基因分析的基本策略
基因组测序数据分析中常见问题及解决策略
基因组测序数据分析中常见问题及解决策略基因组测序是一项重要的技术，已经广泛应用于生物医学研究、疾病诊断和个体化治疗等领域。
然而，基因组测序数据分析过程中常会遇到一些问题，正确解决这些问题对于准确地分析基因组数据至关重要。
本文将探讨基因组测序数据分析中常见的问题，并提出解决策略。
一、质量控制问题质量控制是基因组测序数据分析的第一步，主要目的是检查测序数据的质量，并去除质量较差的数据。
常见的质量控制问题包括低质量碱基、接头污染和重复序列等。
针对这些问题，可以采取以下策略。
首先，使用质量评估工具（如FastQC）检查测序数据的质量分布。
对于低质量碱基，可以通过Trimming或过滤掉具有低质量碱基的序列来解决。
接头污染可以通过使用Trimming工具删除接头序列来解决。
对于重复序列，可以利用特定软件（如Prinseq）去除这些序列，以保证数据的准确性和可靠性。
二、序列比对问题在基因组测序数据分析中，序列比对是其中一个关键步骤，目的是将测序数据与参考基因组进行比对，并得到每个位置的reads覆盖度。
常见的问题包括参考基因组选择和序列比对比对率等。
针对这些问题，可以考虑以下解决策略。
首先，对于参考基因组的选择，应根据具体研究目的和样本特点选择最适合的参考基因组。
对于高变异的样本，可以选择一致性较高的参考基因组进行比对。
其次，比对率低的问题可以通过选择合适的比对工具来解决。
目前常用的比对工具包括Bowtie、BWA等，根据具体情况选择适合的工具进行比对。
三、变异检测问题基因组测序数据分析的主要目的之一是检测样本中的变异，包括单核苷酸变异（SNV）、插入缺失变异（Indel）等。
常见的变异检测问题包括假阳性和假阴性。
针对这些问题，可以考虑以下策略。
首先，采用多个变异检测工具进行分析，不仅能够减少假阳性结果的产生，更能提高结果的准确性。
其次，对于假阴性结果，可以根据实验的目的进行进一步的验证，如采用Sanger测序等验证方法来提高结果的可信度。
全基因组关联分析（GWAS）取样策略
全基因组关联分析（GWAS）取样策略GWAS要想做得好，材料选择是至关重要的一环。
So，小编查阅了上百篇GWAS文献，精心梳理了一套GWAS的取样策略，是不是很贴心呢？赶紧来学习一下吧！一、常见经济作物样本选择对于经济作物来说，一般都有成百上千个品系，其中包括野生种、地方栽培种、驯化种及商业品种。
一般选择多个品系来确保群体遗传多样性。
文献中常见的经济作物的样本收集于全国或者全世界各地。
表1 常见经济作物样本收集二、常见哺乳动物样本选择对于哺乳动物，一般选择雄性个体作为研究对象（除研究产奶、产仔等性状外），并且要求所研究的对象年龄相近。
下表是我们统计的一些已发表的哺乳动物取材案例，供大家参考。
表2 常见哺乳动物样本收集三、常见家禽类样本选择对于家禽而言，一般会选择家系群体（全同胞家系或半同胞家系）。
为了增加分析内容，可以构建多个家系群体进行研究。
此外，尽量使群体所有个体生长环境以及营养程度保持一致，同时家禽的年龄也尽量保持一致，这对表型鉴定的准确性有很大的帮助。
表3 常见家禽类样本收集四、林木类样本选择对于林木类，一般选择同一物种的多个样本，多个样本做到表型丰富。
表4 林木类样本收集五、其他物种样本选择对于原生生物以及昆虫等的取样策略，可以参考表5中已发表的文献。
表5 其他物种样本收集有这么多文献支持，各位看官是不是已经整明白了GWAS该如何取材呢？最后，小编再温馨提示一句，根据文献统计及项目经验，一般来说，GWAS的样本大小要不少于300个才是极好的。
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基因组测序及功能解析
基因组测序及功能解析【引言】基因组测序和功能解析是现代遗传学研究中的重要技术和方法之一。
通过对生物体基因组的测序，我们可以获取关于基因组的详细信息，进而了解其组成、结构和功能。
基因组的功能解析则指的是对基因组序列进行解读和理解，以揭示基因之间的相互作用、功能和调控机制。
本文将介绍基因组测序的基本原理和方法，以及基因组功能解析的常见策略和意义。
【基因组测序】基因组测序是指对一个生物体的整个基因组进行测序，即获取其所有基因的DNA序列信息。
其基本原理是利用高通量测序技术将DNA分子断裂、重复复制、测序和组装，最终获得完整而准确的基因组序列。
目前常用的基因组测序技术有两类：Sanger测序和下一代测序。
Sanger测序是早期开发的一种经典测序方法，基于链终止和荧光标记的原理，逐个测定每个碱基的序列。
尽管Sanger测序准确可靠，但其运行周期较长、成本较高，适用于小规模基因组测序。
相比之下，下一代测序技术（如Illumina、454和Ion Torrent等）以其高通量、高效率和低成本的特点成为当前主流。
这些技术通过将DNA分子打断成片段，并在平行的DNA模板合成、扩增和测序过程中，有效提高了测序的速度和准确度。
【基因组功能解析】基因组功能解析是对基因组序列进行解读和研究，以了解基因之间的相互作用、功能和调控机制。
基因组的功能包括编码蛋白质的基因、非编码RNA等。
基因组功能解析的目标之一是鉴定和注释基因组中的基因和功能元件，以帮助我们理解基因组的结构和功能。
基因组注释是确定基因、非编码RNA以及其他功能元件如启动子、转录因子结合位点等的位置和功能。
基因组功能解析的常见策略包括基因预测、同源序列比对、基因表达分析、DNA甲基化分析等。
基因预测是通过计算机算法和生物信息学工具对序列进行比对、搜索和分析，预测出具有编码潜力的DNA序列，即基因。
同源序列比对则是将所研究生物的基因组序列与已知的功能注释良好的生物基因组进行比对，以推断序列的功能和结构。
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的重要性
基因功能分析是理解生物学过程和疾病机制的关键，有助于发现新的治疗靶点和发展个性化医疗策略。
通过基因功能分析，可以深入了解基因与表型之间的关系，为遗传性疾病和复杂性疾病的预防、诊断 和治疗提供科学依据。
详细描述：基因变异与药物反应关联分析旨在了解不同基因变异对药物 疗效和副作用的影响。这种分析有助于实现个性化用药，提高治疗效果
并减少副作用。
通过以上三种策略，基因功能分析有助于深入了解基因与疾病的关系， 为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
基因功能研究的挑战与展望
基因功能研究的挑 战
技术限制
目前的技术手段在研究基因功能时仍存在局限性，例如难以对所有 基因进行全面研究，难以精确分析基因间的相互作用。
04
数据处理与分析
对收集到的数据进行处理、统计分析 和可视化，挖掘基因功能相关的模式 和规律。
基因表达分析
基因表达的检测方法
基因芯片技术
通过微阵列芯片检测基因 表达谱，可同时检测大量 基因的表达水平。
测序技术
利用高通量测序技术，对 特定组织或细胞中的基因 表达进行全面检测。
荧光定量PCR
通过荧光染料或探针，实 时监测PCR扩增过程中荧 光信号的变化，从而确定 基因表达量。
跨学科合作 基因功能研究需要多学科的交叉合作，包括生物 学、医学、化学、物理学等，以更全面地理解基 因的功能。
个性化医疗 随着基因功能研究的深入，将有助于实现基于个 体基因信息的个性化医疗，提高疾病预防和治疗 效果。
未来研究方向
深入研究基因间的相互作用
未来研究将更深入地探索基因间的相互作用， 以更准确地理解基因的功能。
多基因遗传病基因研究的策略和方法
多基因遗传病基因研究的策略和方法多基因遗传病是由多个基因的遗传变异所致的疾病，其研究策略和方法主要包括以下几个方面：1.基因组关联分析（GWAS）GWAS是一种广泛应用于多基因遗传病研究的方法，它通过对大量样本进行基因组分析，寻找与疾病相关的基因位点。
GWAS可以发现与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP），从而确定疾病的遗传风险因子。
GWAS的优点是可以发现新的遗传变异，但其缺点是只能发现单个基因的影响，而无法考虑基因之间的相互作用。
2.基因组学数据整合分析基因组学数据整合分析是将不同来源的基因组学数据整合起来，以发现与疾病相关的基因和通路。
这种方法可以将GWAS、转录组、蛋白质组等多种数据整合起来，从而更全面地了解疾病的遗传机制。
3.基因组学功能研究基因组学功能研究是通过对基因的功能进行研究，以了解其在疾病发生和发展中的作用。
这种方法包括基因敲除、基因表达调控、蛋白质相互作用等实验手段，可以揭示基因在疾病中的作用机制。
4.系统生物学分析系统生物学分析是将基因组学数据与生物学网络相结合，以了解基因之间的相互作用和通路。
这种方法可以揭示疾病的复杂性和多样性，从而为疾病的预防和治疗提供新的思路。
总之，多基因遗传病的研究需要综合运用多种方法和技术，以全面了解疾病的遗传机制和发展规律。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
基因功能分析的基本策略
2、双链干涉RNA的合成； 化学合成法；体外转录法
3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉： 首先，将干涉RNA转染到靶细胞； 其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-
PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上 进行监测
RT-PCR Western blot
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用：
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
转基因技术存在的问题
1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特 定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基 因组功能； 3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同， 可能出现不同表现型； 4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的 不稳定遗传。
二、稳定转染细胞
稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模 型，外源基因通过转基因过程插入到细胞染色体中，使 外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳 定表达。
RNA干涉的机制：
在植物、动物和人的细胞内存在着无活性或低活性的被 称为Dicer的由核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合体。 当细胞内出现异常双链RNA时，如病毒RNA，可以激活 Dicer，被激活的Dicer识别并将其切割成短的双链RNA， 同时生成的短的双链RNA又可以进一步激活Dicer，并 与之结合，形成的复合物称为RNA诱导的沉默复合物。 该复合物通过Dicer中的解旋酶将短的双链RNA变成互 补单链RNA，此单链RNA即可识别并结合到细胞内与其 互补的靶RNA分子上，并通过Dicer中的核酸内切酶将 靶RNA切割，使其失去功能。RNA干涉可以被认为是机 体的一种防御机制。
生物化学及分子生物学(人卫第九版)-26基因诊断与基因治疗
基因诊断与基因治疗
作者 : 李存保 单位 : 内蒙古医科大学
目录
第一节 基因诊断
第二节 基因治疗
重点难点
掌握
基因诊断与基因治疗的概念
熟悉
基因诊断技术、基因治疗的基本策略和基本程序
了解
基因诊断和基因治疗在医学中的应用
第1节
基因诊断
一、基因诊断的概念与特点
（1） 基因诊断的概念：
是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而 对疾病作出诊断的方法。
（2）直接体内疗法
临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液 和尿液等。
三、基因诊断的基本技术
（一）核酸分子杂交技术
1. Southern 印迹法 其可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺失或插入片段大小等信息。 DNA印迹一般可以显示50 bp～20 kbp的DNA片段，片段大小的信息是该技术诊断基因缺 陷的重要依据。 2. Northern 印迹法 Northern印迹法（Northern blot）能够对组织或细胞的总RNA或mRNA进行定性 或定量分析，及基因表达分析。Northern印迹杂交对样品RNA纯度要求非常高，限制了 该技术在临床诊断中的应用。
是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人 正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因 的治疗方法。它针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。
一、基因治疗的基本策略
（一）缺陷基因精确的原位修复
1.基因矫正 gene correction 致病基因的突变碱基进行纠正 2.基因置换 gene replacement 用正常基因通过重组原位替换致病基因 这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治 疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。
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•Southern blot步骤
•（1）待测核酸样品的制备：提取基因组DNA，并用 适当的限制性内切酶消化水解基因组DNA，成大小不 一的DNA片段。 •（2）待测DNA样品的电泳分离。 •（3）凝胶中核酸的变性：DNA在制备与电泳过程中 DNA片段始终保持双链结构。电泳结束后DNA变性并 转移到适当的固定支持物上才能进行Southern blot。 •变性通常用碱变性法。
将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行 Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析， 以便最终获得差异表达的目的基因。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
尽管应用 差异显示PCR方法已经取得了不少成果 ，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个 难以解决的问题：但它仍然存在几个难以解决的问题 ：(1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重 复；(2)假阳性率可以高达90%；(3)获得的差异表达序 列极少包含编码信息。
•G
•5`* GATCACTACTG •5`*G
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•G+A •甲酸 •C+T •肼
•5`*GATCACTACTG
•5`*GATCACTACT •5`*GATCACTAC
•5`*GATCACTA •5`*GATCA •5`*GA •5`*G
•5`*GATCACT •5`*GATCAC •5`*GATC •5`*GAT
•G+A
甲酸
脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A
•C+T
肼
嘧啶开环 六氢吡啶 C/T
•C
肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C
•在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有 一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。
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•5`-GATCACTACTG-3`
•硫酸二甲酯
•5`*•-GATCACTACTG-3`
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（6） Southern杂交：在将固定于膜上的DNA片段与探 针进行杂交前，必须先进行一个预杂交的过程。因为 能够结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合，在进行 杂交实验前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全 部封闭。
（7）杂交结果的检测：采用核素标记的探针或发光剂标 记的探针进行杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和X线片 装入暗盒，感光后，经冲洗，在X线片上可见黑色条带 。
•
2、化学裂解法
•
3、PCR测序技术
•
4、全自动DNA测序仪
•这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术
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•双脱氧测序方法原理
Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（ 2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核 糖的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形 成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多 核苷酸链的延伸终止。 如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多 核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短 不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加 入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止 于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分 辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
原位杂交不需要从组织提取核酸，对组织中含量 极低的靶序列有很高的灵敏度，并可完整保持组织与 细胞形态，更能准确反映出组织细胞的相互关系及功 能状态。
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根据检测对象不同可将原位杂交分为细胞内原位 杂交和组织切片原位杂交。同时原位杂交既可检测 DNA，也可检测RNA，所用探针不同而以。
4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺 凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开
5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况 ，直接读出DNA序列。
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•反应体系 碱基修饰
•
试剂
•
•G
硫酸二甲酯
碱基修饰 反应
鸟嘌呤甲基化
主链断裂 试剂
六氢吡啶
断裂点 G
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•化学裂解法（Maxam-Gilbert）
•
1977
基本步骤：
1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S），
2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、 不完全的化学修饰；
3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断 开DNA链；
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实时PCR原理是：在PCR反应体系中加入一种双色 荧光标记的寡核苷酸探针，并根据探针上荧光信号的 变化计算模板DNA含量。如：TaqMan系统
在寡核苷酸探针的5`端标记一个报告荧光染料， 3`端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激 活的报告荧光染料将能量转移给附近的猝灭染料而不 发光。当PCR产物扩增时，聚合酶遇到结合在模板上的 荧光探针时，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用， 将两种染料分离，因此根据报告荧光所发射的荧光强 度与被切探针成正比，由此可以计算出PCR产物的含量 。
•5`* GATCACTACTG
•5`*GATCACTACT
•5`*GATCACTAC •5`*GATCACTA
•5`*GATCACT
•5`*GATCAC •5`*GATCA
•5`*GATC •5`*GAT
•5`*GA •5`*G
•C•肼（加盐）
•5`*GATCACTAC •5`*GATCAC •5`*GATC
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•（3）实时PCR用于基因拷贝数分析
实时PCR根据PCR反应动力学特点设计的分析方法 。在PCR反应的初始阶段，反应体系中的模板的产物深 度较低，而引物是过量的，产物和模板复性不会形成 与引物竞争，此时产物含量呈指数增加。当PCR产物积 累后，产物的复性可以竞争引物与模板的结合，产物 增加减慢，最后进入平台期。所以对样品中的cDNA进 行定量分析的最佳时期是反应早期。有人试图依靠循 环次数减少来分析样品中的cDNA含量，但因样品的差 异使之很不可靠。在一定的循环中，mRNA丰度低的样 品产量少，可能尚不能检测，丰度高的样品可能已进 入平台期，故难以较。
实时PCR技术 5、研究基因表达产物的水平：Western Blot、
流式细胞仪（ FACS ）
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•第一节 利用DNA定性、定量分析可从不同角
度
•
对基因和基因组进行研究
•一、DNA序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化
•DNA测序技术：
•
1、双脱氧链终止法(Sanger法)
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•（2）、代表性差异分析技术
•该技术是将差减杂交与PCR有机结合形成的一种方法.主要步 骤: •1、将对照组(driver)和待测组(tester)mRNA逆转录成cDNA 片段群,接上接头进行第一次PCR扩增; •2、将两组PCR产物片段群用限制性内切酶酶切,形成平均长 度256bp的长度. •3、将接头消化,在tester组末端接上新的接头,tester组和 driver组按1:100比例混合.过量的driver可与tester中互补 的部分形成双链. •4\复性,按新接头序列设计引物进行第2轮PCR，只有tester 和tester杂合体才能和引物配对,大量拉增.
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•Southern blot 检测基因拷贝数注意事项
1、对某种生物体基因组拷贝数研究，需要 完整提取出基因组，并需要适当的限制 性内切酶酶切；
2、通常要研究的基因序列是已知的。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
•二、采用PCR技术也可以分析基因拷贝数
•原理： •细胞内DNA复制是一个复杂过程。参与复制的有多种因 素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，PCR原理与细 胞内DNA复制相似，但反应体系相对简单。 •PCR反应体系： •耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物、4 种dNTP、以及合适的缓冲液体系。 •PCR反应的基本过程：变性、退火、延伸
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•（1）差异显示PCR用于基因拷贝数分析
是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA） 结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转 录成cDNA。
根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设 计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物；同时为扩增出polyA上游 500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随 机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA 条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定 发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。
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实时PCR技术特别适合于低拷贝基因的定 量。
实时PCR需要包括热循环仪、计算机、光 学仪器用于荧光激发和收集器、数据处 理和分析软件。
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•三、原位杂交技术可以分析基因在染色体上位置
核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细 胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核 酸进行杂交，称为原位杂交。
•DNA自动测序仪
•上述两种方法都不适应大规模DNA测定需要。存在操作 步骤繁琐、效率低、速度慢的缺点，特别是读结果的读 片过程。 •1987年发明了一种准确快速的DNA测序方法，即激光 测序法和配套的自动测序仪。（用荧光染料结合引物） 。随后又发明了终止标记系统法。