实验化脓性球菌的分离鉴定
《病原微生物学》致病球菌(化脓性细菌)
UP
2、毒素性疾病
（1）食物中毒 （2）毒性休克综合 征毒素 （3）烫伤样皮肤综
合征
UP
（三）微生物学检查
1．直接镜检 2．分离培养鉴定 3．药物敏感性实验 4．葡萄球菌肠毒素的检测
（四）防治原则
2．注意卫生，防止医源性感染
3．根据药敏试验结果，选用敏感抗菌药物治疗, 一般可选用：红霉素、新型青霉素、庆大霉素、
1．合理使用抗生素，耐青霉素G者高达90%以上。
万古霉素或先锋霉素Ⅵ治疗 。
链球菌
二、链球菌
分布：链球菌广泛分布于自然界、人及动
物粪便和健康人鼻咽部，大多数不致病 。 链球菌属是链球菌科中最大的属，该 属现有90个种（亚种），与人类健康密切 的近10个种。
最常见的为化脓性链球菌和肺炎链球菌。
（一）生物学性状
（二）致病性
1、致病物质 荚膜 2、所致疾病 大叶性肺炎 中耳炎、乳突炎、 副鼻窦炎、脑膜炎
溶血素
神经氨酸酶
（三）诊断与防治
1、微生物学诊断：
标本采集：痰液、脓汁、血液、脑脊液
检测方法：涂片镜检
分离培养：血平板+鉴定试验
2、防治：
疫苗：多价荚膜多糖疫苗
抗菌素：青霉素（耐药菌株日益增多），头
孢菌素类等。
2．存放地点：通风不良氧分压低易形成肠毒素；
3．食物种类：含蛋白质丰富，水分多的食物
特性：小分子蛋白质，耐热，耐蛋白酶。
中毒机制 ：
1．作用于胃肠粘膜，引起充血、水肿、甚至糜烂
等炎症改变及水与电解质代谢紊乱，出现腹泻
2．刺激迷走神经的内脏分支而引起反射性呕吐。
UP
2、所致疾病
1、化脓性疾病
（1）局部感染：疖、痈、毛囊炎、伤口化脓等。 （2）全身性感染：败血症、脓毒血症等。
脓液及创伤感染分泌物的细菌学检验
标本的形态学检验
1.湿片检查 脓液标本或以无菌生理盐水稀释的标 本，加盖盖玻片。或取一滴脓液于载玻片上，然后 滴加一滴卢戈碘或0.1%亚甲蓝染液混合，加盖盖 玻片。用高倍镜观察细胞和细菌的分布、细菌的数 量和运动特性等情况。 2.固定染色检查 将标本制成涂片，进行革兰染色 或抗酸染色，必要时再加其他染色方法，用油镜观 察细菌形态结构及染色特征。
采集方法
3.特殊类型化脓性炎症 ①导管治疗引起的感染， 无菌操作将导管尖端用无菌生理盐水或培养基冲洗， 洗液立即送检培养，应同时采血培养。②蜂窝组织 炎、坏疽，用无菌生理盐水或75%乙醇擦拭清洁感 染部位，然后用注射器将少量无菌生理盐水注入病 灶，自病灶中心抽取标本。③烧伤感染部位细菌定 量培养，清洁感染部位后清创，切取3～4mm3的 活组织块送检。④手术切口部位感染，以注射器抽 取脓液或将拭子插入伤口深处采集标本。
细 菌 检 验 操 作 流 程
2.病原菌的鉴定
（1）形态染色特征鉴定 根据患者的临床表现、 细菌的形态染色特点，可以初步判断出细菌的类 属，有些细菌的特殊形态特点具有鉴定意义。如 泌尿生殖道来源的标本中，发现双肾或咖啡豆样， 凹面相对，无动力，无芽胞，或有荚膜的革兰染 色阴性双球菌时，可以判定是淋病奈瑟菌。
2.病原菌的鉴定
（4）分子生物学鉴定 分子生物学技术方法可用 于检测纯培养菌株，还可以直接检测未经分离培 养的标本中的细菌。有多种技术类型可供选择， 目前临床标本检测常用的主要是聚合酶链式反应 （PCR）方法。
2.病原菌的鉴定
（5）药物敏感试验 获得纯培养菌株或疑似致病 菌的优势生长菌株后，应该尽快通过药物敏感试 验选择有效药物，在大面积烧伤感染或脓毒血症 等危重疾病时显得尤为迫切。
标本的分离培养
化脓性细菌
第十章化脓性细菌(purulent bacterium)一、概念：化脓性细菌是一类能够感染人体并引起化脓性炎症的细菌。
二、分类：1．化脓性球菌：G+，葡萄球菌属，链球菌属G-，脑膜炎奈瑟菌，淋病奈瑟菌2．化脓性杆菌：G-，大肠埃希菌属，假单胞菌属第一节葡萄球菌属(Staphylococcus)在自然界分布广泛，是最常见的化脓性球菌。
模式代表菌株：金黄色葡萄球菌(S. aureus)一、生物学性状1．形态与染色：G+球菌，典型排列方式为葡萄串状，无特殊结构（体外）2．培养特性温度：28-38℃（37℃）；pH：4.5-9.8（7.4）培养基：普通培养基生长良好.血琼脂平板上生长繁茂并形成全透明溶血环（β溶血）菌落：中等大小（1-2mm），圆形，光滑，不透明，各种脂溶性色素3．生化反应4．分类根据色素，生化反应等不同类型，分为三种：主要性状金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌菌落色素金黄色白色白色或柠檬色血浆凝固酶＋－－α溶血素＋－－SPA ＋－－甘露醇发酵＋－－致病性强弱无5．抗原结构（1）葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A, SPA）性质：①细菌细胞壁的表面蛋白②可与人类、豚鼠、小鼠等多种哺乳动物IgG的Fc段非特异性结合，结合后的抗原抗体复合物有以下作用：a.抗吞噬b.损伤血小板，引起超敏反应c.可用于协同凝集试验（2）荚膜：黏附作用（3）多糖抗原：存在于细胞壁，为磷壁酸中的组分，分为两群A群――金黄色葡萄球菌B群――表皮葡萄球菌 (S.epidermidis)6．抵抗力（1）抵抗干燥，热（80℃，30min），盐（10-15％）（2）碱性染料敏感（结晶紫，龙胆紫）（3）耐药菌株迅速增多二、致病性（一）致病物质1．侵袭力（1）表面结构：SPA，荚膜等（2）酶类：①凝固酶(coagulase)：能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质。
是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。
医学微生物学实验指导
1．通透性学说革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。
2．等电点学说革兰阳性菌等电点（pI 2 ~3）比革兰阴性菌（pI 4 ~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。
2．革兰染色：
⑴初染：将已固定的涂片标本，加结晶紫染液于涂面上染色1 min，然后水洗。
⑵媒染：加革兰氏碘液媒染1 min，水洗。
⑶脱色：滴加95%酒精，频频摇动载玻片，斜持载玻片，使脱下的染液流下，再次滴加酒精脱色，直至流下酒精无色或稍呈淡紫色为止，水洗。
⑷复染：用稀释复红或沙黄染液复染30 s至1 min，水洗，自然干燥或吸水纸印干。
3．观察结果：
用油镜观察染好后的标本片，记录所见结果，染成紫兰色者为革兰氏阳性菌，染成红色者为革兰氏阴性菌。
注意事项
1．玻片一定要清洁无油。
2．加生理盐水切莫贪多以免难于干燥，涂片要均匀且薄。
3．固定标本时切勿过热，以免菌体变形。
4．要掌握好染色时间，尤其是酒精脱色的时间，不宜过长或过短，以脱色至涂片为灰色为宜。
高等医学院校实验教材
医学微生物与免疫学
三峡大学医学院病原生物与免疫学教研室
二00五年六月
高等医学院校实验教材
医学微生物与免疫学
实验指导
主编韩莉
副主编张昌菊宋利琼
编者（以姓氏笔画为序）
王磊朱平刘嘉刘英
宋利琼吴红艳杨建林周永芹
张颖张昌菊韩莉
三峡大学医学院生物病原部
2005年6月29日
前言
本教材由医学微生物学和医学免疫学两部分组成，通过实习课教学使学生了解和掌握医学微生物学、医学免疫学的基本实验技能操作和基本研究方法，同时也能获取相应的感性知识。为培养学生的思维能力和独立操作能力，在进行设计性实验课教学时，学生也能利用本实习指导作为工具，顺利地进行实验操作，以节省学生获取知识的时间。为此目的，对每项实验的目的及实际意义都有所交代，对实验结果的观察与分析，也予以必要的辅导。限于教学时数和条件，有些内容将以示教、电视或电影教学方式教学，这部分尤其需要加强复习，以弥补未能亲自操作之不足。有关实验课的改革设想，仍须不断地接受实践考验，发扬成绩克服缺点，以不断地充实和提高。
化脓性细菌
C反应蛋白(C reactive protein，CRP)所沉淀，CRP正常人只含微 量，急性炎症时剧增，故可用C多糖测定CRP，辅助诊断活动性风 湿热（急性炎症）
3. 分解菊糖
4. 抵抗力
– 较弱，对一般消毒剂敏感
– 对青霉素、红霉素敏感
– 表皮葡萄球菌 – 腐生葡萄球菌
金黄色色素，致病菌 凝固酶（+） 耐热核酸酶（+） 甘露醇（+） SPA （+）
白色色素，条件致病菌
白色或柠檬色，不致病
三种葡萄球菌的主要性状
性状 色素 血浆凝固酶 α溶血素 耐热核酸酶 SPA 磷壁酸类型 分解甘露醇 致病性
金黄色葡萄球菌 金黄色 + + + + 核糖醇型 + 强
2.直接涂片染色镜检 3. 分离培养与鉴定
鉴别试验：胆汁溶菌试验 菊糖发酵试验
4. 动物试验
小白鼠毒力试验：肺炎链球菌阳性，甲型链球菌阴性
（四）防治原则
• 由于肺炎球菌对多种抗生素敏感，早期治 疗通常患者可很快恢复
• 青霉素G为首选治疗药物
第三节 奈瑟菌属
奈瑟菌属（neiseria）主要寄居在人类的鼻咽部、胃 肠道和泌尿生殖道，一般不致病。
（二）培养特性
– 营养要求不高，耐盐（10%）
– 需氧或兼性厌氧 – 液体培养基中呈均匀混浊生长 – 固体培养基中菌落特征
有色菌落: 金黄色、白色、柠檬色 血平板: 透明溶血环
– 能缓慢分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖产酸 致病菌触酶阳性、分解甘露醇
（三）分类 根据色素、生化反应分3种
– 金黄色葡萄球菌
– 甲型溶血性链球菌(α-hemolytic streptococci) – 乙型溶血性链球菌(β-hemolytic streptococci) – 丙型链球菌(γ-streptococci)
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
脓汁和粪便标本中病原菌的检测（作者：bibi）目的从脓汁和粪便标本中分离、培养和检测病原体。
方法培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定。
结果脓汁标本形成黄、白两种颜色菌落，均为革兰氏阳性菌，均对青霉素和链霉素敏感；粪便标本形成紫黑和粉红色两种菌落，均为革兰氏阴性菌，对青霉素不敏感，对链霉素敏感。
四种细菌均对广谱抗菌素庆大霉素敏感。
关键词：脓汁粪便微生物细菌菌落生化鉴定药敏试验引言：常见的化脓性病原菌有葡萄球菌、链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、假单胞菌、流感杆菌等。
浓汁标本在做细菌分离培养的同时，均须直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体，芽孢有无，为临床提供最初的诊治依据。
粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。
粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基（如SS、伊红美蓝平板、碱性蛋白胨水），尽可能抑制杂菌，以利于病原菌的检出。
这次实验我们从浓汁标本中检出的是金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌，从粪便标本中检出的是大肠埃希菌、痢疾志贺菌。
更重要的是我们了解了，医学微生物学主要的研究方法和手段，掌握了微生物试验的基本技能和基本原理，树立了牢固的无菌观念。
同时培养学生自学能力、科学思维能力、动手能力和表达能力。
培养学生从临床标本中分离细菌以查找与疾病有关的病原体，为临床治疗预后调查提供一定的价值1.实验器材：接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯 CX21型生物显微镜、1500W电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子2.实验方法：2.1培养基的制备、消毒和灭菌培养基制备的一般程序：①调配→溶化→矫正pH →分装→灭菌→检定→保存。
微生物学实验设计_案例导入_皮肤化脓性病原菌的分离和鉴定
化脓性球菌的防治原则
注意个人卫生，要及时用消毒药物处理皮肤创伤（如碘酊）等 预防交叉感染，减少同带菌者或有相似症状的人有皮肤接触，
可疑体现在： （1）菌落周围出现溶血环 （2）菌落颜色为金黄色
生物化学反应鉴定： 甘露醇分解试验（+） 血浆凝固酶试验（+） 耐热核酸酶试验（+）
血清学检测SPA：协同凝集 试验（+）
引起皮肤化脓 性感染的细菌 为金黄色葡萄
球菌
致病性葡萄球菌的鉴定—血浆凝固酶实验
实验原理：许多病原性的葡萄球菌菌株在代谢过程中能产 生一种血浆凝固酶样物质，可使含有枸橼酸钠或肝素抗凝 剂的兔或人血清发生凝固，而非致病病株一般不产生此酶， 故凝固酶可作为鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。
勤洗手，勤洗澡，对于脸部的化脓，不要将其抓破或挤出，因 脸部的化脓位于危险三角区及其附近，极易引起颅内感染引起 严重后果 由于金黄色葡萄球菌易产生耐药性，治疗因根据药敏实验结果 针对性的选用窄谱抗生素，防止耐药性菌株扩散 对于反复发作的顽固性疖疮，宜采用自身菌苗进行人工自动免 疫，有一定疗效（原理是重建皮肤微生态平衡，粪菌移植也是 运用这个原理） 少熬夜，养成正常的作息习惯，多吃蔬菜水果，帮助机体恢复
皮肤化脓性病原菌的分离与鉴定
案例导入
机械学院王斌同学皮肤表面有一化脓感染病灶， 经久不愈。请设计一个方案：从脓汁中分离、鉴定 化脓性病原菌，并提出防治原则。
分析原因
皮肤表面的正常细菌群：皮肤表面常见的细菌有类白喉杆菌、凝固酶 阴性葡萄球菌、丙酸杆菌、假单孢菌、分枝杆菌、变形杆菌、大肠埃 希菌、不动杆菌、克雷伯菌等
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
脓汁和粪便标本中病原微生物的检测[摘要]通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段区别和鉴定脓汁标本中和粪便标本中细菌，检测病原微生物，并进行细菌药物敏感性试验。
[关键词]脓汁标本、粪便标本、分离培养、革兰氏染色、细菌生化反应鉴定、细菌动力学试验、细菌血清学试验、细菌药物敏感性试验前言医学微生物学检查的目的是通过病原体的分离鉴定及检测病人的免疫应答等，以达到对传染性疾病做出病原学诊断，并根据实验室检查结果进行合理的药物治疗与防护。
临床的标本常含有很多杂菌，必须进行分离和纯化。
常见的化脓性病原菌有葡萄球菌，链球菌脑膜炎球菌等。
脓汁标本在做细菌分离培养的同时，均需直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体、芽孢有无，为临床提供最初诊断。
粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基，尽可能抑制杂菌，以利于病原体的检出。
通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段可以区别和鉴定细菌的种类。
细菌药物敏感性实验可以防止细菌产生耐药性和确保治疗效果，同时也为细菌种类的鉴别提供了佐证。
1.材料与方法1.1培养基制备1.11材料天平、称量纸、药勺、干粉培养基、酒精灯、三角烧瓶、量筒、试管、试管架、5ml吸管、吸头、棉塞、标签纸、牛皮纸、皮筋1.12方法称取一定量的肉汤培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸一次，趁热分装；称取一定量的营养琼脂培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸三次（煮至刚刚冒泡，立刻置于台面，半分钟后再煮），使完全溶解，趁热分装。
（平板培养基：以无菌操作，倾注平皿10ml，琼脂完全凝固后，平板倒放，4℃冰箱保存备用。
斜面培养基：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后，4℃冰箱保存备用。
）贴上标签后灭菌使用。
1.2细菌分离培养1.2.1材料脓汁标本、粪便标本、普通营养琼脂培平板、伊红美蓝琼脂平板、接种环、酒精灯1.2.2方法接种前，接种环烧灼灭菌。
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录像：消毒灭菌 操作： 1. 紫外线杀菌实验（普通平板 1块/3人） 2. 抗生素敏感试验（普通平板 1块/3人） 3. 化脓性球菌分离鉴定（一）—— 接种血平板 材料：
1. 抗生素纸片（青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素 1套/6人） 2. 大肠杆菌、敏感金葡菌（1支/6人） 3. 脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌 各1支/6人） 4. 普通平板、血平板、黑纸片等
思考题
1. 临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？ 2. 抗生素耐药性实验的结果是如何判定？
高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最好，运用广泛。
优点：1.能够达到较高的温度。 2.穿透力强。 3.蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热， 迅速提高冷物的温度。 4.高压蒸气不会使物品过分潮湿，避 免了水煮的缺点。
物理消毒灭菌法：
干热灭菌法：焚烧、烧灼、干烤（170℃/2h） 热力灭菌法
湿热灭菌法：巴氏消毒法、流动蒸汽消毒法、
煮沸法、间歇蒸汽灭菌法、高压蒸汽灭菌法
紫外线
电磁波辐射杀菌法
滤过除菌法
电离辐射
超声波杀菌
干燥
化学消毒灭菌法：使用消毒剂
原理：
1.使菌体蛋白质变性或凝固：酚类、醇类、重金属 盐等。如石炭酸、来苏、洗必泰
灭菌(sterilization):杀灭物体上所有微生物的 方法。
防腐(antisepsis):防止或抑制细菌生长繁殖的方法， 细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时称 为消毒剂，低浓度时为防腐剂。
无菌(asepsis):不含活菌的意思。防止细菌进入人 体或其他物品的操作技术，称无菌操作。
[ 教学目标 ]
了解：各种消毒灭菌的方法及应用 无菌操作技术
掌握：1.化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤 2.紫外线杀菌的原理 3.抗生素敏感实验的方法
[ 重点难点 ]
重点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板 难点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板
消毒与灭菌
概念：
消毒( disinfection):杀死物体上病原微生物， 并不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。 用以消毒的药品称为消毒剂。
压力为15磅/寸2，30分钟可杀死一切芽胞，达到灭菌的目的。 （温度可达121℃ )
注意事项：
1. 高压的整个过程必须有专人守侯，并随时排气以 防压力表显示错误及其它原因引起高压锅内压力 剧增而导致爆炸。
2. 高压完毕需等待高压锅内压力降低至零时方可打 开取物。
紫外线杀菌原理:
波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中 以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。 紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个 胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，从而改变DNA的 分子构型，干扰DNA的复制与转录，导致细菌的死 亡或变异。
常见的标本有脓汁、咽拭子、痰、血液、脑 脊液等。
本次实验是以脓汁标本进行病原性球菌的分 离鉴定
ห้องสมุดไป่ตู้
化脓性球菌分离鉴定步骤
脓汁 接种 血平板 37℃ 菌落
划线法
24h
革兰染色
葡萄状排列 链状排列
血浆凝固酶试验 甘露醇发酵试验 血清肉汤管
成对排列
操作：
1. 接种血平板（1块/人） 三线法接种分离单个菌落
2.干扰细菌的酶系统和代谢：氧化剂，如过氧化氢， 高锰酸钾，过氧乙酸等
3.损伤细菌细胞膜：表面活性剂，如新洁尔灭
二、抗生素敏感试验
随着抗生素的广泛应用，耐药变异菌株日益 增加（尤其是金葡、肠道杆菌），给医疗工作带 来了不少的困难。
为正确使用抗生素，临床上常在分离致病细 菌的同时做药物敏感试验，以了解该细菌对常用 各种抗生素的敏感性。
药敏试验的常用方法：纸片法
操作：
敏感金葡
贴纸片
结果分析：
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈 形成，敏感度越高抑菌圈直径越大：
>20mm： 极度敏感 15-20mm： 中度敏感 抑菌圈直径 10-15mm： 轻度敏感 <10mm: 不敏感 无抑菌圈：耐药
三、化脓性球菌分离鉴定（一）
化脓性炎症是临床上常见病，除了病原性球 菌外，其他微生物也可以引起化脓性感染。
紫外线杀菌实验操作
划线、盖纸、照射
电离辐射
β射线和γ射线； 产生自由基或毒性基团，干扰DNA合成,导
致酶系统功能紊乱等; γ射线有较高穿透力； 常用于一次性医用塑料制品的消毒；也用
于食品消毒，不破坏其营养成分。
注意事项:
1.穿透力弱，一般玻璃、纸、布、尘埃、水 蒸气均能阻挡。
2.适用于空气、物体表面的消毒。 3.有效距离在2米左右（紫外灯的安装） 4.紫外线对人的眼睛、皮肤有损害作用。
操作步骤：
1. 取普通平板（1块/3人） 2. 取大肠杆菌斜面培养物在平板上密集划线 3. 用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中 4. 将平板放到紫外线下照射30分钟 5. 放37℃孵箱培养 6. 观察结果 7. 注意操作中始终保持无菌操作