牛病毒性腹泻粘膜病病毒的分离鉴定
石河子大学动物科技学院
201 5 - 2016学年第2学期
课程名称：兽医学专业基础理论
任课教师：贾斌（教授）
专业：预防兽医学
年级：2015级
学号：2015201711
姓名：赵阳
2016年6月11日
牛病毒性腹泻粘膜病病毒生物学特性和分离鉴定的研究进展的综
述
摘要：牛病毒性腹泻病毒（BVDV)是反刍动物和猪体内广泛存在的危害动物健康的重要病原体。BVDV感染牛后主要引起牛的持续性感染、免疫耐受、免疫抑制、繁殖障碍及急慢性黏膜病等临床症状，给养牛业造成重大的损失。其致病机理非常复杂，给该病的治疗和根除带来极大的困难。随着分子病毒学研究的发展以及对猪瘟病毒和黄病毒科其他成员的研究，人们在BVDV 分子水平和细胞水平的研究方面也取得了一些进展。就此，作者从BVDV入侵细胞、在细胞内的复制以及与宿主蛋白分子相互作用等方面进行综述，有助于阐明BVDV 致病和在体内持续存活的机制，为该病的防治和疫苗研发提供新的思路和对策。
关键词：牛病毒性腹泻病毒；病毒复制；宿主细胞；相互作用
牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Di arrhea Virus-BVDV），又称为牛病毒性腹泻黏膜病病毒,(Bovine Viral Diarrhea - Mucosal Disease Virus BVD-MDV）是一种世界范围广泛分布的危害动物健康的重要病原体。它不仅感染牛，而且能够感染猪、绵羊、山羊、鹿、骆驼及其他野生动物[1]。临床上引起一系列复杂的症状，主要包括牛的病毒性腹泻、急慢性黏膜病、免疫耐受和持续性感染、免疫抑制、繁殖障碍、血小板减少和出血症等，致病机理非常复杂，由于缺乏有效的防控技术，使该病在全球普遍流行，严重影响养牛业生产的各个环节［２］。BVDV是一种有包膜的单股正链RNA病毒，通过依赖宿主细胞生物和生物化学的遗传多样性及生命周期复制和生存。同其他病毒一样，感染BVDV 的细胞对那些有利于病毒复制和生存的基因表达进行了修饰，上调宿主细胞中参与翻译和翻译后过程的编码基因，下调与细胞能量产生和细胞结构相关的编码基因。在动物机体。可见，BVDV,在动物机体内复制完成感染的过程中宿主细胞对于病毒的复制、包括蛋白翻译、蛋白修饰、蛋白转运以及子代病毒的释放是必不可少的。那么在病毒侵染的过程中，哪些宿主分子参与了病毒的复制？哪些病毒蛋白影响了宿主的信号转导途径？这些显然是揭示B VDV致病和持续性感染的关键问题，但是目前对于BVDV蛋白参与病毒复制、与宿主蛋白相互作用的研究报道很少，更多的了解则是来源于同属猪瘟病毒（CSFV）和同科丙型肝炎病毒（HCV）的研究。作者从BVDV侵染细胞、BVDV的复制以及与宿主蛋白的相互作用３个方面进行综述，以期为认识BVDV的侵染机制和开发新的防治药物及疫苗提供依据。
1、BVDV致病机理
1.1 BVDV持续感染与免疫耐受
持续感染 (persistent infection,PI)是BVDV感染动物的一种重要临床型,也是BVDV在自然环境中维持存在的一种形式，是由于妊娠母畜在怀孕早期(约姓娠 120天 )通过子宫内感染非致细胞病变型 (N
CP型) BVDV引起。此时胎儿的免疫系统尚未发育成熟,不能识别外来的NCP型BVDV,这种胎儿出生后一旦存活即成为持续感染牛,其临床表现正常,血清学阴性,即处于免疫耐受状态,但持久带毒、排毒 ,当被引入新群时可作为传染源。因此这种动物对疾病长期存在十分重要。由于目前用CP型BVDV实验复制持续性感染犊牛末获成功 ,因此认为感染只能由NCP型B VDV引起[3]。
1.2 粘膜病
粘膜病是BVDV感染引起的一种最严重的临床类型,发病率低,死亡率高。大量研究证实,CP和NCP型BVDV在致死性MD的致病机理中都起着重要的作用。发生MD的前提条件是怀孕母牛在妊娠早期感染NCP型BVDV,其结果生产出持续感染犊牛,这种持续感染犊牛对相应的NCP 型BVD表现免疫耐受。PI动物当再次感染抗原性相似或同源的CP型病毒时就会发生MD,而异源病毒能够被机体识别且不被免疫系统所耐受,这也正可以解释某些PI动物体内存在BVDV抗体的原因。由于从发生MD的动物个体中可同时分离得到抗原性密切相关的CP型和NCP型BVDV,因此普遍认为CP型病毒最有可能来源于NCP型BVDV 的突变。[6]对CP型和NC P型病毒及从MD病死牛分离的配对病毒的序列分析结果表明,在CP型BVDV基因组中发生了一定的改变,这些改变都对病毒基因组的NS2-3(P125)编码区产生影响,其结果是产生NS3(P80)。NCP型和CP型BVDV都表达NS2-3,而在NCP BVDV感染细胞中没有发现NS3, NS3因此被认是CP型BVDV的分子标志。NS3和CP型B VDV是NCP BVDV基因改变的结果。[7]这种改变包括宿主细胞的插入、有时伴有病毒基因的重复、病毒基因的重排、缺失等,主要表现为:外源细胞序利插入病毒基因组,使病毒与细胞RNA发生重组,进而导致NCP型病毒转变成CP型病毒;病毒基因组中并无细胞RNA的插入,而是病毒自身基因发生了重排和拷贝,如由NCP型20序列拷贝的重排而致产生一个P80释放位点;在外源细胞序列插入的同时伴有病毒基因的复制,二者共同作用引起NCP型到CP 型的变异、缺陷干扰粒子、点突变。[8]
1.3 繁殖障碍
BVDV 是引起牛繁殖障碍的一重要病原。在受精时以及胚胎发育的早期到中期感染BVDV 能引起不孕、胚胎死亡、产木乃伊胎、弱胎、畸形胎或死产。对急性感染NCP型BVDV初情期母牛的卵巢功能进行监测后发现,随着BVDV的急性感染,优势卵泡和排卵卵泡的数目也减少,显示BVDV急性感染母畜卵巢的卵泡发育有一定影响。FrayMD等推测,BVDV导致奶牛繁殖力下降的机制可能有两条: 一是卵母细胞的质量下降,二是性腺类固醇生成机制受到破坏,导致血浆中雌二醇、黄体酮等激素紊乱,提示BVDV感染造成内分泌机能紊乱繁殖力低下之间的因果关系。
[9]
1.4 血小板减少症
Ⅰ型和Ⅱ型BVDV感染均能引起血小板减少和出血性综合征,只是二者所引起的病毒血症的程度和疾病表现存在差异,其中Ⅱ型BVDV能引起严重的急性疾病和出血综合征。在血小板减少症中,根据患牛体内血小板的体积平均值呈现两种趋势的变化,将BVDV感染引起血小板减少症的机制分为两种情况:①血小板减少症
是由于外周循环中血小板受损程度增加而造成的,由于新近从骨髓中释放入血流的血小板体积较大,因此血小板体积平均值就会增大;②骨髓生成血小板的能力下降,由于老龄化血小板的体积较小,血小板的体积平均值也就减少学阳性无病毒血症的牛若未怀孕是“安全的”。[10]BVDV还没有标准疫苗,但有一些商品化制剂。由于有经胎盘感染的危险,对怀孕母牛或哺乳犊牛不宜使用弱毒疫苗,因为这有可能导致持续性感染动物发生黏膜病的危险。灭活疫苗通常需要加强免疫。理想的疫苗应该是一种能防止怀孕母牛经胎盘感染的疫苗。
2、BVDV的生物学特性
BVDV是黄病毒科瘟病毒属的代表种,用多克隆抗体对同属的猪瘟病毒( CSFV)、同科丙型肝炎病毒（HCV）进行详细的血清学(主要为琼脂扩散试验,补体结合试验和中和试验)分析发现这三种病毒共有1种共同抗原[5]。BVDV株与猪瘟病毒(CSF V)的核苷酸序列约60% 具有同源性,氨基酸约85%具有同源性(谢西锋等,2001)。B VDV分为两种生物型：致细胞病变型(CP 型)和非致细胞病变型(NCP型),BVDV仅有一种血清型,但种间有显著的遗传和抗原异质性。根据BVDV病毒基因组5′端非翻译区(5-N TR)序列比较,将BVDV分为两种基因型[7],即BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ。BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ不同( Harkness),BV DV-Ⅱ5′-NTR区缺乏PstⅠ位点,中和活性也不同于BVDV-Ⅰ,BVDV-1普遍用于疫苗生产、诊断和研究。[11]BVDV-Ⅰ分离株引起猪发生病毒血症及感染的能力优于BVDV-Ⅱ[12]。以105TCID50和107TCID5 0剂量的BVDV-Ⅰ分离株感染猪,可产生病毒血症,但同剂量的BVDV-Ⅱ分离株则不能引起猪病毒血症;而牛体试验中则相反,BVDV-Ⅱ分离株感染能力超过BVDV-Ⅰ分离株;持续性感染(PI)牛,死于出血性综合征的急性BVD牛中主要分离到BVD V-Ⅱ。首次证明牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能激活牛免疫缺陷病毒(BIV)的复制与表达,通过合胞体分析和RT测定发现BVDV 可激活BIV的复制与表达,并进一步通过缺失和Gelshift分析证明这一激活过程有NFJB因子参与,与LTR的NF-JB区相关[1 3]。实验证明,因HCV与BVDV有共同抗原,BVDV抗体血清能中和HCV疫苗抗原,如在生产HCV 过程中使了含有BVDV抗体的犊牛血清,那它将严重影响HCV疫苗的毒价,产生巨大的经济损失,建议在使用犊牛血清制备HCV疫苗时,对BVDV抗体进行检测。
3、病毒基因组
BVDV基因组为单股正链RNA，全长大约12.5kb，其长度因为基因组片段的缺失，插入以及重复序列而发生改变，整个基因组由5’非翻译区（5’-UTR）、ORF 编码区、3’非编码区（3’-UTR)组成一个大的开放阅读框（ORF），编码1个近4 000个氨基酸的多聚蛋白，并由细胞和病毒基因编码的蛋白酶在翻译时和翻译后进行加工，至少生成11种成熟的蛋白质，他们在基因组上的位置从N端到C端按一定的顺序排列。
4、安全评价
患有牛病毒性腹泻粘膜疾病的病牛不得入市交易,通常认为血清学阳性无病毒血症的牛若未怀孕是“安全的”(OIE,2000)。BVDV还没有标准疫苗,但有一些商品化制剂。由于有经胎盘感染的危险,对怀孕母
牛或哺乳犊牛不宜使用弱毒疫苗,因为这有可能导致持续性感染动物发生黏膜病的危险，灭活疫苗通常需要加强免疫。理想的疫苗应该是一种能防止怀孕母牛经胎盘感染的疫苗。
5、病毒诊断研究进展
5.1病毒分离和鉴定
一般通过采取病畜的血液、口鼻分泌物以及脾和肠系膜淋巴结，处理后接种于胎牛肾细胞、犊牛肾细胞、犊牛睾丸细胞等进行病毒的分离和鉴定，研究表明，以犊牛睾丸细胞最敏感。离到病毒。但病毒分离、鉴定耗时太长，且只能检分别从牛、幼鹿等易感动物中分离到病毒。但病毒分离、鉴定耗时太长，且只能检测出致细胞病变型BVDV，故无法普及。
5.2 血清学诊断
5.2.1中和法
该法是进行牛病毒性腹泻－黏膜病流行病学调查的有效手段，也是实验室常用方法之一。通过每3～4周前后采血2次，将血清稀释后进行试验。如果第2次高于第1次4 个滴度以上可判为阳性，2个滴度以上，视为疑似患病。但该方法检测出的阴性牛可能是免疫耐受牛，因此仅靠血清中和试验检测很难达到清群、完全监控的目的。
5.2.2免疫琼脂扩散法
该法简便易行，在我国基层兽医部门应用较普遍。通常选取溃烂或发炎组织周围黏膜直接与BVDV阳性血清进行反应检测抗原。同时也可取患病动物血清与标准阳性抗原进行抗体检测，但敏感性低于中和试验。陈茂盛等用该法检测BVDV抗体，并与微量中和试验进行对比分析，结果阳性率差异显著。国外学者亦有相同结论。免疫琼脂扩散只具有群特异性，不具备株特异性，准确性不高，因此不能替代微量血清中和试验。
5.2.3免疫电镜观察法
快速简便，可直接对病料或细胞培养物进行复染，观察病毒粒子形态。但易受到形态相似的病毒粒子干扰，导致特异性和敏感性较低，且病毒粒子本身难于观察，需病毒数量在107个/mL以上。因此，仅用电镜观察鉴定较困难。而PAG－IEM技术电子密度高，可通过快速扫描网格，以较低倍数检出病原。常国权等以蛋白A胶体金免疫－IEM) 法、免疫电镜吸附法(IE M)电镜技术(PAG）和直接负染色电镜法( DEM) 同时检测疑似患病动物的粪便样品。[15]结果表明，PAG－IEM方便快速，3～4 h即可诊断结果，而且敏感性较IE M 高300～500倍、DEM1000倍以上。本法对检测经过挑选或疑似样品内所含的病毒粒子快速、敏感且特异性好，但目前仍不适于大量样品筛选。
5.2.4 免疫氧化物技术(IPT)
该方法诊断牛病毒性腹泻－黏膜病准确可靠，目前被广泛用于抗原的分布和抗体检测。该法通过对单层细胞培养物进行检测，使感染BVDV的细胞浓染，而未受BVDV感染细胞无色，其结果用肉眼或显微镜便可直接观察。研究表明，将单克隆抗体和生物素化抗鼠抗体－链酶亲和素过氧化物酶检测系统相结合，可提高其特异性。
5.2.5免疫荧光技术(IFT)
免疫荧光技术集免疫学的敏感性、特异性和显微镜的精确性于一身，可快速检测感染细胞培养物和病变组织切片中的病毒粒子。Rebby等用NADL株感染MDB
K单层细胞，对54 份患病牛血清进行检测，其结果与所建立间接ELISA检测法一致。魏志强等用BVDV感染牛白细胞与血清进行荧光抗体检测，结果显示，白细胞和血清中的病毒消长情况差异不大。我国进出口检疫条款规定，以荧光抗体同时对白细胞和血清进行监测，两者出现一种特异性荧光即为阳性。虽然免疫荧光技术是一种可靠的实验室诊断方法，但需要佐以荧光显微镜，并不适用于基层使用。
5.2.6免疫吸附(ELISA)
ELISA 检测法作为经典的血清学检测方法，在国内外广泛应用。该法即可检测存在于各种病料中的BVDV，也可以检测患病动物体内BVDV抗体水平，是诊断牛病毒性腹泻－黏膜病的一种重要的常规手段。王新平等于1995年研制了用于检测血清中和抗体的双抗体夹心阻断ELISA 诊断试剂盒，其敏感性高出中和试验5个滴度。Shammon等利用BVDV单克隆抗体建立了抗原捕获ELISA检测法，用于检测BVDV抗原。[16]此方法由Homer改良后与PCR方法比较，结果表明，ELISA法的敏感性低于PCR法。同样以单克隆抗体建立了双抗夹心ELISA法，其检测结果与中和试验和病毒分离试验符合率分别为9 3.3%和86.7%。虽然此法简单快速，且特异性良好，但鉴于制备特异性抗原困难，并且假阳性、阴性等问题的存在，使本方法在实际应用上受到限制。
5.3 BVDV 的分子生物学检测技术
5.3.1核酸扩增技术
随着分子生物学检测技术被应用于牛病毒性腹泻－黏膜病的诊断，核酸扩增技术目前已成为应用较广泛的实验室诊断方法。应用于牛病毒性腹泻诊断中的主要有环介导体外等温扩增(LAMP)技术，实时荧光定量(Taq-Man)RT-PCR、套式RT-PCR、一步法RT-PCR、PCR等。该技术能从分子水平上简单二重RT快速，敏感特异地检测出样品中BVDV的RNA，并且可以区分不同基因型的BVDV毒株以及BVD V在基因组成、传播途径、检测方法等方面相似的其他病原体，如猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病毒(BDV、水泡性口炎病毒(VSV)等。范晴等根据BVDV 5'UTR的保守区设计LAMP特异性引物，建立了恒温(63. 5℃)、快速(65min)的检测方法，该方法可检测到的阳性质粒临界值为1个拷贝，可依据浑浊度或染料的辅助直接判定结果。郭锐等根据BVDV的保守序列设计特异性PCR引物1条TaqMan 荧光探针，建立了实时荧光定量PCR检测方法，该方法检测灵敏度为3拷贝/μL，重复性好,定量线性范围为1.0×10(103～108)拷贝/μL。王克伟等根据针对BVDV 5'UTR和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的基因序列所设计的特异性引PCR的检物，建立了BVDV和PRRSV双重RT测方法。[17]该方法特异性强，敏感性高，用该方法对临床样本进行检测，结果与PRRSV和BV DV单RT-PCR的检测结果符合率分别为8 9.3%和92%。PCR技术诊断BVDV具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点，只是基因扩增所需的仪器和试剂价格昂贵，目前还不能广泛应用于生产实践。
5.3.2核酸探针杂交技术
核酸探针杂交技术是20世纪80年代兴起的一类分子生物学技术，与传统的检测方法相比，核酸探针杂交技术应用广泛，敏感性高,特异性强。早期的放射性同位素(如32P、35P) 标记探针,其具有放射性危
害、不稳定等缺点。后来发明的生物素标记的DNA探针虽然不具有放射性危害，但其特异性和敏感性有时均不如放射性同位素标记探针。目前，应用较多的是地高辛标记核酸探针,它不仅不具有放射,而且与放射性同位素标记探针一样,高度敏感特异。Jimmy等用NADL株的4种不同基因片段( P80、P54、gP62、gP53) 作为杂交探针,通过斑点免疫印迹方法检测出BV DV的24个细胞病变株和37个非细胞病变株，其中在检测致细胞病变株时P80和P54的杂交率可达90%以上。
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牛病毒性腹泻黏膜病诊断及治疗方法
牛病毒性腹泻/黏膜病诊断及治疗方法 牛病毒性腹泻也称黏膜病，是由病毒性腹泻病毒引起的，主要发生于牛的一种急性、热性传染病，其临诊特征为黏膜发炎，糜烂，坏死和腹泻。 一、病原 病原为腹泻病毒，本病毒有囊膜，对胰醚、乙醇、氯仿等敏感，对低PH（PH＜3.0）敏感，对热不稳定，５６℃很快失活。大多数毒株对低温稳定。 二、流行病学 牛病毒性腹泻/黏膜病可感染黄牛、水牛、牦牛、绵羊、山头、猪、鹿及小代鼠。各种年龄的牛对本病均易感，以6-18月龄者居多。患病动物的分泌物和排泄物中含有病毒。亚临诊感染居多，康复牛可带毒6个月。主要通过消化道和呼吸道而感染，也可通过胎盘感染。
本病呈地方流行性，常年均可发生，但多见于冬末和春季。新疫区急性病例多，发病率通常约为5%以上，病死率90-100%。老疫区则病例较少，发病率和病死率很低而隐性感染率在50%以上。本病也常见于肉牛群中，舍饲牛群发病时往往呈暴发式。 近年来，猪对本病病毒的感染率日趋上升，不但增加了猪作为本病传染源的重要性，而且由于本病毒与猪温病毒在分类上同为瘟病毒属，有共同的抗原关系，使猪瘟的防制工作变得更加复杂。 三、临床症状 潜伏期7-14天。 1、急性 急性者突然发病，体温升至40-42℃，持续4-7天，有的可发生第二次升。随体温升高，白细胞减少持续1-6天。继而又有白细胞微量增多，有的可发生第二次白细胞减少。病牛精神沉郁，厌食，眼、鼻有浆液性分泌物，2-3天内可能鼻镜及口腔黏膜表面糜烂，舌面上皮坏死，流涎增多，呼气恶臭。通常在口内损害之后常发生严重腹泻，开始水泻，以后带有黏液和血液。急性病例恢复的少见，通常死于发病后1-2周，少数病程可拖延1个月。
小儿轮状病毒性腹泻的防治
小儿轮状病毒性腹泻的防治 目前尚无治疗轮状病毒性腹泻的特效药物，一般都是对症治疗，纠正孩子的脱水、酸中毒。对于腹泻症状轻的孩子可用口服补液的方法进行纠正，常用的是世界卫生组织推荐的口服补液盐，配方为：氯化钠3．5克，碳酸氢钠2．5克，氢化钾1．5克，葡萄糖20克加水1000毫升，可让孩子当水喝。症状重一些的孩子可用静脉输液的方法纠正脱水和酸中毒，同时配以潘生丁口服。近年来，干扰素(IFN)也被用来治疗轮状病毒感染，这种药可以抑制病毒在人体内的繁殖，从而减轻症状，缩短病程。 如果是新生儿得了秋季腹泻，应继续喂母乳，母乳中有90％左右都含有抗轮状病毒的抗体，孩子吃后可减轻症状或缩短病程。民间也有不少治疗轮状病毒性腹泻的好方法。早先在东南亚用米汤代替葡萄糖口服液取得了较好的疗效。我国也有人曾用炒焦的大米或小米熬成米汤，代替补液剂口服，取得了明显的效果。具体制作方法是：把大米或小米用微火炒成焦黄色，然后加水熬成稀粥，过滤去掉米粒，用米汤喂孩子。炒焦了的米粒已部分碳化，有吸附毒素和止泄的作用。也可将焦米汤代替水加在世界卫生组织推荐的口服液剂中让孩子饮用。若无口服补液剂，可在每1000毫升焦米汤中加盐3．5克、小苏打2克、白糖30克饮用。米汤中的淀粉、维生素及其他矿物质，不但可以补充孩子的营养，还有利于孩子胃肠功能的恢复，是目前较理想的治疗方法。 口服的轮状病毒疫苗目前很多国家都在研究之中，有的已制出活的减毒人轮状病毒疫苗、传代减毒活的牛或猴轮状病毒疫苗和减毒活重组疫苗。有的疫苗经临床试用，并未引起成人或婴儿的不良反应。还有的国家正在用DNA重组技术开轮状病毒疫苗，可望在不久的将来，这种疫苗能像口服小儿麻痹症糖丸一样，在全世界普遍推广应用。 知识秋冬交接时期谨防轮状病毒据介绍，轮状病毒有明显的季节性，它特别喜欢在20摄氏度左右气温下活跃。在广州，秋冬交接时期尤其要注意。市儿童医院通过三年的观察发现，本地儿童多集中在每年10月至12月期间感染轮状病毒。 特别注意脱水症状医生表示，人体感染轮状病毒后，病毒在3－5日后才最活跃，因此患者初发症状未必是腹泻，可能有发烧、咳嗽、咽部疼痛等感冒症状，有的患者会每日大便数次，且伴有呕吐、腹痛，容易被误诊为胃肠型感冒。不过，一旦出现脱水，就要引起注意。 提醒喝牛奶会延长腹泻轮状病毒进入人体后，主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。与此同时，能帮助人体消化的小肠茸毛使受损断裂，小肠吸收不到人体的水分、养分，粪便排除体外后成水状。有患者在轮状病毒排毒期每天拉肚子10次、20次后出现脱水，不止泻的话就会进一步危及生命。此外，近年来还发现个别病人肠套叠、抽促的并发症。小肠绒毛要一周
病毒的分离鉴定
病毒的分离鉴定 Prepared on 22 November 2020
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
犬细小病毒的分离与鉴定
犬细小病毒的分离与鉴定 摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。 关键词：犬细小病毒；分离；鉴定 犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。 1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。 1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 试剂的配制 1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。 2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点
牛病毒性腹泻病的危害及防控建议
侯佩莉王洪梅何洪彬山东省农业科学院奶牛研究中心 牛病毒性腹泻病( BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 引起的一种极为复杂, 呈多种 临床表现的传染病。该病以发热, 咳嗽, 黏膜糜烂、溃疡, 白细胞减少, 腹泻, 持续感染与免疫耐受，免疫抑制，先天性缺陷，怀孕母牛流产, 产死胎或畸形胎等为主要特征。该病呈世界性分布，广泛存在于美国、澳大利亚、英国、新西兰、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等国家。BVDV不仅可感染牛，也能感染绵羊、山羊、猪、鹿和其它反刍动物。BVDV 感染情况复杂，持续性感染个体症状隐蔽。动物带毒率高，成为牛场效益的隐形杀手，特别是BVDV严重影响感染动物的繁殖，给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。因而被世界动物卫生组织(OIE)列为发病必须上报的动物传染病之一。 国内流行情况 牛病毒性腹泻病毒是有囊膜的正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属。基因型上，BVDV分为牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1)和牛病毒性腹泻病毒II型(BVDV-2)。我国自1980年在吉林省首次发现并分离到BVDV以来，已在至少20个省市自治区检测出BVDV 抗体或分离到病毒。山东省农业科学院奶牛中心何洪彬团队等对山东省36个奶牛场牛群感染BVDV的情况进行了大罐奶样检测，群体感染率为77.78%;对部分奶牛场进行血清学调查，个体感染率为49.74%，基因型主要为BVDV-1型。另据报道河南和河北、西藏、新疆等均有本病的发生，表明我国也存在着严重的污染,应引起足够的重视。但是目前国内缺乏比较系统的BVDV分子流行病学数据，这使得追溯病毒传播来源和预测病毒流行趋势十分困难。因此，深入开展分子流行病学调查，明确我国BVDV流行株的基因型分布及为该病的防控提供理论依据显得尤为重要。 危害 BVDV感染宿主的范围也越来越广，涉及到了大部分偶蹄家畜和部分野生偶蹄动物。奶牛产奶量降低，乳质下降。BVDV是引起牛繁殖障碍的一种重要病原。母牛在受精时以及在胚胎发育的早期到中期感染BVDV能引起不孕、胚胎死亡、木乃伊胎、弱胎、畸形胎或死产，给生产者带来巨大的经济损失。持续性感染是牛病毒性腹泻病毒感染动物的一种类型。感染怀孕母畜，造成胎儿免疫耐受进而发展为持续性感染畜，多数持续性感染动物外观健康，但BVD抗原阳性，抗体阴性，该牛终身携带和传播病毒，持续性感染母牛其后裔也常是持续感染牛，便形成母性持续感染家族。持续性感染牛有些发育不良，生产性能下降。对牧场来说，持续感染牛没有任何饲养价值。一般，抗体阳性率60%~85%的牛场，持续性感染率在1%~ 2%。因此防制病毒的持续性感染是疫病防控的主要环节。病毒对宿主的免疫抑制是导致重症疾病的诱因。其后果是损害机体的免疫机能，增强其他病原体的致病性，导致疾病多发和生产力下降。BVDV还是牛源生物制品(血清、冻精、胚胎、疫苗等)的常在污染源, 给畜牧业生产和相关商业领域造成巨大的经济损失。同时，BVDV感染引起的粘膜病，是一种最严重的临床类型，发病率低，而死亡率可高达100%。
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4 小时。
c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2 病毒的分离培养 病毒是严格的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上 的一致 。 b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进行,气室向上，孵育的最适温度 为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二 天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d) 接种：
病毒分离鉴定技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS 抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。 1.1.2细胞及血清细胞系Marc145、Vero、PK15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。 1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录 Buffer、MMLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为 Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ10柱式Trizol 总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.4RTPCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物P1 5′CTG GAG CCG TGC TAT CAT3′；下游引物P2 5′TCC ATT TCA TGA CAC CTG3′。 1.2方法 1.2.1细胞培养生长液为含100 mL/L新生牛血清(NCS)的RPMIl640培养液；维持液为含20 mL/L NCS的RPMIl640培养液。Marc145、Vero和PK15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。 1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5 000 r/min离心30 min，上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。 1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1 mL分别接种于长成单层的 Marc145细胞、Vero细胞和PK15细胞，37 ℃吸附1 h，补加维持液至8 mL，继续培养3 d～5 d，反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。
轮状病毒及护理
轮状病毒及护理 轮状病毒是什么 让宝宝有苦难言的轮状病毒其实是一种双链糖核酸病毒，主要通过感染小肠上皮细胞，产生肠毒素，进而损坏细胞，引起腹泻。每年秋季都是轮状病毒“发威”的时期，国内约有1000万的婴幼儿会感染。 轮状病毒传染性极强，可通过粪口或呼吸道传播，也可通过病毒感染的衣物、玩具、餐具传播。妈妈的双手也是传播途径之一，如果不清洗就与宝宝接触，宝宝吃手指时会一并把病毒吃下肚子。另外，宝宝们分享玩具也是病毒快速扩散的方式，严重时甚至出现大规模传染。 5岁以下的宝宝是轮状病毒的易感人群，其中6个月-2岁的宝宝易感性最高，因为这一年龄段的宝宝体内缺乏抗病菌，抗病毒能力差，因此，妈妈要提高警惕。 轮状病毒感染症状 宝宝感染轮状病毒，症状与肠胃炎相似，如呕吐、腹泻、腹痛、发热。但妈妈别把两者混淆。与肠胃炎相比，轮状病毒性腹泻呕吐较为突出。呕吐常先于腹泻，一般会持续3天，而腹泻则会持续3-8天，一天腹泻次数可达10次以上。腹泻物为草绿色或黄色水样大便，有时可有粘液，还散发出恶臭味。 如果宝宝病情加重，严重时会出现脱水、酸中毒、休克症状，甚至还会出现肠套叠、胃出血、紫癜、脑炎、溶血性尿毒症综合征等并发症。妈妈一旦发现宝宝吃不下饭，还上吐下泻、无精打采的，甚至有脱水症状，就应立即带宝宝到医院就诊。 轮状病毒如何护理 宝宝感染了轮状病毒，往往因身体的不适而哭闹不止，为了帮宝宝缓解病痛，防止病情加重，妈妈要如何做好护理呢？机智妈会用以下7招： 1、增加饮水 轮状病毒对宝宝最大的危害是引起脱水，所以增加饮水，防止重度脱水尤为重要。妈妈可在宝宝腹泻期多让宝宝喝富含电解质的液体，如米汤、苹果汁等。 2、适当喂母乳
病毒的分离与测定
第二十九讲病毒的分离与测定 教学目的：掌握病毒效价的测定方法 教学重点：噬斑法、终点法 教学难点：病毒的分离与鉴定 课时分布：1学时 教学过程： 一、病毒的分离与纯化 1、病毒的分离 病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。 （1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。 （2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。 2、病毒纯化 通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。 （1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。 （2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。 二、病毒的测定 在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数 （1）电镜下直接计数 （2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。 此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。 2、病毒的感染性测定 测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。 病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。 病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。 （1）噬菌斑的测定 噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。它是phage存在的一种指示性指标。 在液体培养基中培养物变清。一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。 ①双层平板法 底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固 指示菌0.2 ml、检样0.1 ml →32℃16-24h 测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼
牛病毒性腹泻粘膜病病毒的分离鉴定
石河子大学动物科技学院 201 5 - 2016学年第2学期 课程名称：兽医学专业基础理论 任课教师：贾斌（教授） 专业：预防兽医学 年级：2015级 学号：2015201711 姓名：赵阳 2016年6月11日
牛病毒性腹泻粘膜病病毒生物学特性和分离鉴定的研究进展的综 述 摘要：牛病毒性腹泻病毒（BVDV)是反刍动物和猪体内广泛存在的危害动物健康的重要病原体。BVDV感染牛后主要引起牛的持续性感染、免疫耐受、免疫抑制、繁殖障碍及急慢性黏膜病等临床症状，给养牛业造成重大的损失。其致病机理非常复杂，给该病的治疗和根除带来极大的困难。随着分子病毒学研究的发展以及对猪瘟病毒和黄病毒科其他成员的研究，人们在BVDV 分子水平和细胞水平的研究方面也取得了一些进展。就此，作者从BVDV入侵细胞、在细胞内的复制以及与宿主蛋白分子相互作用等方面进行综述，有助于阐明BVDV 致病和在体内持续存活的机制，为该病的防治和疫苗研发提供新的思路和对策。 关键词：牛病毒性腹泻病毒；病毒复制；宿主细胞；相互作用 牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Di arrhea Virus-BVDV），又称为牛病毒性腹泻黏膜病病毒,(Bovine Viral Diarrhea - Mucosal Disease Virus BVD-MDV）是一种世界范围广泛分布的危害动物健康的重要病原体。它不仅感染牛，而且能够感染猪、绵羊、山羊、鹿、骆驼及其他野生动物[1]。临床上引起一系列复杂的症状，主要包括牛的病毒性腹泻、急慢性黏膜病、免疫耐受和持续性感染、免疫抑制、繁殖障碍、血小板减少和出血症等，致病机理非常复杂，由于缺乏有效的防控技术，使该病在全球普遍流行，严重影响养牛业生产的各个环节［２］。BVDV是一种有包膜的单股正链RNA病毒，通过依赖宿主细胞生物和生物化学的遗传多样性及生命周期复制和生存。同其他病毒一样，感染BVDV 的细胞对那些有利于病毒复制和生存的基因表达进行了修饰，上调宿主细胞中参与翻译和翻译后过程的编码基因，下调与细胞能量产生和细胞结构相关的编码基因。在动物机体。可见，BVDV,在动物机体内复制完成感染的过程中宿主细胞对于病毒的复制、包括蛋白翻译、蛋白修饰、蛋白转运以及子代病毒的释放是必不可少的。那么在病毒侵染的过程中，哪些宿主分子参与了病毒的复制？哪些病毒蛋白影响了宿主的信号转导途径？这些显然是揭示B VDV致病和持续性感染的关键问题，但是目前对于BVDV蛋白参与病毒复制、与宿主蛋白相互作用的研究报道很少，更多的了解则是来源于同属猪瘟病毒（CSFV）和同科丙型肝炎病毒（HCV）的研究。作者从BVDV侵染细胞、BVDV的复制以及与宿主蛋白的相互作用３个方面进行综述，以期为认识BVDV的侵染机制和开发新的防治药物及疫苗提供依据。 1、BVDV致病机理 1.1 BVDV持续感染与免疫耐受 持续感染 (persistent infection,PI)是BVDV感染动物的一种重要临床型,也是BVDV在自然环境中维持存在的一种形式，是由于妊娠母畜在怀孕早期(约姓娠 120天 )通过子宫内感染非致细胞病变型 (N
轮状病毒 腹泻病例分析
轮状病毒性肠炎、中度等渗性脱水病例分析 1.病例介绍 姓名：xxx性别：男年龄：11月住院号：19003585 入院日期:2019-04-29出院日期：2018-05-03患者，男，11月，主因“解水样便伴发热4天，尿少伴精神萎靡1天”入院。患儿入院前4天解黄色水样便7-10次/日，带少许粘液，无腥臭味，量多少不定。无脓血便，无里急后重感，无便前便后哭闹。呕吐胃内容物，进食时呕吐明显，2-4次/日，非喷射性呕吐。发热，呈不规则发热，每日2-3次，体温最高达38.5℃。在家给予“蒙脱石散；妈咪爱”等药口服治疗，发热时给予“布洛芬混悬液 3.5ml/次”口服后体温下降正常但易反复发热。近1天来腹泻次数增加，夜间出现尿少，精神萎靡，哭时泪少。无烦渴、无思饮。今急来就诊办理住院治疗。自病以来饮食渐差，思睡，体重无明显变化。 个人史及家族史：G2P2,足月。顺产。出生体重：2750克。否认产伤窒息史。母乳喂养。现食母乳+普食。父母非近亲结婚，家族成员中无传染病史，无遗传性病史，无肿瘤病史。 体格检查：T:36.8℃HR:120次/分R:34次/分W:8Kg，精神萎靡，哭声弱，泪少，前囟凹陷（约1.0cm×0.8cm）,眼眶凹陷，口唇干，皮肤无花斑，皮肤弹性降低。腹部轻度膨隆，软，无拒按，肝脾未触及，肠鸣音10次/分。手足凉。毛血管充盈时间3秒。 辅助检查：4月29日：血常规：WBC12.8×10^9/L，N61%PLT430×10^9/L，CRP4.44mg/l；粪便常规：轮状病毒抗体：阳性，潜血：
(++)；肝功：ALT：43.4U/L；AST：55.7U/L；肾功：UA：583umol/L；电解质：钙Ca：2.28mmol/L，钾K：3.01mmol/L，钠Na：133mmol/L；氯CL：104mmol/L；血气分析：正常。心电图：窦性心律，律齐。4月30日尿常规+镜检：蛋白质：（1+），白细胞：（+），潜血：(+)；5月1日复查血常规：10.02×10^9/L，N51%，PLT230×10^9/L；复查电解质：钾K：4.01mmol/L；钠Na：132mmol/L；氯CL：112 mmol/L；尿酸：235umol/L；5月2日复查尿常规+镜检：蛋白质：（-），白细胞：（-），潜血：(-)；粪便常规：轮状病毒抗体：弱阳性，潜血：(-)。 2.诊疗经过 患儿发病特点：①11个月婴儿，起病急，春夏交替季；②解黄色水样便，7-10次/日，伴发热、呕吐，尿少；③精神萎靡，中度脱水征，腹部稍膨隆，肠鸣音10次/分，手足凉，毛血管充盈时间3秒。入院前无相关实验室辅助检查。接诊患儿时需解决的问题：①该病最可能诊断？②收住后首先需做些什么？③第一天静脉补液方案？有相关实验室检查结果后结合患儿病情需解决的问题：①该病诊断？②诊疗方案？③怎样和患儿家长沟通患儿病情及相关卫生常识宣教？ 入院诊断:急性中型腹泻；中度脱水。 入院诊疗：①根据患儿病史及大便性质考虑轮状病毒感染性腹泻几率大，应防止疾病传染扩散，给予病房隔离，加强婴儿使用物品、医疗用品的管理，粪便管理，加强医护人员手卫生。②因患儿解水样便7-10次/日，伴发热、呕吐、精神萎靡、小便少，皮肤弹性降低，
病毒的分离与鉴定
（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方 法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，～。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃ ）内，做为“种子”，供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。 传代细胞培养 (Continous cell culture) 通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来（如
某地区轮状病毒性腹泻流行病学调查研究
某地区轮状病毒性腹泻流行病学调查研究 苏艳 【摘要】目的分析探讨某地区轮状病毒性腹泻流行病学特点与分布特征。方法使用免疫层析 双抗体夹心法对某地区400例婴幼儿腹泻的粪便标本进行轮状病毒检测。结果400 例婴幼儿粪便标本 中发现211 例轮状病毒, 轮状病毒检出率为52.75%；7~24 个月患儿病毒检出率最高；10~12 月份患儿 的发病率最高。结论轮状病毒是秋冬季节腹泻的主要发病原因之一, 发病高峰在 9~12 月份, 以3 岁 以下的婴幼儿为主要发病人群, 具有显著的季节性和年龄阶段性的特点。由于轮状病毒引起的腹泻使用 普通抗菌素治疗无效, 还可能影响到肠道的菌群稳定, 因此在治疗过程中需要进行病原学分析检测, 根 据结果对症治疗, 预防不良事件的发生。 【关键词】轮状病毒；腹泻；流行病学调查 DOI ：10.14164/https://www.360docs.net/doc/b8409818.html,11-5581/r.2015.23.017 病毒性腹泻的主要诱发原因有轮状病毒感染、杯状病毒 感染以及形状病毒感染等［1］ 。有将近42%的轮状病毒感染者 没有明显的症状, 主要传播途径为粪-口传播, 经过1~3 d的 潜伏期, 出现呕吐、腹泻、发热等症状, 具有极强的传染性［2］ 。 当前医学界并没有特异性的治疗方法, 抗生素药物不但无效 而且可能影响肠道菌群稳定。所以在临床治疗过程中一定要 尽快明确是否为轮状病毒感染, 及时采取对症治疗措施。 1 资料与方法 1. 1 一般资料某地区医院2014 年1~12 月对400 例婴幼 儿腹泻的粪便标本进行轮状病毒检测。其中男209 例, 女 191例；年龄40 d~5 岁, 平均年龄(2.34±0.86) 岁。 1. 2 方法应用免疫层析双抗体夹心法对400 例婴幼儿的 粪便标本进行轮状病毒检测, 对其临床检验结果进行回顾性 分析。实验室试剂为背景万泰生物药业公司生产的轮状病毒 诊断试剂盒。 2 结果 共发现211例轮状病毒感染, 轮状病毒检出率为52.75%； 其中114 例男患儿检测结果为阳性, 轮状病毒检出率为 54.55%, 97 例女患儿的检测结果呈阳性, 检出率为50.79%。 对患儿的发病年龄进行统计发现：0~6 个月患儿中有 31 例结果为阳性, 检出率为14.69%；7~12 个月患儿中94例 结果为阳性, 检出率为44.55% ；13~24 个月患儿中72 例阳 性, 检出率为34.12%；25~36 个月患儿中9 例阳性, 检出率 为 4.27%；>37个月的儿童中有5例检出阳性, 占2.37%。对 患儿的主要发病日期进行统计：211 例患儿中14 例在1~3
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定 2005-10-22 00:00:00 来源：本站原创点击数：评论：0我要评论 病毒分离的一般程序是：检验标本T杀灭杂菌（青、链霉素）T接种易感的动物（一）病毒的分离 出现病状鸡胚7病变或死亡细胞培养7细胞病变7鉴定病毒种型（血清学方法）无菌标本（脑脊液、血液、血浆、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10?20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是: 易感的动物7出现病状 检验标本7杀灭杂菌（青、链霉素）7接种鸡胚7病变或死亡7鉴定病毒种型（血清学方法） 细胞培养7细胞病变 无菌标本（脑脊液、血液、血浆、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10?20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1.细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture ）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，PH7.2?7.4。细胞培养适于绝大多 数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养（Primary cell culture）用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞， 加一定培养液，37 C孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养（Diploid cell cultune）原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退 化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生 长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。二倍体细胞一经