粪便 病原菌的分离与鉴定

2
粪便标本
直接粪便检查
革兰染色 单染色 需氧培养 厌氧培养 微需氧培 养及特殊 培养
增菌培养
直接分离
动力观察及制动 试验 碱性胨水 增菌液 SS平板 碱性平板分 离 菌落形态 菌落形态 抗血清凝集 生化反应 副溶血性弧菌选 择性平板 菌落形态生化 反应
抗血清凝集 初步结果报告 生化反应
3
实验结果
1.实验材料
5
表1.培养基的制备
组号 培养基 称量(g) 水量(ml) 煮沸(次) 分装(ml) 备注(24人分)
1 营养琼脂
2,3 营养琼脂 6 营养肉汤 7,8 半固体
11.4
2.9 2.0 1.5
300
75 90 50 3 1 3 5 3 3
3瓶，500ml瓶，平板
15支，中试管，斜面 30支，小试管，液体 15支，小试管，高层
11
• 3.3糖发酵实验和半固体培养基实验。 • 紫黑色菌两支单糖发酵微量管均变色和产 气，粉红色菌葡萄糖发酵管变色不产气泡， 乳糖发酵管既不变色也不产气泡。半固体 实验中，紫黑色菌成模糊状，粉色菌成清 晰的线状。（结果见图四，图五，表二）
12
• 表2、糖发酵试验和半固体培养基实验结果
细菌种类 紫黑色菌 粉红色菌 葡萄糖 ⊕ + 乳糖 ⊕ 半固体 + -
粪便
紫黑 G－杆 粉色 G－杆
— +
⊕ +
+ —
+ +
+ +
19
图 一
20
图二 紫黑色菌革兰染色后在显微镜下的形态
21
图三 粉红色菌革兰染色后在显微镜下的形态
22
图四 糖发酵实验现象
23
图五 半固体培养基实验现象
24
图六 紫黑色菌的药敏试验
25
图七 粉色菌的药敏试验
26
粪便标本2病原菌的分离与鉴定
1
实验目的
粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目 的菌的不同而选择培养基，以利于病原菌的检出。 而且，因其各种正常菌群含量甚多，仅以染色性 和形态无法分辨是否为病原菌。常见的病原菌有 志贺氏菌属、致病性大肠杆菌属、弧菌属、沙门 氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。 这次实验中我们从粪便标本中检出的是大肠 埃希菌、痢疾志贺菌。而且，我们从这次的综合 性实验中了解到了医学微生物学主要的研究方法 和手段，掌握了微生物试验的基本技能和基本原 理，树立了牢固的无菌观念。同时培养了我们的 动手能力和表达能力。
• 由实验结果可知：说明紫黑色细菌均能分 解葡萄糖和乳糖，产酸产气，粉色菌能分解 葡萄糖，产酸不产气，不能分解乳糖，不产 酸不产气。紫黑色菌有鞭毛，粉红色菌无鞭 毛。
13
• 2.4药敏试验。 • 使用纸片琼脂扩散法，观察抑菌圈的大 小，由此判断两种菌的药物敏感性（现 象见图六，图七。结果见表3）
14
4
2.实验方法
• 2.1培养基的制备、消毒和灭菌 • 培养基制备的一般程序： • 调配→溶化→ 矫正pH →分装→灭菌→检定→保 存。 • 干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→灭菌→ 检定→保存。 • 干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放 在试管筐里，然后罩上硫酸纸，牛皮纸，用橡皮 筋扎好 →放入讲台边的高压灭菌桶或高压灭菌筐 内→送到高压灭菌室（洗刷室）。
7
2.3细菌个体形态特征的观察
• 2.3.1取两块玻片，在每块玻片上加生理盐水3～ 4ul，2滴，在斜面培养基上取紫黑色菌苔少许 （1mm小菌落的半量）与第一块玻片上的一滴盐 水混匀，再取粉红色菌苔少许（1mm小菌落的半 量）与第二块玻片上的一滴盐水混匀，涂成1cm2； 做好标志。经在空气中干燥后，再用酒精灯对其 进行固定。 • 2.3.2革兰染色。用结晶紫对以上两块已固定的玻 片进行初染1分钟，水洗；再用卢戈碘液媒染1分 钟，水洗；然后用95％乙醇对其进行脱色约20秒 钟，水洗；最后用稀释复红复染1分钟，水洗；吸 干，在显微镜下镜检。
18
表四
常见肠道感染细菌主要生化反应特征
糖酵解实验 和半固体实验 细菌种类 葡 大肠埃希菌 痢疾志贺菌 伤寒沙门菌 霍乱弧菌 幽门螺杆菌 变形杆菌 乳 半 + + + + +
⊕ ⊕ + + + 不分解糖类 ⊕ -
表五
实验结果汇总
标本
菌落
形态
痢疾 血清
糖发酵和半固体试验 葡 乳 ⊕ — 半
药敏试验 青 — — 链 庆
பைடு நூலகம்
• 2.5痢疾血清玻片凝集实验。 • 紫黑色菌与痢疾血清混合不出现凝集现象， 而粉红色菌与痢疾血清混合出现凝集现象， 说明紫黑色菌不是引起痢疾的致病菌，粉 红色菌是引起痢疾的致病菌。
15
• 在制备好培养基后，采用是平板划线分离法，将粪便标 本接种于伊红美蓝平板，从中分离出两种不同的细菌： 紫黑色具有金属光泽的菌落和粉红色半透明菌落。在显 微镜下观察时，这两种菌均为G﹣杆菌，排列不规则， 从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验，可以观 察到，紫黑色的细菌使能使葡萄糖和乳糖的试管变色和 产生气体，粉红色的细菌只能使葡萄糖的试管变色而无 气体，对乳糖无反应；经半固体动力试验，观察到紫黑 色的细菌使半固体培养基成浑浊状态，粉红色的细菌只 在接种针插入的方向聚集。由此初步推断，紫黑色的细 菌可能为大肠埃希菌，粉红色的为痢疾志贺菌（参见表 四和表五）。进行痢疾血清玻片凝集实验，紫黑色菌无 凝集现象，粉色菌有凝集现象，因此可以断定粉色菌为 痢疾志贺菌，紫黑色菌极可能为大肠埃希菌。做药敏试 验时，发现大肠埃希菌和痢疾志贺菌均对青霉素不敏感， 对庆大霉素和链霉素都敏感。
• 接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普 通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、奥林 巴斯CX21型 生物显微镜、1500W电炉、蒸馏水、 玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细 菌干粉培养基（营养琼脂、营养肉汤、半固体琼 脂）、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵微量管 （葡萄糖、乳糖）、灭菌平皿、试管（棉塞）、 刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、 橡皮筋、尺子、药勺、革兰氏染色液（结晶紫染 液、卢戈碘液、95％乙醇、稀释石炭酸复红）、 小砂轮、痢疾血清、青霉素、链霉素、庆大霉素 和生理盐水滤纸片、线绳、香柏油、擦油纸
9
3.实验结果
• 3.1细菌在固体培养基上生长特征的观察。 • 将粪便标本用平半分区划分法接种于伊红 美兰培养皿上，培养出紫黑色和粉红色两 种菌落。(见图一)
10
• 3.2革兰染色镜检。 • 取紫黑色和粉红色菌涂片，革兰染色，进 行镜检。紫黑色菌革兰染色阴性，长杆状。 粉色菌革兰染色阴性，短杆状。（见图二， 图三）
16
谢谢观赏！
THE END!
17
表 3 . 药敏试验结果 细菌 抑菌圈的直径（mm） 种类 青霉素 链霉素 庆大霉素 紫黑色菌 — 22 28 粉红色菌 10 20 28 由结果可知，两种菌青霉素的抑菌圈均小于 28mm，链霉素的抑菌圈均大于 15mm，庆大霉素的抑 菌圈均大于 15mm。故紫黑色菌和粉红色菌均对青霉 素耐药，对链霉素和庆大霉素敏感。
6
2.2细菌的分离与培养
•
• • • •
2.2.1采用平板划线分离法，将取粪便标本中混杂的多种细 菌，在伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细 菌，在37℃培养24h，从而分离出肉眼可见的单个菌落。 2.2.2细菌在固体培养基上生长特征的观察。观察形成菌 落的大小、形状、边缘、表面、溶血性、色素、透明度、 湿润度。 2.2.3细菌的纯培养。粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑 色、粉红色两种菌落。挑选这两种不同菌落分别在斜面培 养基上接种，标记，在37℃培养18h。 2.2.4细菌在斜面培养基上生长特征的观察。观察细菌的生 长量、菌苔形状、表面形状、光泽、透明度、颜色等。 2.2.5液体培养基接种法。用接种环在固体或斜面培养基上 挑选紫黑色和粉红色菌苔少许移入液体培养基管中，在接 近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液 混合于培养基中，混匀。在35℃培养4~6h，观察细菌的生 长情况
8
2.4细菌生化反应鉴定
• 2.4.1糖发酵试验。用接种针分别挑少许紫黑色和粉红色的细菌接 种到葡萄糖发酵微量管和乳糖发酵微量管中，将微量管放在平皿 盖内，在37℃下，培养24小时，观察其产酸产气情况。 • 2.4.2细菌药物敏感性试验。接种环分别取紫黑、粉红色两种菌液 3～6ul×2环，各自在两个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱 窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约 15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸 片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。 37℃18～24小时培养，观察结果。 • 2.4.3半固体接种法。接种针斜面取紫黑和粉红色的细菌，各自接 种进两个半固体培养基，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达 培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。 在37℃下,培 养24小时，观察结果。 • 2.4.4 痢疾血清玻片凝集反应。取载玻片1张，滴加痢疾血清和生 理盐水各15ul，2滴。用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落， 各自与上述混合液液滴混匀，观察结果