实验3 化脓性球菌的分离鉴定
微生物实验总结
灭菌：1．热力灭菌法干热灭菌法：160-170℃，2h高压蒸汽灭菌法：103.4kPa (121℃)，15-30min 2．紫外线灭菌：265-266nm，破坏DNA构型培养基：1.液体培养基——基础培养、生化反应、糖发酵管2.固体培养基（斜面培养基）——纯培养、短期保存菌株3.半固体培养基——检测细菌动力化脓性球菌的分离鉴定：致病性肠道杆菌的分离鉴定：平板划线法接种工具：接种环培养基——化脓菌：血平板，肠道菌：SS平板注意事项：菌量适当；遵守无菌操作原则，全程避免杂菌污染；划线力度、划线角度观察细菌的形态特征1.单染色法：观察细菌形态，但不能鉴别2.复染色法（观察形态，鉴别细菌）革兰染色法、抗酸染色法3.特殊染色法——特殊结构或特殊成分的染色常见应用：荚膜、芽胞、鞭毛、异染颗粒染色革兰染色法：1.涂片标记载玻片→滴加标本→用接种环涂布均匀，形成直径约1cm菌膜2.干燥：空气中，或酒精灯火焰上方热空气中3.固定：迅速通过酒精灯外焰三次，冷却4.染色初染：滴加结晶紫，覆盖菌膜，静臵1min，流水冲洗(背面) 媒染：滴加卢戈碘液，覆盖菌膜，静臵1min，流水冲洗脱色：玻片浸入95%乙醇中，冲洗至染料不再溶下为止，水洗(背面)复染：滴加石炭酸稀释复红，覆盖菌膜，静臵30s，流水冲洗(背面)5.干燥(滤纸吸干水分)、镜检(油浸镜)甘露醇发酵实验培养基：甘露醇发酵管接种工具：接种针方法1灭菌接种针2从斜面沾取菌落3接种至培养基液面下4灭菌接种针5培养18-24h结果判定阳性：蓝→黄致病性葡萄球菌血浆凝固酶实验玻片凝集试验方法1玻片划分两格2灭菌接种环3分别取盐水或兔血浆于两4取待检菌，盐水中研磨5灭菌接种环6取待检菌，兔血浆中研磨7摇动玻片，2min内观察结果判断阳性：出现凝集致病性葡萄球菌常(+)药敏试验培养基：普通平板方法：药片扩散法按照无菌操作原则，用接种环取少量纯培养物接种于平板上，反复交叉密集划线镊子灭菌，冷却，分别取4种药片，平贴于平板上，轻轻压药片间距>24mm、药片距平板边缘>15mm静臵15min，平板倒臵培养16-18h，观察结果因子血清鉴定步骤鉴定属：A-E多价血清鉴定组：A-E单价0抗体血清鉴定种：H抗体血清注意事项血清量足够，避免干燥每格研磨后，灭菌接种环，避免交叉污染2min内观察结果在SS琼脂平板上，致病性肠道杆菌菌落特征是直径小，无色或淡红色半透明，非致病性肠道杆菌的菌落特征是直径中等大小，深红色。
医学微生物学化脓性球菌
抗菌药物研究
针对化脓性球菌的抗菌药物研究主要集中在新型抗生素的发现和已有抗生素的 改良，以克服细菌耐药性问题。
新型疫苗与免疫治疗研究
新型疫苗
针对化脓性球菌感染的新型疫苗研究，旨在通过激发机体免疫反应，预防和治疗 感染。
抗菌药物的剂量和疗程
抗菌药物的剂量和疗程应根据患者的病情和医生 的建议来确定，以确保治疗效果和防止耐药性的 产生。
抗菌药物的联合应用
在某些情况下，可能需要联合应用多种抗菌药物 来治疗化脓性球菌感染。联合应用抗菌药物时应 谨慎，并遵循医生的建议。
05
化脓性球菌研究进展
耐药性与抗菌药物研究
耐药性机制
治疗。
综合治疗
在治疗过程中，应注意 休息，遵医嘱治疗，同 时保持良好的生活方式
和饮食习惯。
防止传播
在治疗过程中，应注意 防止感染传播给其他人
或动物。
抗菌药物选择与应用
1 2 3
根据病菌类型选择抗菌药物
不同类型的化脓性球菌对不同的抗菌药物敏感程 度不同，因此应根据具体的病菌类型选择合适的 抗菌药物。
免疫治疗
免疫治疗作为一种新型治疗方法，通过调节机体免疫系统，增强对化脓性球菌的 清除能力。
感染机制与防治策略研究
感染机制
深入了解化脓性球菌的感染机制，有助于为防治策略提供理 论依据，降低感染风险。
防治策略
针对化脓性球菌的防治策略研究，包括预防措施、早期诊断 和有效治疗等方面的研究。
THANKS
感谢观看
临床表现与疾病类型
疖
疖是化脓性球菌引起的皮肤感染 ，表现为局部红肿、疼痛，可形
微生物学实验设计_案例导入_皮肤化脓性病原菌的分离和鉴定
化脓性球菌的防治原则
注意个人卫生，要及时用消毒药物处理皮肤创伤（如碘酊）等 预防交叉感染，减少同带菌者或有相似症状的人有皮肤接触，
可疑体现在： （1）菌落周围出现溶血环 （2）菌落颜色为金黄色
生物化学反应鉴定： 甘露醇分解试验（+） 血浆凝固酶试验（+） 耐热核酸酶试验（+）
血清学检测SPA：协同凝集 试验（+）
引起皮肤化脓 性感染的细菌 为金黄色葡萄
球菌
致病性葡萄球菌的鉴定—血浆凝固酶实验
实验原理：许多病原性的葡萄球菌菌株在代谢过程中能产 生一种血浆凝固酶样物质，可使含有枸橼酸钠或肝素抗凝 剂的兔或人血清发生凝固，而非致病病株一般不产生此酶， 故凝固酶可作为鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。
勤洗手，勤洗澡，对于脸部的化脓，不要将其抓破或挤出，因 脸部的化脓位于危险三角区及其附近，极易引起颅内感染引起 严重后果 由于金黄色葡萄球菌易产生耐药性，治疗因根据药敏实验结果 针对性的选用窄谱抗生素，防止耐药性菌株扩散 对于反复发作的顽固性疖疮，宜采用自身菌苗进行人工自动免 疫，有一定疗效（原理是重建皮肤微生态平衡，粪菌移植也是 运用这个原理） 少熬夜，养成正常的作息习惯，多吃蔬菜水果，帮助机体恢复
皮肤化脓性病原菌的分离与鉴定
案例导入
机械学院王斌同学皮肤表面有一化脓感染病灶， 经久不愈。请设计一个方案：从脓汁中分离、鉴定 化脓性病原菌，并提出防治原则。
分析原因
皮肤表面的正常细菌群：皮肤表面常见的细菌有类白喉杆菌、凝固酶 阴性葡萄球菌、丙酸杆菌、假单孢菌、分枝杆菌、变形杆菌、大肠埃 希菌、不动杆菌、克雷伯菌等
血液标本中常见化脓性球菌的分离培养与鉴定
血液标本培养
增菌培养
标本接种于硫酸镁葡萄糖肉汤中（1:5～1： 10），37℃孵育，每日观察，连续7天。如疑有 菌生长，涂片、革兰染色、镜检，初步报告。
根据涂片结果，选择相应的抗菌药物进行初 步药敏试验
自动血培养检测系统
• 原理：细菌和真菌生长时释放CO2，通 过各种手段检测CO2来判断阴阳性
A群链球菌 “敏感”
药物敏感试验
检测分离 菌株对各种药物 的敏感性，为临 床治疗提供依据
Diameter of zone of inhibition(mm)
Antibiotic Resistant Intermediate Sensitive
Penicillin G ≤20
(S*.aureus ≤11 E.coli)
培养基的制备
基础培养基（营养肉汤） 牛肉膏 0.3% 蛋白胨 1% NaCl 0.5% pH 7.2-7.6
营养琼脂：营养肉汤添加1.5%琼脂 半固体培养基：营养肉汤添加0.25%琼脂
培养基的制备
培养基制备的基本过程
1. 调配成分：加定量蒸馏水， 准确称取各成分，混合 2. 溶解：沸水浴 3. 校正pH：用NaOH校正，高压灭菌后，下降0.1-0.2 4. 滤过澄清 5. 定容、分装：斜面（试管高度的1/3-1/4） 6. 灭菌：121℃ 15-20min
21～28
≥29
12～21
≥22
Streptomycin ≤11
12～14
≥15
Amikacin ≤14 Cefradine ≤14
15～16
≥17
15～17
≥18
Minocyline ≤14
常见病原性细菌的分离鉴定方法1
在载玻片两端滴加生理盐水一滴，用 接种环挑取待检菌(金葡菌、白葡菌)， 分别与它们研磨、混匀，滴加兔血浆1滴， 立即观察有无凝固颗粒，若有即为阳性。 此法用于测定结合型凝固酶。
二、链球菌属
葡萄球菌菌落观察（教师示教）
分别取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球 菌培养物，用分离划线方法接种血平板， 置37℃培养，18h～24h以后观察结果。
血琼脂平板中18h-24h后形成圆形隆 起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明 的菌落，不同菌种可产生金黄色、白色或 柠檬色色素。某些菌种（株）有溶血现象。
血浆凝固酶试验（教师示教）
（学生操作 ）
小结
1.一般细菌的鉴定流程 2.化脓性球菌的鉴定方法
一般细菌的鉴定流程 细菌学检验Biblioteka 采集标本和注意事项的一般程序
分离与培养 1.培养基的选用
2.培养方法
3.无菌操作
细菌的鉴定 1.涂片，革兰染色，镜检
2.生化反应
3.血清学鉴定
化脓性球菌的生物学性状
葡萄球菌 链球菌（肺炎球菌） 奈瑟菌属
麦芽糖发酵试验：分别取脑膜炎球菌、 淋球菌接种于麦芽糖发酵管中，置 37℃24h～48h观察结果。
细菌学检验的一般程序
涂片染色
初步诊 断报告
增菌
快速诊 断试验
接种平板培养基，分离单个菌落
挑取可疑菌落
涂片染色
各种鉴定试验
生化试验 血清学实验 动物试验 药敏试验
明确诊断报告
血液标本
革兰染色 染色性 形状排列
血平板分离培养 溶血现象、革兰染色
初步诊断
实验设计局部化脓性炎症病原菌的分离鉴定及敏感药物筛选
实验设计:局部化脓性炎症病原菌的分离鉴定及敏感药物筛选小组成员：范子文孙琦黄必胜雍之瑶【实验病例】刘正春，男，38岁，建筑工人，上班时被石头砸断了胳膊，由于长时间不接受正规治疗，他的胳膊上的伤口感染开始化脓，发热1天，伤口肿胀疼痛体检：体温39℃，伤口局部红肿，有黄色粘稠脓汁血象：血白细胞12x109/L，中性粒细胞80%，淋巴细胞28%。
要求：1 脓汁标本病原菌的分离和鉴定；2 选择敏感抗生素治疗【实验目的】掌握病原菌的分离和鉴定，掌握化脓性细菌的主要特点选择合理的敏感抗生素进行治疗【设计思路】球菌是细菌中的一个大类，根据格兰染色的不同，可分为革兰阳性和革兰阴性两类。
阳性：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、肠球菌等阴性：脑膜炎球菌、淋球菌等病原性球菌中常引起人类化脓性疾病的细菌，又称为化脓性球菌。
上述细菌均为化脓性球菌，它们形态、培养上各有特点，可供鉴别。
所可能用到的检查方法：染色镜检、分离培养、生化反应、血清学实验、动物接种。
所以，我们小组的实验设计即围绕取样，检查，确定，选用抗生素治疗的主线流程，结合上述检查方法，最终确定出引起患者化脓的致病菌并治疗。
【初步观察】在病例中，患者的明显体征为伤口局部红肿，有黄色粘稠脓汁，根据金黄色葡萄球菌的致病特点，在发生局部感染时，皮肤化脓感染的特点是脓汁粘稠，病灶局限，界限清楚。
其中患者黄色粘稠脓汁与此特征相符，初步怀疑为金黄色葡萄球菌，需要进一步检验。
肺炎球菌多导致呼吸道炎症，大叶性肺炎，与胳膊外伤无关，可排除。
肠球菌所致感染中常见的为心血管系统感染和尿路感染，可以排除。
脑膜炎球菌主要有呼吸道感染转变为菌血症或者败血症，可以排除。
淋球菌引起人类泌尿生殖系统急慢性化脓性感染，可以排除。
所以实验的目的为分辨引起患者伤口化脓的细菌是葡萄球菌还是链球菌，或者二者兼有。
【标本采集】在本病例中，患者为伤口感染化脓，即开放性脓肿，所以我们采取标本的方法为：用无菌棉拭采取脓液及病灶深部分分泌物。
血液标本中常见化脓性球菌的分离培养与鉴定一
会引起感染，如心内膜炎和血流感染等。
03
分离培养与鉴定
表皮葡萄球菌在血平板上形成圆形、表面干燥、凸起、灰白色至棕色的
菌落。通过染色镜检和生化试验可对表皮葡萄球菌进行鉴定。
溶血葡萄球菌
生物学特性
溶血葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，直径约1μm，常呈双排列。在固体培养基上生长的菌落直径约1mm，圆形、不透明， 边缘整齐，表面光滑、湿润、凸起、无色。
致病性
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎 、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。
分离培养与鉴定
金黄色葡萄球菌在血平板上形成圆形、表面光滑、湿润、凸起、不透明的菌落，菌落周围 可形成完全透明的溶血环。通过染色镜检和生化试验可对金黄色葡萄球菌进行鉴定。
接种工具
使用无菌接种环或针头将血液标 本接种到培养基上。
接种方法
将血液标本均匀涂布在培养基表面， 或用划线法接种，以促进菌落的生 长。
防止交叉污染
在接种过程中，要严格遵守无菌操 作规程，避免交叉污染。
培养条件
温度
化脓性球菌的生长需要适宜的温 度，一般为35-37℃。
湿度
保持培养箱内的湿度，以防止培 养基干燥。
致病性
溶血葡萄球菌可引起人类和动物感染，如尿道炎、前列腺炎、伤口感染和心内膜炎等。其致病力可能与产生毒素和其 他毒力因子有关。
分离培养与鉴定
溶血葡萄球菌在血平板上形成圆形、表面光滑、湿润、凸起、无色的菌落，菌落周围可形成完全透明的 溶血环。通过染色镜检和生化试验可对溶血葡萄球菌进行鉴定。
06
血液标本中化脓性球菌的感 染与防治
血液标本中化脓性球菌的分离培养与鉴定是临床微生物学实验室的重要工作之一 ，对于及时诊断、治疗和预防疾病具有重要意义。
脓汁中球菌的分离与鉴定.ppt
甲型溶血 性链球菌
乙型溶血 性链球菌
丙型链球 菌
溶血现象 α溶血
溶血环的 特点血
2-4mm， 完全透明
致病强
无
无
无
甲链
乙链
丙链
肺炎双球菌
生物学性状：
G+ 双球菌,菌体呈矛头状 ,宽端
相对,尖端向外.有荚膜. 营养要求高,在含有血液或血
清的培养基中才能生长 最适温度为37度,最适pH为
7.4-7.8.
• 在 血琼脂平板上,菌落呈圆形稍扁,灰白色, 细小,半透明,直径0.5-1.5mm.α溶血环, 与甲型溶血性链球菌相似,孵育时间>48h, 菌落中央呈脐状下陷.
脑膜炎双球菌
生物学性状:
G肾形或豆形双球菌,两菌接触
面平坦或稍向内陷.
营养要求高,需在含有血清, 血液的培养基中才能生长.
• 2) 沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖,不发酵乳糖,分 解葡萄糖产的酸使培养基pH下降,酚红指示剂变
黄,但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%,在斜面的
酸性物质被氧化成挥发性酸,且细菌氧化氨基酸 物质产生的氨的中和作用,是斜面变红,而底层则 为黄色.
双糖铁培养基的用途
• 用于观察细菌是否产生硫化氢及对糖的发 酵能力.
• 菌落特点: • 圆形,无色,半透明,中等大小
(四)常见培养基的特性
血琼脂平板
• 在普通琼脂培养基的 基础上加入血液制备 而成,是最常用的营养 培养基,可供营养要求 较高的细菌生长.
• 常用于分离培养和溶 血现象观察.
SS培养基
• 含有胆酸盐抑制G+, 枸橼酸钠和煌绿能部 分抑制大肠杆菌,致病 的沙门菌和志贺菌能 大量生长.
• 含有中性红指示剂和 乳糖,中性红遇酸变粉 红.
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微生物学实验三
化脓性球菌的分离鉴定
（综合性试验） 微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
录像：消毒灭菌 操作： 1. 紫外线杀菌实验（普通平板 1块/3人） 2. 抗生素敏感试验（普通平板 1块/3人） 3. 化脓性球菌分离鉴定（一）—— 接种血平板 材料：
1. 2. 3. 4. 抗生素纸片（青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素 1套/6人） 大肠杆菌、敏感金葡菌（1支/6人） 脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌 各1支/6人） 普通平板、血平板、黑纸片等
压力为15磅/寸2，30分钟可杀死一切芽胞，达到灭菌的目的。 （温度可达121℃ )
注意事项：
1. 高压的整个过程必须有专人守侯，并随时排气以 防压力表显示错误及其它原因引起高压锅内压力 剧增而导致爆炸。 2. 高压完毕需等待高压锅内压力降低至零时方可打 开取物。
紫外线杀菌原理:
波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中 以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。 紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个 胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，从而改变DNA的 分子构型，干扰DNA的复制与转录，导致细菌的死 亡或变异。
操作：
敏感金葡
贴纸片
结果分析：
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈 形成，敏感度越高抑菌圈直径越大： >20mm： 极度敏感 15-20mm： 中度敏感 抑菌圈直径 10-15mm： 轻度敏感
<10mm:
不敏感
无抑菌圈：耐药
三、化脓性球菌分离鉴定（一）
化脓性炎症是临床上常见病，除了病原性球 菌外，其他微生物也可以引起化脓性感染。
灭菌(sterilization):杀灭物体上所有微生物的 方法。
防腐(antisepsis):防止或抑制细菌生长繁殖的方法， 细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时称 为消毒剂，低浓度时为防腐剂。
无菌(asepsis):不含活菌的意思。防止细菌进入人 体或其他物品的操作技术，称无菌操作。
7. 注意操作中始终保持无菌操作
紫外线杀菌实验操作
划线、盖纸、照射
电离辐射
β射线和γ射线； 产生自由基或毒性基团，干扰DNA合成,导 致酶系统功能紊乱等; γ射线有较高穿透力； 常用于一次性医用塑料制品的消毒；也用 于食品消毒，不破坏其营养成分。
滤过除菌：
物理阻留；
用于不耐高温的血清、
物理消毒灭菌法：
干热灭菌法：焚烧、烧灼、干烤（170℃/2h） 热力灭菌法 湿热灭菌法：巴氏消毒法、流动蒸汽消毒法、 煮沸法、间歇蒸汽灭菌法、高压蒸汽灭菌法 紫外线 电磁波辐射杀菌法 电离辐射 滤过除菌法 超声波杀菌 干燥
化学消毒灭菌法：使用消毒剂
原理：
1.使菌体蛋白质变性或凝固：酚类、醇类、重金属 盐等。如石炭酸、来苏、洗必泰 2.干扰细菌的酶系统和代谢：氧化剂，如过氧化氢，
注意事项:
1.穿透力弱，一般玻璃、纸、布、尘埃、水 蒸气均能阻挡。
2.适用于空气、物体表面的消毒。
3.有效距离在2米左右（紫外灯的安装）
4.紫外线对人的眼睛、皮肤有损害作用。
操作步骤：
1. 取普通平板（1块/3人）
2. 取大肠杆菌斜面培养物在平板上密集划线
3. 用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中 4. 将平板放到紫外线下照射30分钟 5. 放37℃孵箱培养 6. 观察结果
常见的标本有脓汁、咽拭子、痰、血液、脑
脊液等。 本次实验是以脓汁标本进行病原性球菌的分 离鉴定
化脓性球菌分离鉴定步骤
37℃ 接种 血平板 脓汁 菌落 划线法 24h
革兰染色
葡萄状排列 链状操作：
1. 接种血平板（1块/人） 三线法接种分离单个菌落
思考题
1. 临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？ 2. 抗生素耐药性实验的结果是如何判定？
高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最好，运用广泛。 优点：1.能够达到较高的温度。 2.穿透力强。 3.蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热， 迅速提高冷物的温度。 4.高压蒸气不会使物品过分潮湿，避 免了水煮的缺点。
[ 教学目标 ]
了解：各种消毒灭菌的方法及应用 无菌操作技术 掌握：1.化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤 2.紫外线杀菌的原理 3.抗生素敏感实验的方法
[ 重点难点 ]
重点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板 难点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板
消毒与灭菌
概念：
消毒( disinfection):杀死物体上病原微生物， 并不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。 用以消毒的药品称为消毒剂。
COLLEGE MEDICAL SCIENCES COLLEGEOF OFBASIC BASICMEDICAL MEDICALSCIENCES SCIENCES COLLEGE OF BASIC THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY
抗生素、药液等的除菌。
高锰酸钾，过氧乙酸等
3.损伤细菌细胞膜：表面活性剂，如新洁尔灭
二、抗生素敏感试验
随着抗生素的广泛应用，耐药变异菌株日益 增加（尤其是金葡、肠道杆菌），给医疗工作带 来了不少的困难。
为正确使用抗生素，临床上常在分离致病细 菌的同时做药物敏感试验，以了解该细菌对常用 各种抗生素的敏感性。 药敏试验的常用方法：纸片法