谱
对数图谱
基线
阈值
Ct值
[DNA]0
什么是阈值？
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。
突变的存在形式
目标序列的有无
等位基因分型
• 定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用于检测某个核酸序列的变异。每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。目标序列的实际量不确定。
1. 2. 3. 4. 5. 6. Transcription Hairpin release in the nucleus Export to cytoplasm Dicer processing Strand selection by RISC Translational repression
*mature active strand
等位基因自动识别软件

pcr和real-pcr检测技术及方法

核酸提取试剂盒
国家/项目标准
文献报道
PCR kit
设计合成
Taq酶 dNTP 缓冲液 Mg离子
特异性引物
国家/项目标准文献报道
设计合成
引物设计
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。
➢ 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃） ➢ Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
琼脂糖电泳原理
琼脂糖凝胶电泳步骤
配胶
点样
电泳
胶图分析
成像拍照
配胶
✓ 按所要分离的DNA分子的大小，称取适量的琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加入适量0.5×TBE电泳缓冲液
✓ 置微波炉内加热摇匀至完全溶化呈透明状，适当冷却后，加入核酸染料（例EB或其他替代产品），混匀后，倒入胶托模具内
✓ 待胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽内的缓冲液没过胶面
引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；
引物二聚体
发夹结构
Primer Premier 5.0
PCR体系配置
引物合成稀释
➢ 冻干粉末，开启前10000rpm离心5min
成分
➢ 小心开盖，防止粉末喷出
➢ 储存液配置：用Rnase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时为100pmol/μl，即100μM（例如：合成 9.5nmol，则加水量为10×9.5=95μL）
2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。 3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，
否则容易导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；

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收稿日期：２００９１２０１修回日期：２０１００１１３２ＧＳ０３５Ａ４１００１０３）资助项目甘肃省科技攻关计划项目（通讯作者，电子信箱：Ｋｅｇｃ８＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（３）：９０９４ ?
ＲＥＡＬＴＩＭＥＰＣＲ方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数
李淑洁张正英（甘肃省农业科学院生物技术研究所兰州７３００７０）
取小麦基因组ＤＮＡ，用碱裂解法提取质粒ＤＮＡ，ＤＮＡ浓度和纯度用紫外分光光度法测定，使ＯＤＯＤ２６０／２８０≈ １．８，ＯＤＯＤ２，备用。２６０／２３０＞内参基因标准品选用未转基因的小麦基因组ＤＮＡ，浓度为０．６５ｇ／ｌ。采用５倍倍比稀释，稀释倍 μ μ ５，５，５，５。数分别为５，以含ｐｔａ基因的质粒ＤＮＡ为标准品，浓度为１．５３× １０μ ｇ／ｌ。采用５倍倍比稀释，稀释倍数分别为 μ ５，５，５，５，５。以ｗｘ０１２作为小麦的内参基因，以含ｐｔａ基因的质粒ＤＮＡ为阳性对照，未转基因小麦为阴性对照，水为空白对照。１．２．２引物设计及合成转基因小麦内、外源基因的ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。引物序列见表１。引物由Ｉ
摘要采用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ方法检测７株转基因小麦中外源半夏凝集素基因的拷贝 Ⅰｒ数。以小麦蜡质基因（ｗｘ０１２）作为内参基因，以未转基因小麦基因组ＤＮＡ为内参基因标准品进行５倍梯度稀释得到内参基因Ｃｙ＝－０．２６６７ｘ＋６．９８；以含Ｔ值与起始模板量的相关性标准曲线：半夏凝集素基因（ｐｔａ）的质粒ＤＮＡ为目的基的因标准品同样进行５倍梯度稀释，建立目的基因Ｃｙ＝－０．２１１８ｘ＋４．５３。通过ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ ⅠｒＴ值与起始模板量的相关性标准曲线：分别获得每一样本中目的基因和内参基因的Ｃ将ＣＴ值，Ｔ值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量，目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因植株中的拷贝数。计算结果为：单拷贝的有１株，２个拷贝１株，３拷贝和４拷贝的各有２株，其中有１株为假阳性植株。关键词ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＣＲＣｔａｗｘ０１２转基因小麦拷贝数 Ⅰ实时荧光定量ＰＴ值ｐ
表１小麦内参基因、外源基因引物序列Ｔａｂｌｅ１Ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｌｅｎｇｔｈ
ＮａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５ ′ ｔｏ３ ′ ）Ａｍｐｌｉｃｏｎｓｉｚｅ（ｂｐ）１０２１４４
中图分类号Ｑ７８Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ是一种常用的ＤＮＡ定量的分子生物学方法，准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。另外，由于Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测不经过靶片段的ＰＣＲ扩增，一般每个电泳通道需要１０～３０ｇ的ＤＮＡ，在实际 μ ＮＡ，而转基操作中就需要较大量的植物材料来提取Ｄ因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。实时荧光定量ＰＣＲ技术是一种新的ＤＮＡ定量方法。其定量的基本原理是在ＰＣＲ反应体系中加入非特ＹＢＲＧｒｅｅｎＩ）或特异性的荧光探异性的荧光染料（如Ｓ针（如Ｔａｑｍａｎ探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：Ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）；通过将已知浓度标准品的Ｔ值（ｃＣ值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量Ｔ样品的浓度。荧光定量ＰＣＲ技术具有简便、快捷的优点，能够有效扩增低拷贝的靶片段ＤＮＡ，对每克样品中
４］照基因进行拷贝数估算［，通过ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时荧光定 Ⅰ
ＣＲ法检测转基因植株中ｐｔａ基因的拷贝数。量Ｐ
１材料与方法
１．１材料１．１．１实验材料转ｐｔａ基因小麦７份：９６１４６，９６１４１０、９６１４１６、９６１４１７、陇春２２２０、陇春２２２２、陇春２２２３。以上材料均属甘肃省农科院生物技术研究所所有。１．１．２主要试剂、仪器与耗材ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ｐｅｒｆｅｃｔｒｅａｌｔｉｍｅ，ＤＲＲ０４１Ｓ）购自大连宝生物工程有限
２－０．２６６７ｘ＋６．９８；ｒ＝０．９９８，ＰＣＲ扩增效率为８４．８％。２外源基因的标准曲线为ｙ＝－０．２１１８ｘ＋４．５３，ｒ＝
，ＰＣＲ扩增效率为６２．８％。两条标准曲线的相关０．９９７系数都接近１，熔解曲线（图３、图４）均为单峰，扩增产、图６）中的荧光值能够准物特异性好，扩增曲线（图５确地反映目的产物的扩增。
ＴＭ公司，Ｃｈｒｏｍｏ４实时荧光ＰＣＲ仪（ＢｉｏＲａｄ），０．２ｍｌ平
盖低位八联管（ＢｉｏＲａｄ），微量移液器（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。
２０１０，３０（３）
１．２方法
李淑洁等：ＲＥＡＬＴＩＭＥＰＣＲ方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数
０１２３４３０１２３４
３软件采集、分析。
２结果与分析
２．１内参基因、外源基因标准曲线的建立实验选用未转基因的小麦基因组ＤＮＡ做内参基ｔａ基因的质粒作为外源基因标准品进因标准品、以含ｐ行梯度稀释。以Ｃ以起始模板拷贝数的对Ｔ值为Ｘ轴，数为Ｙ轴，分别建立了内参基因和外源基因的标准曲线。由图１、图２可见，模板ＣＴ值与该模板起始浓度或拷贝数的对数存在线性关系，内参基因标准曲线为ｙ＝
９１
１．２．５内参基因、外源基因的熔解曲线分析内参基
［５］
１．２．１ＤＮＡ提取及标准品稀释采用ＣＴＡＢ法
提
因、外源基因熔点曲线的测定均是从６５ ℃到９０ ℃，每隔
ＴＭ０．２ ℃／２ｓｅｃ测定吸光值１次ｒ
图１ｗｘ０１２基因的标准曲线Ｆｉｇ．１Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｗｘ０１２ｂｅｔｗｅｅｎＣＴｖａｌｕｅａｎｄｔｅｍｐｌａｔｅｓ
２．２转基因小麦中内参基因和外源基因的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时荧光ＰＣＲ检测检测植株中的内源基因，对于检查所提取的基因ＮＡ的质量和定量检测转基因作物是非常必要的。组ＤＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时实验从多对引物中，选择适合于ＳＰＣＲ扩增的引物ｗｘ０１２ｐｒｉｍｅｕｐｐｅｒ和ｗｘ０１２ｐｒｉｍｅｌｏｗｅｒ，扩增片段长度为１０２ｂｐ，用于特异性检测小麦本身固有的内源基因。从图７的扩增曲线可以看出，所有的小麦植株中都扩增出了内参基因，而空白对照扩增曲线一直没有扬起，即内参基因没有得到扩增，说明
１２］２０ｐｇ０ｎｇ的转基因成分进行有效检测［。同时，与 ≈１
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法相比，荧光定量ＰＣＲ技术可对ＴＤＮＡ的不同序列进行扩增，因此能实现对转基因品系中的
３］基因重组的检测［。
本研究利用农杆菌介导法获得的转半夏凝集素基因（Ｐｉｎｅｌｌｉａｔｅｒｎａｔａａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ｐｔａ）的小麦为材料，选择小麦特有的单拷贝或２拷贝的蜡质基因（ｗｘ０１２）作为内源参