细菌药敏试验及耐药机制研究进展
细菌耐药研究的进展和对策
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细菌耐药机制
1. 产生灭活酶：
1) 内酰胺酶(最大旳一类) 2) 氨基甙钝化酶等
2. 靶位变化:PBP旳数量或构造变化
3.低通透性屏障作用
1) 膜通透性下降 2) 生物被膜
4. 主动泵出(active efflux process)
5. 细菌缺乏自溶酶，对抗菌药物产生耐受
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蛋白通道：
99 95 63 91 83 86
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ESBLs 检测、判断和临床辨认
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ESBLs检测旳原理和措施
ESBLs能水解三代头孢及氨曲南 酶克制剂能克制ESBLs ESBLs旳检测措施
双纸片法、三维试验法、肉汤稀释法、VitekAMS法、E-test法、克制剂增强旳纸片扩散法 和肉汤稀释法
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第 三 代头孢菌素
过分使用后旳
选择作用
G-
G+
产 ESBL 旳
大肠杆菌，肺炎克雷 伯菌 等
高产 AMP C 酶旳
肠杆菌属菌，枸橼 酸菌，沙雷氏菌等
对第三代，及第 四代头孢菌素等 耐药
对第三代头孢菌素及 酶克制剂复合制剂 耐药
碳青霉烯类抗生素
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碳青霉烯类抗生素， 第四代头孢菌素
≤27mm
– Cefotaxime
≤27mm，
– ceftriaxone
≤25mm
• These zone diameter should increase in the presence of clavulanic acid
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查K. Pneumoniae, K.oxytoca & E. coli 菌中旳ESBLs（初步筛选法)
沈继录细菌耐药机制研究新进展
• ampC是AmpC酶的结构基因，编码产生AmpC酶蛋白 • 基因ampR、ampD、ampE、ampG 是AmpC酶的调节基因
，参与调控AmpC酶的合成过程。
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AmpC酶的基因构成
• ampR是AmpC的转录调节因子，属于LysR调节 子家族。AmpR在非诱导状态下作为ampC转录 的抑制因子，而在诱导状态下作为转录激活 因子存在。
• ESBL + AmpC • ESBL + 孔蛋白突变 – 除大肠杆菌，克雷伯菌和奇异变形杆菌外，肠杆菌科其 它细菌中也存在ESBLs ，这使确证实验更加不可靠 – 在有些实验室不能实施
• MIC与“预后”的相关性优于“耐药”机制
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CLSI 对肠杆菌科细菌的ESBL 检测和报告的建议
细菌耐药的基因机制
根据遗传特性，将细菌耐药性分为两类
1.固有性耐药：来源于该细菌本身染色体上 的耐药基因,代代相传,具有典型的种属特异 性。
2.获得性耐药：由于细菌在生长繁殖过程中 ，其DNA发生改变而使其形成或获得了耐 药性表型
CLSI有关于固有耐药的内容
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获得性耐药产生类型： 1.染色体介导的耐药性
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新折点和ESBLs的关系
• 不是所有的产ESBLs酶的菌株使用新折点 时均被检测为耐药
• 关注的是抗菌药物的MIC和药代动力学，而 不是耐药机制
• 抗菌药物的MIC是产酶菌株感染治疗预后的 最佳指标
• 采用新折点时，假如一株产ESBLs的菌株 对头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松敏感， 则不需要将“敏感” 修改为“耐药”
脓肿分枝杆菌复合群药敏试验及耐药机制研究进展
脓肿分枝杆菌复合群药敏试验及耐药机制研究进展郭明日，朱彧△，孙海柏摘要：脓肿分枝杆菌复合群是非结核分枝杆菌病中最常见的快速生长型分枝杆菌之一，对大多数抗结核药物耐药，临床治疗难度大。
脓肿分枝杆菌复合群的3个亚种对多种抗生素的敏感性存在较大差异，临床实验室对其3个亚种的准确分型鉴定对于治疗药物的选择有重要价值。
中华医学会结核病学分会制定了非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南（2020版），按照美国临床和实验室标准协会（CLSI ）分枝杆菌药敏试验标准（2018版）进行脓肿分枝杆菌药敏试验，建议根据药敏试验结果选用多药联合治疗方案。
现就脓肿分枝杆菌复合群药敏试验及对主要治疗药物的耐药机制的研究进展进行综述。
关键词：非结核分枝杆菌；微生物敏感性试验；抗药性，细菌；抗菌药；脓肿分枝杆菌复合群中图分类号：R446.5文献标志码：ADOI ：10.11958/20211209Research progress on drug sensitivity test and drug resistance mechanism ofMycobacterium abscessus complexGUO Ming-ri,ZHU Yu △,SUN Hai-bai Department of Clinical Laboratory,Haihe Hospital,Tianjin University,China Key Research Laboratory for Infectious DiseasePrevention for State Administration of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300350,China△ReviserE-mail:***************Abstract:Mycobacterium abscessus complex (MABC)is one of the most common fast-growing mycobacteria innontuberculosis mycobacterial diseases.Drug resistance to most of the antituberculosis drugs makes its clinical teratment very difficult.There are great differences in the sensitivity of the three subspecies of MABC to a variety of antibiotics.The accurate typing and identification of the three subspecies in clinical laboratory is of great value for the selection of therapeutic drugs.The tuberculosis branch of Chinese Medicine Association has formulated the guideline for the diagnosisand treatment of nontuberculosis mycobacterial disease (2020Edition),MABC susceptibility test should be carried out according to the standard of mycobacterium susceptibility test from Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)of theUnited States (2018Edition).It is suggested that multidrug combination therapy should be selected according to the results of drug sensitivity test.In order to provide reference for related research,this paper reviewed the progress of drug sensitivitytest of MABC and its resistance mechanism to main therapeutic drugs.Key words:nontuberculous mycobacteria;microbial sensitivity tests;drug resistance,bacterial;anti-bacterial agents;Mycobacterium abscessus complex基金项目：2020年度天津市卫生健康科技项目（ZC20102）；天津市津南区科技局科技项目（201805003）作者单位：天津市海河医院、天津大学海河医院检验科；国家中医药管理局传染病重点研究室（邮编300350）作者简介：郭明日（1982），男，硕士，副主任检验师，主要从事病原菌分子耐药及鉴定方面研究。
假丝酵母菌药敏检测方法及其耐药性的研究进展
ｔｅｃｍ ｌｔ ｅｉｎｓ ａｎ ｃｌ Ｊ ． ｓｃ ｉｒ ｓ １９ ， １ ｈ ｕ ｕａｖ ｌ ｅｓｒｔ ｇ ｓａ ｉ ｌ ｉ ｅ［ ］ Ｐｙｈａ Ｒｅ， ９ ２ ４ ｔ ｙ
（ ）：３ ４ ． ３ ２ ７— ８
［ ５ ｕ ｏ Ｆ ｒｎＭ，ｏｂ ｉ ． ｂ ｒｖ ｔ ｉｅｉｅ ｒｃｒ ｇ ｈ １ ］Ｈ ｄ ｎＣ，ｏｔ Ｓｕ ｈ Ｈ Ａ ｂｅｉ ｅ ｇ ｄｌ ｓｏ ｏ ｎ ｅ ｉ ａ ｄｕ ｎ ｆ ｓｉ ｔ Ｃ ｍ ｌ ｉ ｌｅｓＲ ｔ ｇ Ｓａ （ Ｉ Ｓ ｉ ｆｍｌ ｒｃｉ ［ ］ Ｊ ｕ ｕａ ｖ Ｉｎ ｓ ａ ｎ ｃｌ ＣＲ ） ｎ ａ ｉ ｐａｔ ｅ Ｊ ． ｔｅ ｌ ｉ ｅ ｙ ｃ
ｎ ｓ ｕ ｄ ｎ ｉ ｅ ｏ ｓ ｃ ｉｔ ｃ ｐ ａ ｔ ｅ ａ ｄ ｒ ｓ ａ ｃ ａ ｐ ｉａ ｉｎ ｏ ｅ ｓ ｂ ｒ ｅ ｎ ｇ ｒ ｐ ｙ ｈ ａｒ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｈ： ｐ ｌｃ ｔｏ ｆ ｉ ｃ
化疗 间歇期 延长等 ） 以便对 老年 肿瘤 患者 采取 合理 、 序 、 ， 有
Байду номын сангаас
起 推出了 Ｍ２ ７系列方案 即 “ 酵母 菌液体 培养 基稀 释法抗 真菌药敏感试验方 案”， 是酵 母菌 药物 敏感 实验 的参 考方 它 法， 规范 了酵母菌 的药物敏 感实验 。国外学者运 用此 方案进
行假丝酵母菌耐药性研究 ， 明氟康 唑 （ Ｃ ） 证 Ｆ Ｚ 的体外 最低抑 菌浓度（ Ｃ 测定结果与该药在体 内的药效 吻合。该方案规 ＭＩ ）
安 徽 医 药
Ａ ｈ ｉ ｄ ａ ａｄＰ ａｍ ｃｕｉ ｌ ｏｒａ ２ １ ｅ ；４ ２ ｎｕ ｉ ｌ ｎ ｈ ｒ ａｅｔａ ｕｎ ｌ ００Ｆ ｂ １ （ ） Ｍｅ ｃ ｃ Ｊ
细菌耐药进展
多重耐药的绿脓、不动杆菌
不动杆菌 1.外膜通透性下降 2.青霉素结合蛋白改变 3.产生各种β-内酰胺酶 A：TEM1、TEM2 B：AmpC酶 C：OXA-23酶
八 我院临床常见分离病原菌的耐药现状
绿脓杆菌：监测结果表明，治疗绿脓杆菌的最佳 抗生素为碳青霉烯类、头孢他啶、阿米卡星、哌 拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、左旋氧氟沙星、头 孢派酮/舒巴坦。
万古霉素耐药的机制
基因型：VanA、VanB、VanC、VanD，近 来文献报道还存在VanE。
VRE的细胞壁肽糖前体末端由D－丙氨酸 －D－丙氨酸改变为D－丙氨酸－D－乳酸 盐，万古霉素不能与之相结合，因此，其 不能抑制VRE的细胞壁合成而表现为耐药。
临床意义与治疗
对某些抗生素固有耐药，如头孢菌素、复 方新若明、氯洁霉素等。
PRP目前增加也十分迅速，各国报告，分别 已占肺炎球菌的20%～50%。
我国北京、上海地区报道:北京22％～37％ 上海：30.2％
耐药机制
PRP株耐药机制：4～6种PBP发生拼图样改 变，PBP/1a/1b和PBP/2a/2x/2b是β-内酰胺 类抗生素的致命靶位点，使其与青霉素的 亲合力减低 。
选择非β-内酰胺类抗生素如喹诺酮类和氨基糖苷 类敏感抗生素。
避免使用三代头孢菌素及含酶抑制剂抗生素。
七 多重耐药的绿脓、不动杆菌
绿脓杆菌耐药机制： 细菌外膜的通透性减少和排出增加 外膜的疏水屏障 孔蛋白（porins)是药物的特殊蛋白水道 *P.A: OprD的减少而耐亚胺培南 生物膜的形成 外排机制
我院1999年开始ESBLs检测工作。1999年大 肠21.5％、肺克20.2％,2000年:25.2%、26.7%, 2001年：28.8%、31.7%（中国抗生素杂志 2003，28（12）:724-726)。呈逐年上升。
与耐药机制有关药敏试验的规范化-陈东科
1. 苯唑西林纸片筛选试验
方法：使用含1μg苯唑西林纸片（而不是甲氧西林 或萘夫西林）来检测葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。 用直接菌落悬液法制备的接种物（0.5麦氏比浊浓度 菌液）接种MH琼脂平板， 待琼脂表面的水份干后， 贴苯唑西林纸片，于33℃-35℃孵育24h，测量抑菌 圈直径。
结果判断：按NCCLS/CLSI解释标准判断结果，金 黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径≤10mm为 耐药，≥13mm为敏感。除路邓葡萄球菌外的其它凝 固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径≤17mm为耐ห้องสมุดไป่ตู้， ≥18mm为敏感。
注意事项
（1）在透射光下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌
圈内有无细小菌落或轻微弥漫生长，如有说明耐药。
（2）试验温度超过35℃不能检测MRS。
（3）纸片扩散法结果如有疑问，必须进行mecA 基
因或PBP2a 测定、头孢西丁纸片试验、苯唑西林 MIC 试验或苯唑西林盐琼脂筛选试验，来确定是否
为MRS 菌株，选择其中一种试验结果进行报告。
检查有无细菌生长，任何生长都表示对苯唑西林耐
药（如图）。
注意事项：
为从凝固酶阴性葡萄球菌中检测出甲氧西林耐药 菌株，需要将琼脂平板孵育48小时。
3. 头孢西丁纸片法
方法： 应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂
平板，使用含30μg头孢西丁纸片， 35℃孵育24h（如 耐药则在孵育18h后可报告结果）。使用反射光阅读
药性，头孢西丁纸片试验是首选方法（因为头孢西丁
较苯唑西林的敏感性高，如图）。
4. mecA 基因及PBP2a 测定
方法：可采用乳胶凝集或分子生物学等方法 进行检测（有成品试剂供应）。
结果判断：mecA 基因或PBP2a（mecA 基 因表达产物）检测阳性的葡萄球菌分离株，
细菌耐药性检测方法的研究进展
细菌耐药性检测方法的研究进展马秀清;陈良安【摘要】明确致病菌的耐药特性是指导各种细菌感染性疾病治疗的关键。
常规药敏试验需要从标本中分离出菌株,操作烦琐、费时。
近年来,一些分子生物学技术在细菌耐药性检测领域取得了很大进步,但临床应用方面还有待改善。
本文重点介绍几种技术在细菌耐药性检测中的新进展,为临床实现细菌耐药性的快速准确检测提供参考。
【期刊名称】《解放军医学院学报》【年(卷),期】2015(036)004【总页数】4页(P404-406,F0003)【关键词】细菌;抗药性;药敏试验【作者】马秀清;陈良安【作者单位】解放军总医院呼吸科,北京100853【正文语种】中文【中图分类】R446.5随着抗生素的使用，耐药菌不断出现，特别是“超级耐药菌”的报道引起了全世界对细菌耐药性问题的关注。
因此，谨慎合理地使用抗生素显得尤为重要。
快速准确的检测致病菌耐药性是指导合理使用抗生素的关键。
常规的药敏试验需要从临床标本中分离出菌株，耗费时间长，且许多生长慢或不容易培养的细菌不能通过药敏试验进行耐药性检测。
近年来，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、基因芯片、飞行时间质谱、微流体芯片、全基因组测序等技术在快速检测细菌耐药性方面迅速发展。
本文就几种技术在快速检测细菌耐药性方面的新进展进行综述。
药敏试验是目前各实验室检测细菌耐药性的常规方法[1]，主要包括肉汤稀释法、琼脂稀释法、K-B纸片法、E-test实验及各种自动化药敏分析系统，如Vitek系统、MicroScan WalkAway系统、Phoenix Automated Microbiology系统等。
魏丹丹等[2]采用Vitek 2 Compact和MicroScan Walk Away 40 SI全自动微生物鉴定仪检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)的灵敏度为95.45%和93.18%，特异度为94.12%和92.68%，符合率为94.87%和92.94%，提示两种系统均可用于MRSA的检测，但前提是需要分离临床菌株。
第十三章临床微生物学检验与抗菌药物敏感性试验进展1
3). 采血次数：成人每天采血2-3次，通常间隔半小时或1小 时，在患者不同部位采血。
4). 培养方法：通常每次将血液分别加入需氧和厌氧两种培 养瓶中35C同时进行培养。每天观察结果。3天后如果 无菌生长则报告“培养48小时无菌生长”； 7天后如果 无菌生长则报告“培养7天无菌生长”。 上一页 下一页 返回
初步的推测性鉴定。
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（二）病原菌的分离培养 1. 很多细菌的形态和染色性缺乏明显特征，仅凭形态学不
能做确切的诊断，需经细菌的分离培养，甚至纯培养后 ，对细菌进行生化和血清学鉴定，方能明确感染的细菌 。 2. 原则上应对所有送检标本做分离培养，以便获得单个菌 落后进行纯培养，从而对细菌做进一步的生物学、免疫 学、致病性或细菌的药物敏感性等方面的检查，最终做 出确切的报告。 3. 细菌培养时应选择适宜的培养基，以便提供特定细菌生 长所需的必要条件。分离培养后根据菌落的大小、形态 、颜色、表面性状、透明度和溶血性等对细菌做出初步 的识别，然后根据生化反应结果及血清学试验对分离菌 做出鉴定。
（五）病原菌的核酸检测
1. 传统的微生物学鉴定技术主要根据微生物形态学和生化 等表型特征来进行。但有些试验耗时长、费用高或难以 顺利完成。随着分子生物学技术的发展，多种检测病原 菌核酸的实验技术已经被建立。这不但能有助于感染性 疾病的确诊，还能确定病原菌的基因型，使微生物学的 检测技术从细菌生物学检查进展到细菌分子生物学的鉴 定。
2. 分子生物学诊断技术常用于检测不能在体外培养或目前 的培养技术不敏感、费用高昂或耗时长的病原体。目前 常用的方法主要有聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR) 及核酸杂交技术( nucleotide hybridization)包括Southern印迹杂交(Southern blot)、Northem印迹杂交(Northern blot)、斑点杂交 (dot blot)和原位杂交(in situ hybridization，ISH) 等。
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2.铜绿假单胞菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法
试验条件
培养基 接种物 孵育 推荐的质控菌株
Mueller-Hinton 琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton 琼脂 生长法或直接菌落悬液法，相当于 0.5 麦氏标准。 35℃±2℃；空气；16-18 小时 大肠埃希菌 ATCC 25922；铜绿假单胞菌 ATCC27853； 大肠埃希菌 ATCC 35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）
细菌药敏试验及耐药机制研究 进展
（1）洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散法解释标准
试验/ 报告
抗微生物药纸片含药量 抑菌环直径（mm）
相对应 MIC 值 （μg/ml）
注释
分组
RIS
R
S
头孢类（注射药物）（包括头孢菌素Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ代）
B 头孢他啶 30μg ≤17 18-20 ≥21 ≥32 ≤8
碳青霉烯类
细菌药敏试验及耐药机制研究 进展
（1）对于从粪便中分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试 和报告氨苄西林，一种喹酮类药和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。此 外对于胃肠外分离的沙门菌属还一定要测试并报告氯霉素及 其某一种Ⅲ代头孢菌素的结果。 （2）所有确认产ESBLs的菌株应当报告为耐所有青霉素类， 头孢菌素类和氨曲南。 （3）出于对流行性，治疗及感染控制方面的考虑，应该把 从尿中分离的所有菌株做ESBLs 筛选试验作为一个基本制度。 （4）仅当被认为与临床有关时（如菌血症）才进行奇异变 形杆菌ESBLs筛选试验 （5）肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属可发展为耐药。 最初分离的敏感菌株在开始治疗3~4天内可变为耐药，因此 对重复分离菌株应重新进行药敏试验。 。
细菌药敏试验及耐药机制 研究进展
安徽省细菌耐药监控中心
细菌药敏试验及耐药机制研究进展
一、药敏试验种类
1、 纸片扩散法 2、稀释法 稀释法包括宏量肉汤稀释法(macrodilution test)、微 量肉汤稀释法(microdilution test)、琼脂稀释法(agar dilution test)。 3、E-test法
useful for S. pneumoniae.
细菌药敏试验及耐药机制研究 进展
二、药敏试验基本条件
1.肠杆菌科－纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法
培养基 接种物 孵育 推荐的质控菌 株
试验条件
Mueller-Hinton 琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton 琼脂 生长法或直接菌落悬液法，相当于 0.5 麦氏标准。 35℃±2℃；空气；16-18 小时 大肠埃希菌 ATCC 25922； 大肠埃希菌 ATCC 35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）
细菌药敏试验及耐药机制研究 进展
细菌药敏试验及耐药机制研究 进展
细菌药敏试验-宏量稀释法
•Minimal inhibitory concentration (MIC) •Reference method. Add standard inoculum to dilutions of antibiotic. Incubate overnight. MIC is lowest concentration that inhibits growth (can also be performed by agar dilution). Interpretation (S or R) is based on achievable drug levels
B 美洛培南 10μg ≤15 16-19 ≥20 ≥16 ≤4
四环素类
B 米诺环素 30μg ≤14 15-18 ≥19 ≥16 ≤4
叶酸代谢途径抑制剂
A
甲氧苄啶 /磺胺甲
1.25/23.7 5μg
≤10
11-15
≥16
噁唑
≥ 8/152
≤ 2/38
细菌药敏试验及耐药机制研究 进展
（2）洋葱伯克霍尔德菌液体稀释法、琼脂稀释法解释标准
104 cfu
mg/ml 4
2
1
0.5 0.25 0.12
0
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微量液体稀释法
细菌药敏试验及耐药机制研究 进展
细菌药敏试验- E-test法
•E-test •Strips containing a gradient of antibiotic are placed on lawn of bacteria and incubated overnight. MIC is determined at point where zone of inhibition intersects scale on strip. •Combines ease of KB with an MIC method. Particularly
细菌药敏试验及耐药机制研究 进展
4.洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法
培养基 接种物 孵育 推荐的质控菌株
试验条件 Mueller-Hinton 琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton 琼脂 生长法或直接菌落悬液法，相当于 0.5 麦氏标准。 35℃±2℃；空气；20-24 小时 大肠埃希菌 ATCC 25922；铜绿假单胞菌 ATCC27853； 大肠埃希菌 ATCC 35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）
试验/
报告 抗微生物药
S
分组
β内酰胺类/β内酰胺类抑制剂
MIC 值（μg/ml）
I
R
B
替卡西林/克拉维酸
≤16/2 32/2-64/ ≥128/2
用纸片扩散性，但在作为敏感结果报告前，应将孵育 时间延长至24小时。
细菌药敏试验及耐药机制研究 进展
3.不动杆菌属纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法
培养基 接种物 孵育 推荐的质控菌株
试验条件 Mueller-Hinton 琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton 琼脂 生长法或直接菌落悬液法，相当于 0.5 麦氏标准。 35℃±2℃；空气；20-24 小时 大肠埃希菌 ATCC 25922；铜绿假单胞菌 ATCC27853； 大肠埃希菌 ATCC 35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）