病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备
重要动物病原微生物的分离与鉴定
重要动物病原微生物的分离与鉴定动物疾病是农牧业生产中的一大难题，而许多疾病的病原体是微生物。
为了有效地控制和防治这些病害，分离与鉴定动物病原微生物成为一项至关重要的工作。
本文将重点介绍重要动物病原微生物的分离与鉴定方法。
I. 分离方法分离动物病原微生物的主要目的是将其从感染动物体内提取出来，并进行纯化，以获得单一菌株。
下面讨论几种常用的分离方法。
1. 直接涂片法直接涂片法是最简便的分离方法之一。
将样品（如组织、粪便、血液等）直接取少量涂于无菌玻片上，然后进行染色观察。
通过观察细菌形态、胞内结构等特征，可以初步判断病原微生物的种类。
2. 细菌培养法细菌培养法是最常用的分离方法之一。
将样品进行适当稀释后，在含有养分的琼脂平板上均匀涂布，然后在适宜温度和湿度下培养。
经过一段时间后，可以观察平板上是否有单一的菌落形成。
通过进一步的鉴定试验，可以确定其是否为目标病原微生物。
3. 病毒分离法病毒的分离相对较为复杂，通常需要使用细胞培养或小鼠接种等方法。
细胞培养法是将样品接种于培养瓶中的细胞中，借助细胞的生长状况来判断是否有病毒存在。
小鼠接种法则是将样品注射到小鼠体内，观察小鼠是否出现相应病症。
这些方法都需要一定的实验条件和设备支持。
II. 鉴定方法鉴定动物病原微生物是确定其属于何种种类的过程，常用的方法有以下几种。
1. 形态学鉴定形态学鉴定是通过观察微生物的形态特征来确定其种类。
包括细菌的形态、大小、颜色、形状等特征，以及病毒的结构和形态等。
形态学鉴定通常需要使用显微镜等实验设备，并借助专业知识进行判断。
2. 生理生化鉴定生理生化鉴定是通过微生物的生理特性和生化反应来确定其种类。
包括对微生物在特定条件下的生长特性、代谢方式、产物生成等方面的观察和实验。
这需要采用一系列专门的检测方法和试剂，如对酸碱度、气体生成、酶活性等进行检测。
3. 分子生物学鉴定分子生物学鉴定是近年来发展起来的一种鉴定方法，主要通过对微生物基因组的分析来确定其种类。
葡萄炭疽病病原菌的分离鉴定及防控药剂筛选
462023.6SINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE摘 要：从发病的‘红地球’葡萄果实上分离得到36株真菌，确定葡萄炭疽菌为优势种，且编号PTTJ033被鉴定为炭疽菌属葡萄炭疽菌（Colletotrichum viniferum ）。
选择生产上常用的6种杀菌剂对葡萄炭疽菌株进行室内药剂筛选和田间防治试验，结果表明，采用生长速率法测定6种杀菌剂的抑菌效果排序为：戊唑醇＞苯醚甲环唑＞咪鲜胺＞吡唑醚菌酯＞二氰蒽醌＞代森锰锌；田间试验的防效排序为：10%苯醚甲环唑水分散粒剂600倍＞430 g·L -1戊唑醇悬浮剂3000倍＞25%吡唑醚菌酯悬浮剂1500倍＞450g·L -1咪鲜胺水乳剂1500倍＞22.7%二氰蒽醌悬浮剂800倍＞80%代森锰锌可湿性粉剂600倍。
由此可见，本研究中三唑类药剂的杀菌效果显著优于其他药剂，将为葡萄炭疽病的有效防治提供参考。
关键词：葡萄；炭疽病；病原菌鉴定；药剂筛选中图分类号：S436.631 文献标志码：A DOI ：10.13414/ki.zwpp.2023.06.007收稿日期：2023-03-10基金项目：山东省特色小宗作物联合试验（SDICA-2019-07）；泰安市科技创新发展项目（2021NS0092） 山东省果树研究所青年科研基金项目（GSS2022QN02）作者简介：张新龙（1979—），男，高级农艺师，主要从事农药管理和技术服务工作。
E-mail:158*****************通信作者：付丽（1981—），女，助理研究员，主要从事植物病害鉴定及病原菌抗药性风险评估工作。
E-mail:*****************Isolation and Identification of Grape Anthracnose Pathogens ofCoILetotrichum viniferum and Fungicide ScreeningZHANG Xinlong 1, ZHANG Guofu 2, YANG Sumei 2, JIN Yan 2, ZHNAG Yaozhong 2, FAN Kun 3, FU Li 3*(1. Agricultural and Rural Bureau of Yanggu County, Yanggu 252300, China; 2. Shandong Institute for the Control of Agrochemicals, Jinan 250131, China;3. Shandong Institute of Pomology, Tai'an 271000, China)2023(6): 46-51Abstract: Thirty-six strains of the fungus were isolated from the infected 'Red Globe' grape fruit. Grapevineanthracnose was identified as the dominant species, and ID PTTJ033 was identified as Colletotrichum viniferum .Select six kinds of fungicides commonly used in production to carry out indoor toxicity and field control efficacy on grapevine anthracnose strains. The results showed that the order with the mycelial growth rate method was as follows: tebuconazole ＞difenoconazole ＞prochloraz ＞pyraclostrobine ＞dithianon ＞mancozeb; The order of field control efficacy was: difenoconazole 10% WG(600-fold dilution)＞tebuconazole 430 g·L -1 SC(3000-fold dilution)＞pyraclostrobine 25% SC(1500-fold dilution)＞prochloraz 450 g·L -1 EW(1500-fold dilution)＞Dithianon 22.7% SC(800-fold dilution)＞mancozeb 80% WP(600-fold dilution). It can be seen that the effect of triazole fungicides is significantly better than other fungicides in this study, which will provide reference for the field control of grape anthracnose.Key words: grape; grapevine anthracnose; pathogen identification; fungicide screening葡萄炭疽病病原菌的分离鉴定及防控药剂筛选张新龙1，张国福2，杨素梅2，金岩2，张耀中2，范昆3，付丽3*（1. 山东省阳谷县农业农村局，山东阳谷 252300；2. 山东省农药检定所，山东济南 250131；3. 山东省果树研究所，山东泰安 271000）SINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE葡萄炭疽病又名晚腐病、苦腐病，主要危害果实，同时也危害穗轴、叶片、叶柄和新梢等部位。
疫苗的制备方法
疫苗的制备方法
疫苗是一种预防疾病的有效手段，它可以激发人体免疫系统产生特定的抗体，以防止病原体进入人体并感染。
疫苗的制备方法主要分为以下几个步骤：
1. 病原体的采集和分离：首先需要采集病原体，并将其分离出来，以便在之后的制备过程中使用。
2. 病原体的培养：将分离出的病原体进行培养，以获得足够的数量用于疫苗制备。
3. 病原体的杀灭或削弱：为了确保疫苗不会致病，需要杀灭病原体或削弱其致病能力。
4. 添加佐剂：佐剂可以增强疫苗的免疫原性，使其更容易被人体免疫系统识别和产生抗体。
5. 疫苗的灌装和包装：将制备好的疫苗装入瓶子或注射器中，并加上标签和说明书。
需要注意的是，疫苗的制备方法因病原体的种类和疫苗类型而有所不同。
例如，灭活疫苗和减毒活疫苗的制备过程有所不同。
此外，疫苗制备需要经过多次严格的质量控制和检测，确保其安全有效。
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一株猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究
一株猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究猪链球菌（Streptococcus suis）是一种常见的猪类病原菌，引起猪脑膜炎、败血症、关节炎等严重疾病。
为了进行猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究，我们进行了一系列实验。
我们收集了来自猪脑膜炎、猪血液和猪关节滑液等病理标本。
将这些标本接种到含有生长培养基（如血平板、肉汤培养基）的培养皿中，经过培养后观察菌落形态和生理特性。
我们观察到猪链球菌的菌落呈乳白色或灰白色，有时伴有微小的溶血现象。
猪链球菌是革兰氏阳性球菌，具有能产生溶血素、生产多糖、氧化酶和嗜热（CAMP试验）等特征。
为了进一步确认分离的菌株是否为猪链球菌，我们进行了一系列鉴定实验。
通过形态学鉴定，我们观察到菌株是革兰氏阳性球菌，呈圆形或椭圆形，成对或链状排列。
之后，通过生理生化试验，我们发现菌株可以产生酸和气体，并能发酵多种碳水化合物，如葡萄糖、麦芽糖、乳糖等。
菌株还具有嗜热性、耐酸性和胆汁溶血性等特征。
进一步进行分子生物学鉴定，我们提取了菌株的基因组DNA，利用PCR技术扩增16S rRNA基因。
将扩增的产物进行测序和比对，我们确定了菌株的物种归属。
我们还利用多型性PCR和脉冲场凝胶电泳等技术，研究了不同分离菌株的遗传多样性和基因型。
在了解猪链球菌的分离鉴定后，我们进一步研究了其生物学特性。
我们通过生长曲线分析菌株在不同温度和pH条件下的生长情况。
结果显示，猪链球菌在37℃下呈现最佳生长，并在pH为7.2-7.4的中性环境中生长最好。
我们还研究了菌株在不同抗生素和环境因子的敏感性和耐受性。
我们通过对猪链球菌的分离鉴定及生物学特性的研究，深入了解了该病原菌的形态学特征、生理生化特性、分子生物学特征和生长特性。
这些研究为进一步探索猪链球菌的致病机理和疫苗研发提供了重要的参考。
确定养殖场病原菌的科学方法
确定养殖场病原菌的科学方法养殖业是现代农业的重要组成部分，但养殖场病原菌的存在是养殖业面临的一个重要挑战。
病原菌的存在会导致养殖动物患上疾病，造成巨大损失。
因此，及早确定养殖场病原菌并采取相应的措施是保障养殖业健康发展的关键。
本文将介绍一些科学方法来确定养殖场病原菌。
1. 病原菌鉴定确定养殖场存在的病原菌是解决问题的第一步。
鉴定病原菌的方法有很多，常用的包括：病原菌的形态特征观察，包括颜色、形状、大小等；病原菌的生理特性观察，包括耐温、耐酸碱等；病原菌的生化特性观察，包括对不同营养物质的利用能力等；以及分子生物学方法，如PCR技术，可以通过特定的引物扩增出病原菌的DNA片段进行比对鉴定。
2. 病原菌菌株的分离和培养分离和培养病原菌菌株是进一步研究和治理病害的前提。
通常，可以将病原菌从养殖场内的病害样品中分离出来，比如患病动物的組織、血液、尿液、粪便等，然后将其接种在适宜的培养基上进行培养。
培养的条件包括适当的温度、湿度、培养基的配方等，以促进病原菌的生长和繁殖。
3. 病原菌的病理学研究了解病原菌的病理学特性对制定针对性的治理方案至关重要。
通过观察病原菌对宿主的深入感染过程，如入侵机制、病原菌在宿主体内的分布等，可以了解病原菌的病原能力和传播途径。
4. 采样和监测养殖场的病原菌监测是预防疫情爆发的重要措施。
定期进行采样，并对样品进行分析，可以及早发现病原菌的存在及其数量变化。
采样可以包括空气样品、动物体表物品样品、环境样品等。
对样品的处理和分析常采用细菌培养、酶标记、PCR 等方法。
5. 养殖场卫生管理养殖场的卫生管理是防控病原菌传播的重要手段。
养殖场应加强卫生消毒工作，定期清洗养殖设施、消毒饮用水、排泄物处理等。
此外，养殖场应合理规划，避免养殖密度过大，以减少病原菌的传播。
6. 疫苗预防对于已知的病原菌，疫苗预防是有效的控制手段之一。
根据已鉴定的病原菌，科学家可以研制出相应的疫苗，通过免疫养殖动物，增强其免疫力，减轻疾病发生的风险。
病原微生物学实验设计
案例二：某病毒感染动物模型的建立与应用
实验目的
建立某病毒感染的动物模型，研 究病毒感染过程、病理变化及抗
病毒药物的效果。
实验步骤
选择合适的动物、病毒感染、观察 病理变化、抗病毒药物筛选。
实验结果
成功建立病毒感染动物模型，观察 到典型的病理变化，筛选出有效的 抗病毒药物。
案例三
实验目的
利用基因编辑技术，研究病原微生物的基因功能，寻找新的抗菌 药物靶点。
02
鉴定病原微生物的种类 、毒力、耐药性等生物 学特性。
03
评价药物、疫苗、诊断 试剂等医疗产品的有效 性及安全性。
04
为预防、诊断和治疗感 染性疾病提供科学依据 。
实验设计原则与步骤
科学性原则
实验设计应遵循科学原理，确保实验结果 的客观性和可重复性。
实验设计步骤
明确实验目的、选择实验对象、确定实验 方法、制定实验方案、实施实验、收集和 分析数据、撰写实验报告。
05
病原微生物学实验案例解 析
案例一：某病原菌的分离鉴定及药敏试验
实验目的
从临床样本中分离并鉴定 病原菌，同时进行药物敏 感性试验，为临床诊断和 治疗提供依据。
实验步骤
采集样本、病原菌分离培 养、病原菌鉴定、药敏试 验。
实验结果
获得病原菌的纯培养物， 确定病原菌种类，了解其 对不同药物的敏感性。
实验步骤
选择基因编辑工具、设计基因编辑方案、实施基因编辑、观察病 原微生物的变化。
实验结果
成功对病原微生物进行基因编辑，发现新的抗菌药物靶点，为抗 病原微生物药物的研发提供新思路。
06
实验注意事项与未来展望
实验操作规范与安全防护
严格遵守实验室安全 规定，穿戴好实验服 、手套、口罩等防护 用品。
疫苗的大致制备流程
疫苗的大致制备流程
1、病原微生物的筛选：筛选潜在的有效疫苗菌株，并从中选择能够产生足够保护力的病原微生物；
2、生物制剂的研制：根据病原菌株，经过消毒处理，细胞壁分离，细胞外蛋白消化，抗原分离，细胞内核酸提取和浓缩处理等，制备出疫苗生物制剂；
3、疫苗的检测：检测生物制剂的病原性、活性及抗原性，确定疫苗的安全性、有效性；
4、疫苗的生产：采用大规模生产技术，将生物制剂转化为可供接种的疫苗剂量；
5、疫苗的稳定性测试：确定疫苗的存储条件，灭菌处理，冷藏保存，质量控制等；
疫苗的研制及生产是一个复杂的过程，需要许多步骤和技术，从病原微生物的筛选到疫苗的生产，经历了一系列步骤，其中每一步都有自己的重要性，只有每一步都做好，才能研制出安全、有效的疫苗。
疫苗的生产工艺
疫苗的生产工艺疫苗的生产工艺一般包括以下步骤：1. 病原体培养：疫苗的制备通常从病原体培养开始。
病原体可以是病毒、细菌或其他微生物。
在实验室中，病原体通过培养基中提供的适宜条件进行增殖。
2. 病原体分离和纯化：培养后的病原体必须进行纯化和分离，以去除与疫苗制造无关的组织碎片和其他污染物。
这通常通过离心、滤过和其他分离技术来实现。
3. 病原体灭活或减毒：为了制备安全有效的疫苗，病原体必须经过灭活或减毒处理，以减少其致病性或活性。
灭活通常通过使用物理或化学方法（如加热、辐照或化学消毒剂）来实现。
减毒则是通过培养病原体在非常低剂量或非致病条件下来使其丧失部分致病性。
4. 疫苗制剂制备：经过处理的病原体通常被混合、稀释和加入特定的辅助剂，如防腐剂、稳定剂、佐剂等，以制备成适合注射的疫苗制剂。
这些辅助剂有助于增强免疫反应和稳定疫苗。
5. 疫苗灌装和注射：制备好的疫苗制剂被灌装至注射用的容器中，如玻璃或塑料瓶。
然后，在洁净的条件下进行封装和标签贴附。
6. 质量控制和检验：疫苗生产过程中需要进行严格的质量控制和检验，以确保疫苗的质量和安全性。
这包括对病原体的纯度、灭活/减毒效果、疫苗制剂的稳定性、无菌性等进行测试。
7. 疫苗存储和分发：制造完成的疫苗被存储在特定的温度条件下，以确保其有效性和稳定性。
然后，疫苗分发到接种点、医疗机构或疫苗接种站，供人们接种使用。
需要注意的是，不同类型的疫苗生产工艺可能会有所不同，具体的步骤和技术也会因疫苗种类和制造厂商而有所差异。
此外，新型疫苗技术，如基因工程和RNA 疫苗，也在不断发展和更新，可能会有新的生产工艺出现。
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一、实验目的熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。
二、实验材料患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原）三、实验药品、用具2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔四、实验操作程序（一）病原菌的分离与鉴定1 ．培养基的制备（ 1 ）普通肉汤培养基：按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。
牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。
将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。
（ 2 ）普通营养琼脂培养基普通肉汤 1000ml琼脂 20g琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。
在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。
将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。
琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。
加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。
盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。
培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。
2 ．病原菌的分离与培养分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。
体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。
内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧后的解剖刀烫烧，以杀死表面的杂菌，随即在烧灼部位刺一小孔，用灭菌的接种环（待冷 2 ～ 5 秒）伸向烧灼部小洞中，用手指将接种环轻轻旋转两次，借以达到取足材料的目的。
左手持握普通琼脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接种环在琼脂平板上分区划线接种。
划线时接种环面与平板表面成 30 ～ 40 度的角轻轻接触，在平板表面轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不要重复，否则形成菌苔。
划线完毕，盖上皿盖，接种环灭菌后放下，并在平皿底部用记号笔注明接种材料、日期及操作者代号。
也可对实质性脏器用无菌剪刀下一小块，用镊子夹住病料使其剖面接触洁净的玻片，作多个触片，染色后在显微镜下直接镜检，能快速获得结果。
鳃部：用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。
血液及体液：用无菌注射器吸取病鱼血液和体液，滴于平板涂布；或用灭菌后的接种环挑取血液和体液后于平板上划线，分离细菌。
接种后的平板经30 ℃ 左右培养 24 ～ 72h 后，检查菌落生长情况，对菌落检查的主要内容包括：（ 1 ）大小：其大小以 mm 表示，微小菌落：针尖大，直径小于 0 . 5mm ，如支原体菌落、猪丹毒杆菌菌落；小菌落：直径在 0 . 5 ～ 1 mm 之间，如嗜血杆菌、布氏杆菌菌落；中等大小的菌落：直径在 1 ～3 mm 之间，如巴氏杆菌、沙门氏杆菌菌落；大的菌落：直径大于 3mm ，如炭疽芽孢杆菌菌落等。
（ 2 ）形态：圆形，不规则形（根状、树叶状）（ 3 ）边缘：整齐，不整齐（锯齿状、虫蚀状、卷发状）（ 4 ）表面：光滑、粘液状、粗糙、荷包蛋状、漩涡状、颗粒状（ 5 ）隆起度：隆起，轻度隆起，中央隆起，平升状、扁平状，脐状（凹陷状）（ 6 ）颜色：无色、灰白色、白色、金黄色、红色、粉红色（ 7 ）透明度：透明、半透明、不透明（ 8 ）溶血性：β－溶血（完全溶血），α－溶血（不完全溶血），不溶血根据菌落数量和特征，挑选可能的病原菌菌落进一步划线纯化 1 ～ 2 次后，将经纯化的可能病原菌用于感染试验。
3 ．病原菌的确定将从患病材料中分离的所有可能病原菌经纯化和扩大培养后分别进行人工感染实验。
目前最常用的人工感染接种方法有浸泡、口服和注射法等，究竟选用哪一种方法最合适，需要根据不同的疾病类型和可能的侵入途径而定。
如体表的病，可采用浸泡法（包括创伤浸泡）；体内的疾病，可采用口服、注射法。
由于绝大部分病原菌都是条件致病菌，因此在人工感染实验时还要注意感染菌的用量，接种量过大，即使该菌并不是引起实验材料致病的病原菌，也可能会因大量菌体裂解释放的大量内毒素而使感染生物死亡，为了量化感染菌的危害程度，可以测定感染细菌对接种动物的半数致死量（ LD 50 ），根据 LD 50 的大小来判断其致病力的强弱。
只有 LD 50 相对较低、感染引起的死亡与实验材料有相同症状、并且经回接实验还能分离到相同的细菌时，才能确定所分离的细菌为引起实验材料致病的病原。
在感染实验时，感染对象要求是没有患病史的同种生物，在感染前要经过 1 ～ 2 周的暂养，感染数量要 30 尾以上（至少要 10 尾以上）。
必要时，还要将温度控制在适合疾病爆发的水平。
感染过程中要定时投饵和换水，同时安排合适的对照组。
4 ．病原菌的鉴定分别观察病原菌的形态以及检测其各种生理生化指标，通过查阅伯杰氏手册确定病原菌的种类；也可直接用细菌鉴定仪测定病原菌的种类。
（二）疫苗制备1 ．病原菌的扩大培养与分离液体培养：按配方配制 2216E 液体培养基，将培养基用三角烧瓶分装并盖上棉塞后置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，冷却后于超净工作台内加入 1ml 左右预先制备的病原菌菌液，盖上棉塞，用摇床于28~ 30 ℃ 下震荡（约 150rpm ）培养 24~48h 。
病原菌经扩大培养后以 3000~5000rpm 离心20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸缓冲液）配制成 1% 或1 ‰左右的菌悬液。
茄子瓶扩大培养：按配方配制 2216E 琼脂培养基，于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热倒入经干热消毒的茄子瓶内（每瓶约 15ml 培养基），茄子瓶用消毒棉塞封口后平放于超净工作台台面，稍予摇动使培养基平铺于瓶壁，冷却后制成茄子瓶平板。
用无菌滴管吸取预先制备的病原菌菌液，在每个茄子瓶平板表面滴加 3~4 滴，再用经灼烧消毒并冷却的玻璃涂布器将菌液涂布均匀，28~ 30 ℃ 下培养24~48h 。
用无菌 PBS 洗脱平板表面的菌苔，洗脱液经 3000~5000rpm 离心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸缓冲液）配制成约 1% 或1 ‰ 的菌悬液。
2 ．灭活化学灭活：以福尔马林作为化学灭活剂。
灭活前先确定福尔马林对该病原菌的安全灭活浓度，确定方法为：取 7 支灭菌试管，分别 5ml 加入预先制备病原菌菌液，其中 6 支装有菌液的试管分别依次加入一定量的福尔马林，使福尔马林的终浓度分别为 0.1% 、 0.2% 、 0.4% 、 0.6% 、 0.8% 、 1.0% ，另 1 支试管不加入福尔马林作为对照；于 4 ℃ 下放置 24h 后，于每支试管中分别取 0.2ml 菌液于 2216E 琼脂平板上涂布，28~ 30 ℃下培养 48h ，检测各试管内细菌的存活情况，只有没有细菌生长的对应福尔马林浓度才是该病原菌的灭活安全浓度。
向第 1 步中制备的 1% 菌悬液内添加福尔马林，使福尔马林的最终浓度达到安全灭活浓度以上，于 4 ℃ 下放置 24h ，制备灭活菌液。
其他灭活方法：除化学灭活，疫苗制备时还可采用热灭活、紫外线和超声波灭活等方法。
3 ．安全性检测活性检测：取 0.2ml 灭活菌于 2216E 琼脂平板上涂布，28~ 30 ℃ 下培养 48h ，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在。
安全检测：将所制备的灭活菌液稀释成疫苗接种所用的浓度（一般为 10 8 cfu ），用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，经 20d 观察无发病或死亡才说明该灭活细菌是安全的。
4 ．效果检测抗体效价检测：用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，连续养殖 2 个月，从第 10d 开始每隔 10d 取 3 尾以上接种生物用微量血凝板法检测其平均凝集抗体效价。
抗体效价检测方法为：抽取感染动物血液并离心分离血清，用取样器吸取 0.1ml 血清加入经灭菌的 96 孔板的 A1 孔内，在 96 孔板 A 行的其他孔内加入 0.05ml 无菌 PBS ，从 A1 孔内取 0.05ml 血清加入A2 孔内，混匀后再从 A2 孔内取 0.05ml 液体加入 A3 孔内…… ，如此重复，使 96 孔板内后 1 个孔内的血清浓度均比前 1 个孔低 1 倍（倍释法），再在 96 孔板的每个孔内加入 0.05ml 菌液（活的或灭活的均可），37 ℃ 孵育过夜后观察（最好在 96 孔板下垫一张黑纸以增加反差），出现沉淀的最高血清稀释倍数即为血清中所含抗病原菌抗体的效价。
比较不同时期内抗体效价的变化情况，确定最高抗体效价值。
一般情况下，抗体效价越高，灭活细菌作为疫苗的效果就最好。
攻毒感染实验：选择无患病史的同种同龄寄主动物（水产养殖动物）作为感染对象，用注射法进行攻毒感染。
用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，连续养殖 2 个月，从第 20d 开始每隔 20d 取 10 尾以上接种生物用活的病原菌进行感染，感染方法为。