第14章色谱技术
基础化学第8版-自测题及课后习题解答-第14章
=1.00×10-4 mol⋅L-1
同理计算加入 20.0；30.0μL浓度分别为 2.00×10-4 mol⋅L-1 ；3.00×10-4 mol⋅L-1 （3）利用实验获得的数据绘出标准加入法测定血清中锂含量的工作曲线（图 14-2） 。外延曲线与横 坐标轴相交，交点至原点的距离为锂的浓度c x =1.00×10-4 mol⋅L-1。 （4）血清中锂的含量 =
N =16(
2
H= 例 14-4
30cm L = =8.72×10-3cm N 3.44 × 10 3
用气相色谱法测定止痛药膏中樟脑的含量。 内标物为水合萜烯。 若取 45.2mg樟脑和 2.00mL
6.00mg⋅mL-1的水合萜烯用CCl 4 溶剂稀释到 25.00mL制成标准溶液。当进样量约为 2μL ，火焰离子检测 器响应值对樟脑和水合萜烯分别为 67.3 和 19.8。精确称取 53.6mg的止痛药膏，CCl 4 溶剂加热溶解过滤， 滤液中加入 2.00mL 6.00mg⋅mL-1的水合萜烯，最后用CCl 4 溶剂定容到 25.00mL，2μL进样量，火焰离子检 测器响应值对樟脑和水合萜烯分别为 24.9 和 13.5。测定的止痛药膏中樟脑的重量百分比（%w/w）是多 少？ 分析 由于内标物的质量和樟脑标准品的质量及各自的响应值已知，可由（14.21）式求出校正因
1.00 × 10 −4 mol ⋅ L−1 × 5.00ml =5.00×10-3mol⋅L-1 0.100ml
1
标准加入法 例 14-2 用荧光法测定复方炔诺酮片中炔雌醇（一种合成雌激素）的含量，取供试品 20 片，研细 后溶于无水乙醇中并稀释至 250.0mL，过滤，取滤液 5.00mL，稀释至 10.00mL，在激发波长 185nm和发 射波长 307nm处测定荧光强度为 61。如果炔雌醇标准品的乙醇溶液质量浓度为 1.4μg⋅mL-1在相同测定条 件下荧光强度为 65，计算出每片药中炔雌醇的含量。 分析 由于在相同测定条件下荧光强度与荧光物质的浓度成正比，则可用比例法求出样品中荧光物 质的含量。 解 比例法计算公式： 将已知代入上式： 每片药中炔雌醇的含量= 例 14-3 cx= cx=
第十四章色谱法
第十四章色谱法一、填空题1．色谱分离过程是溶质在固定相与流动相两相之间的分布，并发生一系列连续的平衡转移。
2．吸附过程的色谱分离可用吸附等温线加以描述。
常见的吸附等温线有三种类型：线性、凸型、凹型。
通常在低浓度时，每种等温线均呈线性，而在高浓度时，等温线呈凸型或凹型。
3．直线形等温线是理想的等温线，所得的色谱峰为对称峰。
4．一个组分的色谱峰，其峰位置（即保留值）可用于定性分析，峰高或峰面积可用于定量分析，峰宽可用于衡量柱效率。
5．表示试样中各组分在色谱柱中停留时间的数值，称为保留值。
6．物质在固定相和流动相之间发生的吸附、解吸或溶解、挥发的过程，称为分配过程。
7．在一定温度下，组分在两相之间的分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数。
8．分配比（容量因子）是某组分在固定相和流动相中的分配量之比。
9．分离度是两个组分保留值之差与两个组分色谱峰宽总和之半的比值。
10．两组分保留值差别的大小，反映了色谱柱选择性的高低。
11．最大允许进样量应控制在峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内。
12．固定液的选择，一般认为可以基于相似性原则。
13．在液相色谱中，液固色谱的分离机理是吸附过程。
14．在液相色谱中，液液色谱的分离机理是分配过程。
15．在液相色谱中，改变相对保留值是通过选择合适的固定相和流动相来实现的。
16．在液相色谱中，除有机溶剂外，水也是常用的溶剂和流动相。
17．在液相色谱中，常用作固定相，又可作键合固定相基体的物质是硅胶。
18．以固体吸附剂为固定相，以液体溶剂为流动相的色谱分离方法，称为吸附色谱法。
19．以固定在载体上的液体为固定相，以液体溶剂为流动相的色谱分离方法，称为分配色谱法。
20．用极性固定液分离极性组分时，分子间的作用力主要是静电力。
21．用非极性固定液分离非极性组分时，分子间的主要作用力是色散力。
22．在液液分配色谱中，常用作正相分配色谱的固定液是水。
23．在液液分配色谱中，常用作反相分配色谱的固定液是硅油。
第14 章 手性分离
对映体的药效学差异 (1) 只有一种对映体具有所要求的药理活 性。 (2) 当药物的手心中心不涉及与受体结合 时，两异构体可具有相似的活性。 (3) 两种对映体具有不同的药理活性。 (4) 对映体药理活性相同但作用程度并不 相等。
手性药物的毒理学 1. 对映体之一有毒性 抗风湿药青霉胺D-型无生物毒性，而L-型 毒性强且潜在的致癌作用。
(3) 手性固定相法 利用手性固定相与对映体相互作用，其中 一个与手性固定相生成不稳定的对映体复合物 ，由于对映体的空间结构不同，与手性固定相 相互作用强弱不同，使得两种异构体在色谱柱 上的保留时间不同，从而得到分离。 手性固定根据其化学类型可以分为：配体 交换手性固定相、环糊精手性固定相、手性聚 合物固定相、冠醚手性固定相、大环抗生素手 性固定相、“刷型”手性固定相、蛋白质手性 固定相。
对映体药代动力学差异
(1) 吸收 药物通过被动或主动运输被吸收进入体内， 被动运输没有立体选择性，而主动运输需要酶 、载体的协助而表现出一定的立体选择性。 (2) 分布 由于立体选择性，对映体与蛋白质最大结合 量和亲和力存在差异。 (3) 代谢 在相同条件下药物对映体被同一生物系统代 谢时，会出现量与质的差异。
手性药物的毛细管电泳分离研究进展 高效毛细管电泳是以高压电场为驱动力， 以毛细管为分离通道，依据样品中各组分 之间的电泳淌度或分配行为的差异而实现 的液相分离技术。 在电泳液中加入具有光学活性的分子识别 试剂与手性对映体形成不稳定性地对映体 ，从而达到手性分离的目的。
膜技术拆分 膜技术拆分是利用膜内或膜外所含有的特 定分离功能位点来拆分混合物。 根据膜的形态的不同包括液膜拆分和固膜 拆分。
在新药研发领域， 在新药研发领域，药物对映体的拆分 对分子药理学方面有特殊的贡献： 对分子药理学方面有特殊的贡献：手性 药物的研制可以导致药效作用的成倍增 加，或者毒副作用的成倍减少甚至根除 ，或导致一个具有全新药理作用的药物 产生， 产生，在新药研发领域具有极其重大的 意义。 意义。
第14章MS-仪器分析
丰度比% 0.36 0.80 31.98 97.28
同位素峰的强度：含Cl、Br和S化合物
化合物含一个Cl、Br和S时都具有比分子离子高2的同位素峰，它 们的丰度较大，很容易识别 CH3F m/z = 34，由于氟无同位素，其M + 1峰的强度是M+峰的 1％，是由一个13C贡献的 CH3Cl m/z = 50，可看出M + 2 的m/z = 52的相对强度大约是分子 离子的1/3 CH3Br m/z = 94，可见[M] : [M + 2] = 1 : 1。在MS谱中M与M + 2 峰强度相近可推断分子中含一个Br原子
3. 碎片离子(fragment ion)
分子离子产生后可能具有较高的能量，将会通过进一步裂解 或重排而释放能量，裂解后产生的离子称为碎片离子。
断裂方式 均裂：X—Y = X·+Y· 异裂：X—Y = X++Y半异裂：X+•Y = X++ Y· 已电离
1) α断裂
带有电荷的官能团与相连的α碳原子之间的断裂 含饱和杂原子 CH3CH2—I
第十四章
质谱分析法
Mass Spectrometry MS
Spectroscopy n. 光谱学, 波谱学, 光谱仪 Spectrometry n.质谱术，质谱计
主要内容
14.1 概述
14-2 质谱法基本原理及质谱仪器 14-3 质谱解析基础知识
14-4 有机波谱综合解释
§14-1 概 述
质谱法：将气态离子混合物按质荷比m/z大小
加合离子与样品分子反应
CH5
RH CH4 (M + 1)+ 准分子离子: (M ± 1)+
分析化学第14章练习题
复习提纲：第十四章气相色谱法色谱法的基本原理1. 色谱法的起源（了解）、基本原理（掌握）、仪器基本框图（掌握）、分类、特点及应用（了解）2. 色谱流出曲线及相关术语：基线：可用于判断仪器稳定性及计算检出限（掌握）峰面积（峰高）：定量基础（掌握）保留值：定性基础（掌握）；死时间、保留时间、调整保留时间；死体积、保留体积、调整保留体积；相对保留值（选择性因子）等（掌握）峰宽的各种表示及换算（掌握）3. 色谱基本原理：热力学（掌握）：分配系数K，仅与两相和温度有关，温度增加K减小分配比k，k除与两相和温度有关外（温度增加k减小）还与相比有关（相比的概念）k=t r/t0；k=K/；=K2/K1=k2/k1分离对热力学的基本要求：两组份的>1或K、k不相等；越大或K、k相差越大越容易实现分离动力学：塔板理论：理论（或有效）塔板数（柱效）及理论（有效板高）的计算公式及有关说明（掌握）；塔板理论的贡献及不足（了解）速率理论：H=A+B/u+Cu中H、A、B、C、u的含义（掌握）；减小A、B、C的手段（掌握）；u对H的影响及最佳流速和最低板高的计算公式（掌握）；填充物粒径对板高的影响（掌握）4. 分离度分离度的计算公式；R=时，完全分离；R=1时基本分离（掌握）5. 基本色谱分离方程两种表达形式要熟练掌握；改善分离度的手段：增加柱效n（适当增加柱长的前提下减小板高）、增加选择性因子（GC：改变固定相和柱温）和控制适当的容量因子k（GC：改变温度及固定相用量）（掌握）分离度与柱效、柱长、分析时间（即保留时间）之间的关系（掌握）；柱温对分离度的影响（了解）；相关例题（熟练掌握）6. 定性分析常规检测器用保留时间（相对保留值也可以）定性，但该法存在的不足要知道，双柱或多柱可提高保留时间定性的可靠性；质谱或红外等检测器有很强的定性能力（了解）7. 定量分析相对校正因子和绝对校正因子的概念（掌握）；归一化法各组分含量的计算公式（掌握）；内标法定量的计算公式（掌握相关作业）归一化法和内标法不受进样量和仪器条件变化的影响，外标法受进样量和仪器条件变化的影响较大（了解）气相色谱法1. 气相色谱法流程和适用对象；气固和气液色谱的适用对象（掌握）2. 气相色谱法的仪器：气路系统：通常采用N2、H2、Ar、He等惰性气体做载气（高压钢瓶提供），载气纯度、流速的大小及稳定性对色谱柱柱效、仪器灵敏度及整机稳定影响很大，因此载气纯度要高、流速要适当而且稳定。
第十四章质谱分析法
无机质谱仪
① 火花源双聚焦质谱仪。 ②感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）。 ③二次离子质谱仪（SIMS） 同位素质谱仪。 气体分析质谱仪。主要有呼气质谱仪，氦质 谱检漏仪等。
22
从质谱仪所用的质量分析器的不同，把质谱仪分为 双聚焦质谱仪，四极杆质谱仪，飞行时间质谱仪， 离子阱质谱仪，傅立叶变换质谱仪等。 质谱分析法主要是通过对样品的离子的质荷比的分 析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。因此， 质谱仪都必须有电离装置把样品电离为离子，有质 量分析装置把不同质荷比的离子分开,经检测器检测 之后可以得到样品的质谱图，由于有机样品,无机样 品和同位素样品等具有不同形态、性质和不同的分 析要求,所以，所用的电离装置、质量分析装置和检 测装置有所不同。但是，不管是哪种类型的质谱仪， 其基本组成是相同的。都包括真空系统、进样系统、 离子源、质量分析器、离子检测器及计算机自动控 23 制和数据处理系统。
离子源的作用使样品离子化，并使离子汇聚成具 有一定形状和能量的离子束。它是质谱仪的心脏。 离子源的结构和性质对质谱仪的分辨率、灵敏度 影响很大 使物质电离的方法很多： 电子轰击，化学电离、火花电离、ICP离子源等。
有机物分析 无机物分析
最常用的是电子轰击离子源
35
将引入的样品转化成为碎片离子的装置。根据样品
M
M e M 2e
M—分子
M —分子离子 M + 表示正离子，·表示不成对的单电子
化学键可以断裂，形成碎片离子，其进一 步断裂，形成各种质荷比不同的离子
17
各种正离子受到800~8000V的高压电场加 速，加速后的动能等于离子的位能
第14篇-维生素类药物分析
1830
第二步 求 %1cm (样)
%1cm(样)
A C(%)
l
注意：
➢ %1cm (样) %1cm (纯)
➢ C 为混合样品的浓度
第三步 换算因子
换算因数＝效价（IU / g） E%
1cm(纯)
换算因子的定义为单位 的效价
所相当
维生素A的含量用生物效价即国际单位（IU/G） 来表示。维生素A的国际单位表示如下：
A325校正 6.815A325 2.555A310 4.260A334
f A325(校正) A325 100% A325
A325校正
A325
A325校正
－3%
0
3%
（二）三氯化锑比色法 标准曲线法
1.原理：维生素A与三氯化锑的无水氯 仿溶液作用,产生不稳定的蓝色,在 618nm~620nm波长处有最大吸收,符合 Beer定律. 2.方法：取维生素A对照品，制成系列 浓度的氯仿溶液，加入一定量的三氯化 锑无水氯仿溶液，在5s～ 10s内,于 620nm波长处测定吸收度，绘制标准曲 线。按同法测定供试液的吸收度，根据 标准曲线计算含量。
三点校正法
1. 测定原理：本法是在三个波长处测得吸 收度，根据校正公式计算吸收度A校正 值后，再计算含量，故本法称为“三点 校正法”。主要基于以下两点：
（1）杂质的吸收在310~340nm波长范围内 几乎呈一条直线，且随波长的增大吸收 度减小；
（2）物质对光的吸收具有加和性。
2. 波长的选择： （1） 三点波长的选择原则为： 一点选择在Va的最大吸收波长处
• 判断差值是否超过 0.02
有一个以上
超过 0.02
无超过 0.02
• 计算 A328（校正） • 用A328计算
第14章 生物碱类药物的分析【执业药师 药物分析】
A.比色法 B.TLC C.HPLC D.UV 1.布洛芬中有关物质的检查 2.硫酸阿托品中莨菪碱的检查 3.肾上腺素中酮体的检查 4.硫酸奎宁中其他金鸡纳碱的检查
E.旋光法 答案： B；E；D；B
A.HClO4滴定液 B.NaNO2滴定液 C.NaOH滴定液
D.HCl滴定液 E.AgNO3滴定液 以下药物含量测定使用的滴定液是
溶剂的选择
Kb：10－8～10－10时 冰醋酸
10－10～10－12时 冰醋酸+醋酐
＜ 10－12时
醋酐
非水碱量法 终点的判断 电位法
指示剂法
碱性强 蓝色
常用结晶紫 次之 蓝绿色或绿色
碱性弱 黄绿色
也可用亮绿、喹那啶红、二甲基黄和橙黄Ⅳ号
生
对非水碱量法无干扰
有机酸盐和磷酸盐
弱 酸
物
碱 氢卤酸盐 有干扰
第14章 生物碱类药物的分析大多1.盐Βιβλιοθήκη 麻黄碱及其制剂的分析有 毒
2.硫酸阿托品及其制剂的分析
3.盐酸吗啡及其制剂的分析
4.磷酸可待因及其制剂的分析
5.硫酸奎宁的分析
OH CH3
1.碱性：成盐
盐 酸
CHCHNHCH3·HCl
麻 黄
2.芳环侧链有氨基醇：双 碱
盐 缩脲反应
酸 伪
3.共轭体系 CH3 4.旋光性
NO2
N
O OK
深紫色
托烷生物碱的特征反应
检查 莨菪碱 左旋 旋光法 有关物质 HPLC
含量测定 原料药 非水碱量法 片剂、注射液 UV
含量测定 CH3 N
H OH O
, H2SO4 , H2O
O
2
1∶1 HClO4
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❖ 校正保留时间（tR’） ：扣除死时间后的保留时间。 （tR’＝ tR- t0）
❖ 保留体积（VR） 、死体积（V0） 、校正保留体积（VR’） ❖ 相对保留值（r2，1）： 在相同操作条件下，待测组分与参
1.色谱技术概述
❖ 1.1概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，
色谱柱的一般结构含有固定相和流动相，根据物质
在两相间的分配行为不同，经过多次分配（吸附-
解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 ❖ 1.2特点： （1） 纯化倍数高 （2） 操作规模小，放大困难 （3） 终产品纯化 （4） 适用于价格昂贵的产品
峰面积：峰与峰底之间的面积。
标准偏差（σ）：0.607h峰高处的峰宽的1/2
区域宽度（峰宽、半高峰宽、标准偏差） W=4σ
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12
❖ （8）色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度 达传质平衡时的一段柱高（塔板高度）
❖ 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与 柱高之间的关系
❖ 理论塔板数的计算方法：
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1.3色谱的分类
1.根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类
离子交换色谱分离法
吸附色谱法 分配Biblioteka 谱法亲和色谱凝胶色谱
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2
2. 根据固定相的形状不同的分类： 柱色谱法
薄层色谱法
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3 根据流动相的物态不同的分类 ： 液相色谱（LC）：LLC、LSC 气相色谱（GC）：GLC、GSC
❖ （2）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流 出，仅有流动相流过监测器，此时流出的曲线。
❖ （3）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测器 时，监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图 形。
❖ （4）峰形：对称于峰尖的正态分布曲线。
❖ 拖尾峰、前伸峰
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洗脱曲线
返回
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2.1色谱分离的基本原理
❖ （1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值
可由Langmuir方程得出
Kd
q c
Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度
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❖ （2）阻滞因子Rf 定义：阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度 和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0） 的迁移率之比
溶质的迁移距离 Rf 流动相在色谱系统迁中移的距离
意义：在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和 力大小
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2.2色谱图及基本概念
❖ （1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分离后，随 流动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应 信号－时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或 色谱流出曲线。
9
❖ （5）洗脱体积 ❖ 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，
为洗脱体积
V eV mK dV s
❖ 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗 脱体积也有所差异
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（6）保留值
❖ 保留值：混合物中各组分在色谱柱中停留的时间或将组分 带出色谱柱所需流动相体积的数值
❖ 保留时间（tR）：从开始进样至柱出口处被测组分出现浓度 最大值所需要的时间。
盐酸胍 ❖ 极性溶剂：20% 乙醇 ❖ 表面活性剂：吐温-80 ❖ 缓冲液平衡
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5 各种色谱技术介绍
❖ 离子交换色谱 ❖ 凝胶过滤 ❖ 吸附色谱 ❖ 亲和色谱 ❖ 分配色谱 ❖ 疏水作用层析
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（1）离子交换色谱
❖ 原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合 适的缓冲液为流动相，使溶质按照其离子交 换亲合力的不同而得到分离的方法。
4.色谱分离操作
（1）装柱与平衡
➢ 调糊 ➢ 预装一定量的溶剂或缓冲液 ➢ 连续加入悬胶液 ➢ 打开出口阀：层析剂沉降 ➢ 排除空气 ➢ 检查均匀度
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（2）上样（吸附）
❖ 样品处理： ❖ (1）溶解 ❖ A. 调整浓度 ❖ B. 盐 ❖ C. pH ❖ (2) 过滤：除去不溶物 ❖ 流速：根据样品浓度与吸附速度而定 ❖ 上样量：80%吸附容量
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（3）淋洗
❖ 盐浓度 ❖ pH ❖ 表面活性剂（0.1-0.5%) ❖ 淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而
定 ❖ 防止产物丢失又要除去杂质
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（4）洗脱方法
❖ 按操作方式
❖ a 恒定洗脱 (isocratic elution)
❖ b 分步洗脱 (stage elution)
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常用的离子交换剂
❖ c 梯度洗脱 (gradient elution)
按洗脱机理
专一性洗脱（specific elution）
非专一性洗脱（nonspecific elution）
添加剂：乙二醇, NaCNS 、脲素、盐酸胍
洗脱体积：5倍床体积
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（5）清洗与再生
❖ 弱酸：HAc ❖ 碱：氨水 ❖ 促溶剂：1-3M KCNS， 6-8 M 尿素，6 M
比组分的校正保留值之比。
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(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰 峰底宽度平均值之比。
R tR2tR1 (W2W1)/2
R≥1完全分离
峰宽（W）：两侧拐点处所作的切线与峰底相交于两点， 此两点的距离。（见图）
半高峰宽（W1/2)：1/2峰高处的峰宽。 峰高：峰顶点与峰底的垂直距离。
N 5.54( tR )2 W1/2
❖ N---理论塔板数
N 16( tR )2 Wb
tR---保留时间
❖ W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度
❖ 理论塔板高度：H L---柱长
HL
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N
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3.色谱系统的基本组成
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Pharmacia Ä KTA 层析系统
4 根据流动相与固定相的极性分类 ： 正相色谱：固定相极性大于流动相 反相色谱：固定相极性小于流动相
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2.色谱分离的基本原理
任何色谱分离过程实 质上都是溶质随流动 相流动而迁移的过程 ，不同溶质在流动相 和固定相中的分配比 例不同，因而随流动 相迁移的速度不同， 从而使不同物质分离 开来。