牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立

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1型、2型牛病毒性腹泻病毒通用RT-PCR检测方法的建立与应用

981型、2型牛病毒性腹泻病毒通用RT-PCR检测方法的建立与应用曾维欢1，2，李　蓉1，2，肖望成1，2，康京丽2，黄保续2，吴发兴2，代飞燕1（1.云南农业大学，云南昆明　650201；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛　266032）摘　要：为建立一种快速检测1型、2型牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）的通用RT-PCR 方法，根据GenBank 上收录的64株1型、2型BVDV 以及1株猪瘟病毒（CSFV ）的全基因组序列，应用Primer 6.0软件设计针对5'-UTR 区域的1型、2型BVDV 特异性通用引物对，扩增目的片段，并对该方法进行特异性、敏感性、重复性试验及利用该方法开展临床样品检测。

结果显示：扩增的目的片段长度约为302 bp ；该方法的灵敏度为2.09×102 copies/μL ，无非特异性扩增，且重复性良好。

对采自山东省发病牛场的13份鼻腔棉拭子和9份牛血清临床样品进行检测，发现有8份鼻腔棉拭子和8份血清为BVDV 阳性，随机抽取4份阳性样品送测序，发现3份样品毒株为1型BVDV ，1份样品还需进一步鉴定。

本研究建立的RT-PCR 方法可实现对1型、2型BVDV 核酸的特异性检测，也可用于该病的流行病学调查研究。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；基因1型；基因2型；RT-PCR 中图分类号：S852.65 文献标识码：B 文章编号：1005-944X （2021）02-0098-06DOI ：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.02.019 开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Establishment and Application of a General RT-PCR Assay forDetection of BVDV Type 1 and 2Zeng Weihuan 1，2，Li Rong 1，2，Xiao Wangcheng 1，2，Kang Jingli 2，Huang Baoxu 2，Wu Faxing 2，Dai Feiyan 1（1. Yunnan Agricultural University ，Kunming ，Yunnan 650201，China ；2. China Animal Health and Epidemiology Center ，Shandong 266032，China ）Abstract ：In order to establish a general RT-PCR assay to rapidly detect bovine viral virus （BVDV ）type 1 and 2，the general primer was designed based on 5'UTR sequences of BVDV type 1 and 2 by Primer 6.0 software according to the analysis of complete gene sequence of 64 strains of BVDV type 1and 2 and one strain of classical swine fever virus （CSFV ）registered in GenBank ，and the target fragment was ampliﬁed ，then the speciﬁcity ，sensitivity and reproducibility of the RT-PCR method were evaluated ，and the clinical samples were tested. The results showed that the amplified target fragment was about 302 bp ；the detection limt of the method was 2.09×102 copies/μL ，with no nonspeciﬁc ampliﬁcation but good reproducibility. 13 nasal swabs and 9 bovine serum samples collected from an infected farm in Shandong Province were detected by the established method ，it was found that 8 nasal swabs and 8 sera were positive against BVDV ，then 4 of the positive samples were randomly selected to carry out virus gene sequencing and comparison ，it was found that virus of 3 samples could be identiﬁed as BVDV type 1，and the other 1 sample still needed further analysis. In conclusion ，speciﬁc detection of nucleic acids of BVDV 1 and 2 could be realized by the RT-PCR assay established in the study ，which could also be used in epidemiological investigation of BVDV .Key words ：BVDV ；genotype 1；genotype 2；RT-PCR 收稿日期：2020-11-15　修回日期：2021-01-06同等贡献作者：曾维欢，李　蓉通信作者：吴发兴。

牛病毒性腹泻病毒内标双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

通用型内标双重ＲＴ— ＰＣＲ检测方法，该方法可以监测ＲＮＡ提取与ＲＴ— ＰＣＲ反应过程，指示假阴性结果的
发生。该方法的检测灵敏度约为１００ＴＣＩＤ５。／ｍＬ，且具有较好的特异性和可重复性。通过对５６６份临床样
摘要：为了对ＢＶＤＶ－１和ＢＶＤＶ－２进行同步检测，针对不同基因型牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）基因
组高度保守的５，＿ＵＴＲ核苷酸序列设计特异性引物（扩增长度为２８８ｂｐ）。为了指示假阴性结果，以牛ＧＡＰＤＨ基因为内标基因，设计特异性引物（扩增序列长度为１５２ｂｐ）。通过反应条件的优化，建立了ＢＶＤＶ
中图分类号：￥８５２．６５９．５；Ｑ７８９文献标识码：Ａ文章编号：１００７ — ５０３８（２０１４）０１ — ００１７ — ０５
牛病毒性腹泻病毒（Ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉ —
Ｃ２４Ｖ标准毒株种毒、大肠埃希菌ＤＨ５ａ菌株、牛疱
疹病毒１型、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒核酸（从传代细胞中提取）保
存于新疆出入境检验检疫局技术中心实验室；ＭＤ－

牛病毒性腹泻病毒分型一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：为了建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）的分型检测方法，并掌握长春地区BVDV 的流行规律。

本研究根据BVDV-1型和BVDV-2型的5'-UTR 基因序列差异设计鉴别检测引物，经一步法RT-PCR 反应条件的优化，建立了BVDV 分型一步法RT-PCR 检测方法，并应用该方法对长春地区采集的380份样品进行检测。

结果表明：该方法最佳退火温度为51℃，最佳模板含量为5.7 μg ，检测牛肠道病毒（BEV ）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV ）、牛轮状病毒（BRV ）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV ）均为阴性；对BVDV-1型和BVDV-2型的检测灵敏度可以分别达到0.58 ng RNA 和0.51 ng RNA ，相对于病毒分离方法的符合率为92.31%，长春地区BVDV 阳性率为24.21%，其中BVDV-1和BVDV-2阳性率分别为15.53%和7.37%。

以上结果表明，本研究建立的BVDV 分型一步法RT-PCR 检测方法具有良好的特异性、敏感性和准确性，长春地区BVDV 的流行优势基因型为BVDV-1型。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；分型；一步法RT-PCR 检测方法；流行优势基因型中图分类号：S855.3文献标志码： A文章编号：1674-6422（2023）04-0067-07Development and Application of One-step RT-PCR Detection Method for TypingBovine Viral Diarrhea VirusJIN Yan(Changchun Vocational and Technical College, Changchun 130000, China)收稿日期：2023-02-10作者简介：金艳，女，副教授，本科，主要从事畜牧兽医教学工作通信作者：金艳，E-mail：******************牛病毒性腹泻病毒分型一步法RT-PCR 检测方法的建立及应用金艳（长春职业技术学院，长春130000）2023,31(4):67-73Abstract: In order to develop a typing detection method of bovine viral diarrhea virus (BVDV) and investigate its epidemiology in Changchun area, the primers were designed according to the difference of 5'-UTR gene sequence between BVDV-1 and BVDV-2. The one-step RT-PCR detection method was developed for BVDV typing after the optimization of reaction conditions. The optical reaction conditions were determined to be 51℃for annealing temperature and 5.7 μg for template. This one-step RT-PCR detection method had no reaction to bovine enterovirus, bovine infectious rhinotracheitis virus, bovine rotavirus and bovine respiratory syncytial virus. The sensitivity was 0.58 ng RNA for BVDV-1 and 0.51 ng RNA for BVDV-2. The coincidence rate with the virus isolation method was 92.31%. Total 380 samples were collected from Changchun area and tested for BVDV with this method. The general positive rate was 24.21%, of which the positive rates were 15.53% for BVDV-1 and 7.37% for BVDV-2. These results indicated that the one-step RT-PCR method developed here had good speciﬁ city, sensitivity and accuracy for BVDV typing and BVDV-1 was the dominant epidemic genotype in Changchun area.Key words: Bovine viral diarrhea virus; typing; one-step RT-PCR; genotype· 68 ·中国动物传染病学报2023年8月牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea, BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）引起的一种急性、接触性传染病[1-2]，BVDV属于黄病毒科瘟病毒属成员，其除感染牛以外，还可以感染猪和羊[3-4]，近年来BVDV在牛场感染情况日益严重，给养牛业带来严重经济损失[5-6]。

牛病毒性腹泻病毒1型和2型双重RT-PCR检测方法的建立

心实验室保存，牛全血、血清及牛奶样品采自于新疆不同地区奶牛场，共２６６份。
目前对ＢＶＤＶ病原检测主要有病毒分离、血清
中和试验、ＥＬＩＳＡ及ＰＣＲ等方法＿７－８］。其中ＰＣＲ方
法具有特异性强、敏感性高、便于操作等优点，已在该病的诊断中广泛应用。。但所报道的方法大多都是对单一基因的检测，不能对该病毒同时进行分
进行基因分型检测尤为重要。
ＯｒｅｇｏｎＣ２４Ｖ株，由新疆出入境检验检疫局技术中心实验室保存；ＢＶＤＶ２型ＮｅｗＹｏｒｋ９３株，由美国俄亥俄州动物疾病诊断中心张彦教授惠赠；牛肾传代细胞（ＭＤＢＫ）、ＢＶＤＶ阴性血清、猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛蓝舌病病毒、牛副流感病毒、口蹄疫病毒核酸等由新疆出入境检验检疫局技术中
预期大小相符。经反应条件优化，该方法的灵敏度为１Ｏ。ＴＣＩＤ。，与不加内标检测灵敏度相当。经临床样品
检测验证，该方法具有较好的特异性和重复性，可用来对牛病毒性腹泻病毒分型进行快速准确的检测。关键词：牛病毒性腹泻病毒；ＧＡＰＤＨ基因；基因分型；内标；双重ＲＴ — ＰＣＲ
１材料与方法
１．１材料

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

Ａｂｓｔｒａｃｔ：【ＯＭｅｃｔｌｖｅ】Ｔｈｅｒｅｓｅａｌ￣ｈｗａｓａｉｍｅｄｓｔｏｄｅｖｅｌｏｐａＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｒｅａｌ — ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ
速诊断和流行病学调查。
关键词：牛病毒性腹泻病毒；实时荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ中圈分类号：￥８５２．６文献标识码：Ａ文章编号：１００１— ４３３０（２０１４）０２— ０３３３— ０７
摘要：【目的】在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）的实时荧光定量ＲＴ— ＰＣＲ检测
方法。【方法】根据Ｇｅｎ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ａｎｋ公布的ＢＶＤＶ５端非编码区（５ＵＴＲ）核苷酸序列，软件分析后设计特异性扩增
—
ＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ（ＢＶＤＶ）．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏ
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＣｂ；，Ｓｈｉｈｅｚｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ８３２０００，；Ｃｈｉｎａ；２．ＢａｙｉｎｇｏｌｉｎＶｏｃａｔｉｏｎａｌａｎｄＴｅｃｈｎｃｉａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｋｏｒｌａ，ＢａＹｉｎＧｕｏＬｅｎｇＴｅｃｈｏｌｎｏｇｙＣｏｌｌｅｇｅ，ＫｕｅｄｅＸｉｎｊｉａｎｇ，８４１０００，Ｃｈｉｎａ）

牛病毒性腹泻病毒鉴定及分型RT-PCR检测方法的建立

控意义重大。ＢＶＤＶ是一种单股正链ＲＮＡ病毒，成熟的
ＢＶＤＶ病毒颗粒呈球状，直径大约４６ｎｍ。在非致病毒株上大约有１２３００个碱基。ＢＶＤＶ在分类上属于黄病毒科瘟病毒属。根据同源基因和结构特征进行划分，黄病毒科成员还包括西尼罗河病毒、登革热病毒、黄热病病毒和丙型肝炎病毒。ＢＶＤＶ整个基因组由３ＵＴＲ、ＯＲＦ编码区和５ＵＴＲ共同组成一个大的开放阅读框架，能编码所有的病毒蛋白。
（１．中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林长春１３０１１２；２．内蒙古农业大学兽医学院／农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特０１００１８）
关键词：牛病毒性腹泻病毒；鉴定；分型；分类号：Ｓ８５２．６５３；Ｑ７８９
文献标识码：Ａ
文章编号：１００７—５０３８（２０１８）１００００６—０７
牛病毒性腹泻／黏膜病（Ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａ— ｍｕｃｏｓａｌｄｉｓｅａｓｅ，ＢＶＤ—ＭＤ）是由牛病毒性腹泻病毒（Ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ，ＢＶＤＶ）感染引起的一种接触性传染病，可造成感染牛严重的消化系统、生殖系统、呼吸系统疾病及免疫抑制等。１９４６年，Ｏｌａｆｓｏｎ在美国纽约首次报道ＢＶＤ—ＭＤ的发生，称该病典型的临床症状是腹泻。１９５３年，美国衣阿华州的首例ＭＤ被发现和报道，该病以胃肠道黏膜溃疡为特征ｌ１］。由于是由同一种病毒所引起，因此，美国兽医协会将ＢＶＤＶ感染引起的疾病统一命名为 “牛病毒性腹泻／黏膜病 ”（ＢＶＤ—ＭＤ）。李佑民在我国首次从流产胎儿的脾脏中成功分离并鉴定出ＢＶＤＶ。该病在世界范围内分布广泛，给养牛业造成较大的经济损失，被我国列为三类疫病。目前，国外主要通过接种疫苗、淘汰抗体阴性的持续性感染牛的措施来控制该病。尽管ＢＶＤ—ＭＤ是影响世界养牛业一种重要的传染病，然而由于该病尚未在我国引起大规模的暴发和流行，也不存在公共卫生问题，该病往往很少引起人们的重视。然而，随着养牛业规模化的发展，该病造成巨大损失，逐渐被人们熟知。因此，控制和彻底消除该病显得尤为重要。建立一种快速、高效的抗原检测方法，为ＢＶＤ—ＭＤ的诊断和流行病学研究提供物质基础，对ＢＶＤＶ的防

牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用

任艳陈创夫乔，一，军王鹏雁盛金良王远志张，，，，沾李，臻
（．１石河子大学动物科技学院，新疆石河子８２０；．河子大学医学院）３０３２石
摘
要：以牛病毒性腹泻病毒（ＶＶ）ＢＤ的保守基因５一非编码区为参考，计、设优化一对特异的荧
Байду номын сангаас
ＷＡＮＧａｚｉＺＨＡＮＧｈｎＬｈｎＹｕｎ．ｈ，Ｚａ，ＩＺｅ（．ｏｅｅｏｎｍｌｃｎｅａｄＴｃｎｌｙＳｉｅｎｖｒｔＳｉｅｉｉｎ３０３Ｃｉ２Ｃｌｇ１ＣｌｇｌｆＡｉａｉｃｎｅｈｏｏ，ｈｈｚＵｉｓｙ，ｈｈｚＸｎａｇ８２０，ｈｎ．ｏｅｏｄｉ，ｈｈｄＵｉｒｙＳｅｇｉｅｉｉｊａ；ｅｌｆＭｅｉｎＳｉｎｖｓ）ｃｅｅｅ￣
［中图分类号］￥５．５８２６３［文献标识码］Ａ［文章编号］１０－７４２１）５００－４０４６０（０００－０４０
ＥｓａｌｓｍｅｔａｄＩｉｉｌＡｐｌｃｔｏｆａＲｅｌｔｍｅＦｌｏｅｃｎｔｂｉｈｎｎｎｔａｐｉａｉｎｏａ－ｉｕｒｓｅｔ
ｄｓｇｅ．ｈｓａａｅｅｄｎｏｆｃｅｔＲｅｉｎｄＴｅａｓｙｈｄａｄｐｎｅｔｅｆｉｎ＝０９７．ｍｐｉｅｆｃｅｃ＝０７ｎｅｅｔｎｓｎｉｉｔｓ１０ｔｓｔａｃｉ．９ａｌｄｅｉｉｎｙＥｉｆｆ．８ａｄｄｔｃｉｅｓｌｙｉ０ｉｈｏｂｉｍｅｎ

牛病毒性腹泻病毒TaqMan_探针荧光RT-PCR_方法的建立和临床应用

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：为建立一种牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）的快速检测方法，本研究根据国内BVDV 流行毒株5'-UTR 序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan 探针，并优化了反应条件，最终建立了一种检测BVDV 基因1型（BVDV-1）的TaqMan 探针荧光RT-PCR 检测方法，并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。

结果显示：所建立方法能够特异性检测出BVDV-1，与基因2型BVDV 、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应；灵敏度高，最低检测下限为4.3 copies/μL ；批内和批间变异系数均小于2%，重复性良好。

7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%（161/925），序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a ，BVDV-1c 亚型。

本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV 的方法，监测地区优势流行毒株为BVDV-1a 与1c 亚型，为临床中BVDV 早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；荧光RT-PCR ；诊断；流行病学调查中图分类号：S852.65文献标志码： A文章编号：1674-6422（2024）02-0139-07Development and Clinical Application of TaqMan Reverse Real Time PCR forDetection of Bovine Viral Diarrhea VirusYUAN Ye 1,2, DONG Yaqin 2, ZHANG Hui 2, LIU Shuang 2, CUI Jin 2, Ni Bo 2, WEI Rong 2, GU Congcong 3,DUAN Gang 1, ZHANG Feng 2, LI Xiaocheng 2, DAI Feiyan 1(1. College of Veterinary Medicine, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. China Animal Health and EpidemiologyCenter, Qingdao 266032, China; 3. Huantai animal husbandry and Fishery Service Center, Zibo 300384, China)收稿日期：2022-02-23基金项目：“十四五”国家重点研发计划（2021YFD180030）作者简介：袁野，男，硕士研究生，临床兽医专业通信作者：张锋，E-mail：******************；李晓成，E-mail：********************；代飞燕，Email：*****************牛病毒性腹泻病毒TaqMan 探针荧光RT-PCR 方法的建立和临床应用袁野1,2，董雅琴2，张慧2，刘爽2，崔进2，尼博2，魏荣2，顾丛丛3，段纲1，张锋2，李晓成2，代飞燕1（1.云南农业大学动物医学院，昆明650201； 2.中国动物卫生与流行病学，青岛266032；3.桓台县畜牧渔业服务中心，淄博256400）2024,32(2):139-145Abstract: A TaqMan-based real-time RT-PCR assay was developed in the present study for rapid detection of bovine viral diarrhea virus (BVDV) using a pair of primers and TaqMan probe targeting the BVDV-1 conserved 5'-UTR gene sequence of domestic epidemic strains. Then this detection method was used to conduct surveillance and epidemic analysis of BVDV-1 in 7 provinces. The results showed that the developed real-time RT-PCR assay was speciﬁ c for BVDV-1 and had no cross-reaction with BVDV-2, classical swine fever virus, border disease virus, bovine coronavirus, infectious bovine rhinotracheitis virus and bovine rotavirus. The detection limit of the assay was as low as 4.3 copies /μL . In addition, this assay has good reproducibility with less than 2% of the coeﬃ cient of variation within batches· 140 ·中国动物传染病学报2024年4月牛病毒性腹泻病（bovine viral diarrhea, BVD）又称为黏膜病（mucosal disease, MD），是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）引起的高度接触性传染病，各年龄牛都易感，其中，犊牛易感性最高，临床上主要表现为腹泻、流产以及小牛先天持续性感染[1-2]。

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DAIRY HEALTH奶牛保健322018·10收稿日期：2017-05-24基金项目:国家奶牛产业技术体系科学家岗位项目（CARS37-06）；公益性行业（农业）科研专项（201303040-01）。

作者简介:张康(1987-)，男，甘肃兰州人，硕士，主要从事奶牛疾病研究工作。

通讯作者:李建喜(1971-)，男，研究员，博士生导师。

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立张康，王丹阳，王旭荣，张凯，张景艳，王磊，李建喜（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州 730050）中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1004-4264（2018）10-0032-04DOI: 10.19305/ki.11-3009/s.2018.10.008摘要：根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)5′UTR 基因序列，设计合成了1对特异性引物，建立了BVDV的RT-PCR检测方法。

该方法从BVDV标准毒株NADL中扩增出了279bp的特异性片段，而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞等的扩增结果均为阴性。

经对标准毒株的细胞毒进行检测, 其敏感度达10-1×TCID 50。

提取9份细胞毒总RNA后，进行一步法RT-PCR扩增可获得一致的检测结果，说明该方法重复性很好。

应用该方法对45份临床疑似患牛的样品进行检测，结果检出4份阳性，表明该方法具有较好的临床应用性，且检测结果与参考实验室检测结果完全相符，可用于BVDV 的快速诊断。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；5′UTR 基因；一步法RT-PCR；诊断牛病毒性腹泻病毒（bovine.viral.diarrhea.virus，BVDV）属于黄病毒科、瘟病毒属，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛、猪等动物[1]，可通过血液、排泄物等多种途径进行水平传播，感染BVDV的牛发病率高、死亡率低，牛群中相当一部分牛是BVDV的携带者。

还可垂直传播，感染BVDV的孕牛产下的犊牛也会感染BVDV，并终身带毒，持续排毒，成为重要传染源，给养牛业带来了极大的危害[2]。

在病毒检测方面，随着分子生物学的发展，RT-PCR方法越来越受到人们的重视和广泛应用。

在牛病毒性腹泻诊断方面，Gaede等[3]应用RT-PCR和ELISA技术检测牛病毒性腹泻病毒，证实了RT-PCR.比ELISA的特异性和敏感性要高。

日本学者Vrund等[4]根据BVDV基因的p80区片段设计引物，建立了RT-PCR方法，对17株供试的BVDV株（包括致细胞病变株和非致细胞病变株）进行了检测，结果均可检出。

从5头患黏膜病、流产或腹泻的牛中采集了40份血清和组织样品，结果RT-PCR法从所有样品中检出了BVDV，而用病毒分离法从犊牛采集的10份样品中没有分离到病毒，说明用RT-PCR法的检出率比病毒分离法更敏感。

加拿大动物疾病研究所的Gilbert等[5]研制了一种RT-nPCR方法，从细胞培养物中和血液中检测BVDV，该方法可以检出至少103.×TCID 50的BVDV。

所以RT-PCR相对其他检测方法更加快速、简便、特异、敏感。

本研究拟从BVDV的保守基因序列作为切入点，建立一种快捷、准确的牛病毒性腹泻病一步法RT-PCR检测方法，为疑似病例的快速准确诊断提供依据。

1 材料与方法1.1 病毒BVDV标准毒株NADL购自中监所。

猪瘟病毒（疫苗）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（疫苗）购自易邦生物工程有限公司。

牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞等均由本实验室保存。

45份牛病毒性腹泻病毒感染的临床疑似粪便样品采自甘肃榆中周边奶牛养殖户。

DAIRY HEALTH 奶牛保健332018·101.2 主要仪器低温高速离心机（美国THERMO公司）；C1000. PCR扩增仪、凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）；电泳仪（北京六一仪器厂）；分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.3 主要试剂RNA提取试剂盒、RT-PCR一步法试剂、DNA. Maker.DL2000，均购自宝生物工程（大连）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.4 引物设计根据GenBank上登录的BVDV基因组序列，选择5’UTR保守区域设计1对特异性引物，引物由宝生物工1.5 病毒核酸提取按照RNA提取试剂盒说明书在核酸提取室进行。

1.6 RT-PCR反应体系的建立取200μLPCR薄壁管，冰上操作，参照说明书，建立50μL反应体系，其中RNA模板1μL，一步法酶混合液2μL，2×一步法缓冲液25μL，上下游引物各1μL，无RNase双蒸水20μL。

一步法RT-PCR反应条件设定为40℃.30min，94℃.2min；94℃.30s，55℃.20s，72℃. 30s，35个循环；72℃.5min。

产物置于-20℃备用或立即取5μL用1.2%.琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 引物浓度及退火温度优化对建立的RT-PCR反应体系引物终浓度进行优化，引物终浓度分别设定为0.8、0.4、0.2、0.1μmol/L。

在梯度PCR仪上设定52、53、54、55、56℃共5个退火温度，进行目的片段的扩增，经试验验证引物的最佳退火温度。

1.8 特异性试验利用优化后的反应体系和反应条件进行特异性检验，除检测BVDV外，分别提取猪瘟病毒（疫苗）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（疫苗）、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞的RNA，用已建立的方法分别进行扩增。

同时，将BVDV扩增条带胶回收，连同pMD-18T载体，送生物公司测序。

1.9 敏感性试验取经MDBK细胞增殖的BVDV.NADL细胞毒，采用微量法测定TCID50值。

提取总RNA，10倍稀释，于103×TCID50、102×TCID50、10×TCID50、1×TCID50、10-1×TCID50、10-2×TCID50和10-3×TCID50.7个滴度分别取各稀释度的总RNA10μL，应用优化的反应体系和反应条件，检测所建立方法的灵敏度。

1.10 重复性试验用9份BVDV细胞毒提取的总RNA进行RT-PCR，以验证本方法的重复性。

1.11 临诊样品检测用灭菌棉拭子沾取临床发病犊牛肛门内的新鲜粪便，装入5mL灭菌离心管中，按1:5倍体积加入PBS，混匀，8.000r/min离心5min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。

2 结果2.1 引物浓度及退火温度优化经试验验证反应体系中上下游引物终浓度为0.2μmol/L，最佳退火温度为55℃。

2.2 特异性试验试验发现，该方法仅能检测出BVDV核酸，在279bp位置有特异性条带，而猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等其他被检病毒均无条带（图1）。

回收纯化目的片段送生物公司测序，然后应用DNAstar软件分析其同源性，结果发现与参考序列同源性为100%；应用在线软件进行Blast比对，结果发现测定序列与GenBank中的其他BVDV序列同源性均在98%以上。

图1 RT-PCR 的特异性试验M:DNA分子质量标准;1:BVDV NADL;2~6:分别为CSFV、PRRS、IBV、BRV、MDBK2.3 敏感性试验提取病毒总RNA，做10倍系列稀释，进行RT-PCRDAIRY HEALTH奶牛保健342018·10扩增。

图2结果显示，该RT-PCR最低检出为10-1×TCID 50。

图2 RT-PCR 的敏感性试验M:DNA 分子质量标准; 1~7:RNA 模板浓度依次为103~10-3TCID 50; 8:牛肾细胞2.4 重复性试验对9份细胞毒提取总RNA后，进行一步法RT-PCR 扩增基因片段，可获得一致的检测结果，说明该方法重复性很好（图3）。

图3 RT-PCR 的重复性试验M:DNA 分子质量标准; 1~9:不同细胞毒的RNA; 8:牛肾细胞2.5 临诊样品检测结果应用建立的一步法RT-PCR方法，对采集自临诊腹泻犊牛的新鲜粪便共45份样品进行了BVDV核酸检测，结果阳性样品共4份（图4）。

图4　临床样品检测M:DNA 分子质量标准; 1、2、5、6、7：阴性；3、4、8、9：阳性；10:牛肾细胞3 讨论目前检测BVDV的常用方法有病毒分离与鉴定、ELISA、PCR，上述方法各有优缺点。

病毒分离与鉴定，一般通过采集病畜的肠内容物和血液等，无菌处理后接种于牛肾细胞后进行分离与鉴定。

郜玉钢等[6]从腹泻鹿粪样中分离到与BVDV的C24V标准株有致细胞病变相同规律的BVDV病毒株。

但分离、鉴定时间太长，只能测出致细胞病变型BVDV，所以无法快速检测且有局限性。

ELISA法可检测各种病料中的BVDV，在国内外广泛应用。

张光辉[7]同样以单克隆抗体建立了双抗夹心ELISA 法，其检测结果与中和试验和病毒分离试验符合率分别为93.3%和86.7%。

虽然此法简单快速，且特异性良好，但鉴于制备特异性抗原困难，并且假阳性、假阴性及病毒含量很低时灵敏度不高等问题的存在，使本方法在实际应用上受到限制[8]。

PCR技术可从基因水平检测到病毒，具有灵敏度和特异性高、操作简便、快捷高效等特点，且可对PCR产物进行测序，分析病毒的基因组变化，从而多用于流行病学研究。

一步法RT-PCR不需在反转录后再次向反应混合物中添加任何试剂，节省了操作时间，而且最大限度地降低了外来因素的污染[9]。

针对牛病毒性腹泻病日益威胁甘肃省养牛业的现状[10]，为实现甘肃省疫情的早发现、早控制，本研究建立了一步法RT-PCR方法，并对反应体系和反应条件进行了优化，确定最佳退火温度为55℃，最佳引物终浓度为0.2μmol/L。

对BVDV进行扩增均可扩增出279bp的特异性片段，而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞等的扩增结果均为阴性，与王春庆[11]所建检测方法的特异性结果相似。

建立的方法对疑似病例进行检测，结果显示，建立的一步法RT-PCR可检测各种样本，表明该方法具有较好的临床应用性，且检测结果与参考实验室检测结果完全相符。

该方法的建立将对甘肃省BVDV的快速诊断及预警预防提供技术支持。

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