实验三 HPLC
液相色谱教程相色谱实验操作
液相色谱教程相色谱实验操作液相色谱（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物、制药、环境科学和食品科学等领域的分析技术。
本文将介绍液相色谱实验的基本操作步骤，以帮助读者更好地了解和掌握该技术。
实验前准备：1.准备好实验所需的HPLC仪器和耗材，包括色谱柱、固定相、溶剂、样品和标准品等。
2.进行前的实验室准备，确保实验台面整洁，试剂摆放井然有序。
步骤一：样品准备1.样品制备：准备好需要分析的样品，确保样品质量和净度，并按照实验要求进行前处理。
2.样品溶解：将样品溶解于适当的溶剂中，以获得所需浓度的溶液，并用过滤器除去杂质。
步骤二：色谱柱选择和准备1. 色谱柱选择：根据实验要求和分析目的选择合适的色谱柱材质和类型。
常见的色谱柱材质包括C18、C8、Silica gel等。
2.色谱柱准备：根据色谱柱的要求进行装柱，包括柱后法、柱前法和封口法等。
步骤三：溶剂体系选择和准备1.溶剂体系选择：根据样品的特性和所需的分离效果选择合适的溶剂体系，包括单溶剂和混合溶剂等。
2.溶剂准备：准备好所需的溶剂，并使用高纯度的有机溶剂，并用过滤器或其他方法除去杂质。
步骤四：HPLC仪器设置和优化1.仪器设置：按照实验要求设置好HPLC仪器的参数，如波长、流速、柱温等。
2.优化条件：对于分离效果不佳的样品，可逐渐调整实验条件，并记录下各条件下的结果，以找到最佳分离条件。
步骤五：实验操作1.样品进样：将样品溶液注射到色谱柱中。
通常采用自动进样器或手动进样器进行操作。
2.色谱柱运行：打开HPLC仪器，开始柱运行。
随着溶液通过色谱柱的过程，样品中的组分将逐渐分离并通过检测器。
3.数据收集与分析：利用检测器检测样品组分，并采集色谱图谱和峰面积等数据。
根据实验目的可以选择不同的检测器，如紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器等。
步骤六：结果解释和报告1.观察色谱图谱：根据检测器得到的色谱图谱，观察各峰的形状、峰高、峰面积等，并根据相关标准进行数据分析。
药物分析实验习题答案
药物分析实验思考题参考答案实验一 甲硝唑片溶出度的测定-----------------------------------------------------------------------------------------------1 实验二 RP(Reverse Phase)-HPLC(High Performance Liquid Chromatography)测定醋酸地塞米松片的含量2 实验三 Gas Chromatography(GC,气相色谱法)测定维生素E软胶囊的含量-----------------------------------------2 实验四 永停滴定法测定磺胺嘧啶的含量-----------------------------------------------------------------------------------3 实验五 复方磺胺甲噁唑片的含量测定--------------------------------------------------------------------------------------4 实验六 阿司匹林Aspirin的红外光谱(IR, Infrared Spectroscopy)鉴别-------------------------------------------------4 实验七 薄层扫描法测定卷烟中尼古丁的含量-----------------------------------------------------------------------------5 实验八维生素B1注射液的含量测定------------------------------------------------------------------------------------------5 实验九 荧光分光光度法测定维生素B2片的含量-------------------------------------------------------------------------6 实验十AAS法龙牡壮骨颗粒中钙的含量--------------------------------------------------------------------------------------6实验一 甲硝唑片溶出度的测定1. 何为溶出度？哪些类型药物需做溶出度实验？溶出度：是指药物从片剂等固体制剂在规定溶剂中溶出的速度和程度。
HPLC方法测定甘氨酸的研究方法第三组
HPLC方法测定甘氨酸的研究方法第三组
一、引言
甘氨酸属于α-氨基酸，是人体必需氨基酸之一，是高度水溶性的阴离子。
在各种微生物，藻类，动植物中都有存在，是构成蛋白质和多种细胞组分的重要原料，也是药物合成的重要中间体，近几年，由于甘氨酸的营养价值和应用和开发的发展，引起了国内外学者们的广泛关注。
为此，预先了解甘氨酸特性，确定其含量是极其重要的。
而高效液相色谱法（HPLC）是目前存在的一种常用的快速，灵敏，准确的甘氨酸测定方法。
二、实验原理
HPLC是一种分离技术，用于对物质中的多种元素进行分离和测定，是化学分析技术中应用最广泛的实验方法之一、它综合了一定的离子交换树脂柱层和高压泵实现对物质的柱分离，用光度计、多色检测对柱外分离液体中的组分进行分析测定，用特定的洗脱液或复合洗脱液对柱层污染物进行洗脱，重新建立测量条件，采用计算机控制技术，可实现自动化，分析灵敏度高，精度高，结果稳定可靠，是测定甘氨酸含量的有效方法。
三、样品处理
1.样品粉末或溶液消毒：取样品，在恒温热水浴中加热，达到极限温度，并保持30分钟；
2.将消毒的样品放入适当容器中，加入25mL洗脱液，稀释后搅拌；。
hplc 化学
hplc 化学HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的分析技术，广泛应用于化学、生物、制药等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器和应用。
一、HPLC的原理HPLC是一种基于液相传质的色谱分析方法。
其基本原理是将待测样品通过高压泵送入色谱柱，样品中的组分在固定相上发生分离，然后通过检测器进行检测。
HPLC的分离效果主要依赖于色谱柱和流动相的性质。
常用的色谱柱有反相柱、离子交换柱、手性柱等，流动相可根据需要选择有机溶剂和缓冲液。
二、HPLC的仪器HPLC的仪器主要包括高压泵、进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统。
高压泵用于提供稳定的流速和压力，进样器则用于将样品引入色谱柱。
色谱柱是HPLC的核心部件，不同的色谱柱可实现对不同化合物的分离。
常见的检测器有紫外可见光检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
数据处理系统用于记录和分析实验结果。
三、HPLC的应用1. 定性分析：HPLC可用于快速鉴定样品中的化合物，通过与已知标准品的保留时间和峰形进行比对，确定样品中化合物的种类和含量。
2. 定量分析：HPLC可以精确测定样品中化合物的含量，常用于药物分析、环境监测等领域。
3. 分离纯化：HPLC可用于分离和纯化混合物中的目标化合物，广泛应用于制药、天然产物提取等领域。
4. 质量控制：HPLC可用于药品、食品等产品的质量控制，保证产品的安全性和有效性。
5. 新药研发：HPLC在新药研发过程中起到关键作用，通过HPLC分析药物代谢产物、药物稳定性等，评估新药的药代动力学和药效学特性。
HPLC作为一种高效、精确的分析技术，在化学领域有着广泛的应用。
它不仅可以用于定性分析、定量分析和分离纯化，还可以用于质量控制和新药研发。
随着技术的不断发展，HPLC的应用范围将会进一步扩大，为科研和产业提供更多的支持。
HPLC方法学验证
HPLC方法学验证高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是现代分析化学中常用的一种分离和检测技术。
它通过溶液中混合物组分的分配系数差异、亲和性差异、反应性差异等物理和化学特性，将混合物中的成分分离并通过检测器进行定量分析。
HPLC方法学验证的目的是评估和验证HPLC方法在其中一种特定条件下的适用性。
验证的步骤和标准通常遵循相关的法规和指南，如美国药典（USP）和国际协会（IUPAC）等。
以下是HPLC方法学验证的主要内容：1.精密度：通过连续多次注射样品，计算分析结果的相对标准偏差，评估方法在短期内的重复性。
2.准确度：通过添加已知浓度的标准溶液或纯品，检测其在样品中的回收率，评估方法的准确性。
3.线性范围：通过测定一系列浓度不同的标准溶液，绘制峰面积与浓度之间的线性回归曲线，评估方法的线性范围。
4.检测限和定量限：通过逐渐降低标准品浓度，确定最低可检测浓度和最低可定量浓度。
5.选择性：通过分析含有其他干扰物质的复杂样品，验证方法对目标成分的选择性。
6.准确性：通过与其他已建立的分析方法进行比较，评估新方法与已有方法的一致性。
7.精确度：通过不同操作人员、不同仪器、不同试剂等条件下的重复性测试，评估分析结果的一致性。
8.稳定性：通过在不同时间、温度和储存条件下的分析结果比较，评估方法在长期和不同条件下的稳定性。
HPLC方法学验证需要详细记录实验过程和结果，并进行统计分析。
通常，多次独立实验（至少三次）并计算结果的平均值、标准偏差和相对标准偏差。
如果符合要求，该方法即可认为是有效可靠的，并可以应用于具体的样品分析。
在HPLC方法学验证结束后，还需要定期进行方法的核查和验证，以确保方法的持续有效性。
方法的效能也可以通过参与国际或国内规范样品分析比对（如美国药典认可的试剂或样品）来进行评估。
总之，HPLC方法学验证是确保新牵涉到患者健康或食品安全的方法的准确性、可靠性和有效性的重要步骤。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过高效液相色谱技术，对给定的混合物进行分离和分析，掌握高效液相色谱仪的操作方法，以及对不同成分的定量分析。
二、实验原理。
高效液相色谱（HPLC）是一种高效、灵敏、准确的分析技术，它利用高压泵将样品溶液以高压送入色谱柱，通过与填料相互作用而进行分离。
在色谱柱中，不同成分将因其在填料中的亲和力不同而被分离开来。
通过检测器检测各个组分的峰面积或峰高，从而进行定量分析。
三、实验步骤。
1. 样品制备，将待分析的混合物溶解于适当的溶剂中，并进行过滤处理。
2. 色谱柱准备，连接色谱柱，并进行平衡处理。
3. 仪器调试，将色谱仪的流动相、检测器等参数进行调试。
4. 样品进样，将处理好的样品通过自动进样器送入色谱柱。
5. 数据采集，通过色谱仪软件进行数据采集和记录。
6. 数据分析，根据色谱图进行各组分的峰识别和定量分析。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功地对给定的混合物进行了分离和定量分析。
得到了混合物中各组分的峰面积和峰高，并通过标准曲线进行了定量分析。
实验结果表明，本实验的色谱分离效果良好，各组分分离度高，定量分析结果准确可靠。
五、实验总结。
通过本次实验，我们掌握了高效液相色谱技木的基本操作方法，了解了色谱柱的选择和调试、样品的制备和进样、数据采集和分析等基本步骤。
同时，我们也认识到了高效液相色谱技术在化学分析中的重要性和广泛应用性。
希望通过今后的实验操作，能够进一步提高我们的操作技术和分析能力。
六、参考文献。
1. Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principles of instrumental analysis. Cengage Learning.2. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Glajch, J. L. (2011). Practical HPLC method development. John Wiley & Sons.以上就是本次高效液相色谱实验的全部内容，希望对大家有所帮助。
hplc的注意事项 -回复
hplc的注意事项-回复公式高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于生物医药、食品安全和环境科学等领域。
在使用HPLC进行实验时，有一些注意事项需要遵守，以确保结果的准确性和可重复性。
本文将逐步介绍HPLC的注意事项。
第一步：设备准备在进行HPLC实验之前，首先要确保设备的正常运行。
检查液相色谱仪的仪器参数，如流量、温度、压力和检测器的灵敏度等。
确保所有设备和仪器都处于良好的工作状态，并且有足够的试剂和耗材。
第二步：样品准备正确的样品准备是进行HPLC分析的关键。
首先，确定分析的目的和需求。
根据实验目的选择合适的溶剂和样品制备方法。
特别是对于复杂的样品，如生物样品，可能需要进行样品前处理，如蛋白质沉淀、固相萃取等。
第三步：试剂选择选择适当的试剂是确保HPLC实验成功的关键。
根据需要选择合适的溶剂、流动相和内标等。
溶剂的纯度和质量对实验结果至关重要，因此应尽量使用高纯度的试剂。
在选取流动相时，要考虑分离效果、分离时间和方法的可重复性。
选择合适的柱也是确保HPLC分析成功的关键。
柱的选择应考虑分离目标、样品性质和需求。
常见的柱类型有反相柱、离子交换柱和手性柱等。
在选择柱时，还要注意柱的尺寸、填充物和使用寿命等。
第五步：方法优化在进行HPLC实验之前，需要进行方法的优化。
优化的主要目标是提高分离效果、减少分离时间和提高方法的可重复性。
优化的关键点包括流量、温度、柱温控制、梯度程序和检测器的选择等。
通过优化方法，可以获得更好的实验结果。
第六步：系统稳定在进行HPLC实验之前，需要进行系统的稳定。
根据设备和方法要求，进行系统预运行和平衡。
确保系统的压力、流量和温度等参数在稳定的范围内。
在进行实验之前，还要做好基线的调整和峰形图的检查。
第七步：实验操作在进行实验操作时，需要注意以下几点。
首先，要准确记录所有的实验条件和参数，如溶剂的选择、柱的类型和条件、流量和梯度程序等。
其次，要严格控制实验过程中的温度，尤其是对于温度敏感的化合物。
高效液相实验报告
一、实验目的1. 熟悉高效液相色谱（HPLC）的基本原理和操作方法。
2. 掌握液相色谱仪的构造及其各部分的功能。
3. 学习并运用高效液相色谱法对样品进行分离和定量分析。
二、实验原理高效液相色谱法是一种利用高压液体作为流动相，通过固定相对样品进行分离和分析的技术。
其原理基于不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异，从而实现分离。
实验中，样品经过高压泵送入色谱柱，在流动相的作用下，不同物质在色谱柱中停留时间不同，从而实现分离。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：高效液相色谱仪、色谱柱、流动相过滤器、样品瓶、高压泵、检测器、数据工作站等。
2. 试剂：乙腈、甲醇、水、磷酸、氨水等。
四、实验步骤1. 样品准备：准确称取一定量的待测样品，用适当溶剂溶解，配制成一定浓度的溶液。
2. 流动相配置：根据实验要求，配置合适的流动相，并进行过滤。
3. 色谱柱准备：将色谱柱安装在色谱仪上，用流动相进行冲洗，去除色谱柱中的杂质。
4. 上样：将配制好的样品溶液注入色谱仪，通过高压泵送入色谱柱。
5. 分离：在流动相的作用下，样品中的各组分在色谱柱中依次流出。
6. 检测：利用检测器对流出物进行检测，记录色谱图。
7. 数据分析：利用数据工作站对色谱图进行分析，计算各组分的含量。
五、实验结果与分析1. 样品分离：实验中，样品中的各组分在色谱柱中得到了有效分离，分离效果良好。
2. 定量分析：根据标准曲线，计算各组分的含量，结果如下：| 组分名称 | 含量（%） || -------- | -------- || 组分1 | 2.5 || 组分2 | 1.8 || 组分3 | 0.9 || 组分4 | 0.5 |3. 误差分析：实验过程中，可能存在以下误差：- 仪器误差：色谱仪、检测器等仪器本身的精度和稳定性对实验结果有一定影响。
- 试剂误差：试剂的纯度和浓度对实验结果有一定影响。
- 操作误差：实验操作不规范、样品处理不当等因素可能导致误差。
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芳香族化合物的定性、定量分析—高效液相色谱法
1 实验目的
了解并掌握高效液相色谱法的分离原理 学习并掌握高效液相色谱仪的操作 掌握保留时间初步定性和外标法的定量方法 学习使用Empower Pro中文版色谱工作站处
理数据
2 实验原理和仪器结构
2.1 高效液相色谱法分离原理
高效液相分配色谱法有反相或正相色谱法两种分离模式。
1 2 A / A U 3
t / min
1 苯；2 甲苯；3 二甲苯 苯、甲苯、二甲苯混标工作溶液高效液相色谱分离图
A / A U
λ/nm t / min
苯、甲苯、二甲苯混标工作溶液的3 D图
A / A U
λ/nm
苯的紫外吸收光谱图
5.2.7 关机：测试完毕，先用100 %水冲洗至压力平衡， 持续10 min，改为90 %甲醇水溶液洗脱至柱压平衡， 持续5 min。将流速设置为0 mL/min后顺序关闭 WATERS 600、2996电源开关。关闭氦气钢瓶气阀。 处理数据打印报告后，关闭计算机和总电源开关。
反相高效液相色谱法是指采用非极性固定相（如C18等）、极
性溶剂（如甲醇等）作为流动相的一种分离模式。正相色谱法 与反相色谱法相反，它是以极性固定相（如带有氨基和氰基的
固定相），非极性溶剂（正己烷等）为流动相的一种液相色谱
分离模式。极性较强或亲水的样品分子和反相柱中的固定相上 的相互作用较弱，分配较少，因此随着流动相较快流出，反之，
疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用，在柱
内保留的时间相对较长。
HPLC分离的机理
分 离 是 一 个 物 理 的 过 程 。
色谱柱分离示意图
本实验采用反相色谱分离模式
2.2 仪器流程
色 谱 泵 进 样 器
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
六通阀的工作原理
装样
（ＬＯＡＤ）
进样
进样阀
6 实验数据处理
6.1 试样溶液中组分的定性 根据标准样品溶液中组分的各自相对保留时间，对试 样溶液中的组分进行对比定性确认。 6.2 试样溶液中组分含量的计算 6.2.1 外标法手动计算试样中各组分的浓度含量
定量分析就是要测定样品中某一组分的准确含量。常 用色谱的定量方法有内标法和外标法。本实验采用定量 管外标法。
8 对实验报告的要求及说明
8.1 实验报告内容应包括实验目的、原理和实验 结果。 8.2 对实验结果和实验过程的综合分析。 8.3 对本实验设计的评价和建议。 8.4 每小组共用计算机打印出的苯、甲苯、二甲 苯标准混和工作溶液和试样溶液的色谱图和 数据。
9 思考题
9.1 从仪器构造、分离原理和应用范围三
5.2 开机测定样品 5.2.1 使用HPLC级流动相，必要时自行制备；水为 二次蒸馏水。用前均需过0.22 µ m滤膜。 5.2.2 流动相脱气：打开氦气（99.999 %）高压钢 瓶，调节减压阀输出压力0.5 MPa。确认流动相 管线和相对应的脱气管线。开始洗脱前，以100 mL/min的速率脱气至少15 min，然后以20 ~ 50 mL/min速率维持脱气，直至分析工作完成。 5.2.3 开机：顺序接通WATERS 2996、600。打开 计算机电源，进入WINDOWS XP，启动 Empower Pro中文版色谱工作站。
7 注意事项
7.1 首先打开检测器，避免其他组件的干扰， 避免检测器的自检不通过。 7.2 用微量进器吸取样品溶液时，不要将气 泡注入色谱系统中，以免引起系统压力 不稳。 7.3 分析样品前，首先吸取一定量的溶剂， 注入色谱仪，记录溶剂色谱峰。 7.4 及时添加流动相，工作状态时切不可使 液面低于泵头。
方面比较HPLC和GC的异同点。 9.2 为获得对混和物较好的分离度，总结 高效液相色谱法可以调整的分析条件。 9.3 试分析苯的保留时间为什么比甲苯的 短？
5.2.4 排除泵室气泡：当正常工作流速时显示无压 力或压力波动时，此时一般要排气。方法是打 开排液阀，设置流速10 mL/min，待排出气泡后 恢复原有设置。 5.2.5 双击配置系统，建立分析项目。双击运行样 品，创建方法组。根据实际分析的样品和要求， 设置WATERS 600泵和检测器的工作参数。顺 序点击设置、进样按钮，准备开始分析。
淋洗液
（ＩＮＪＥＣＴ）
淋洗液
废液 废液 样品
样品
至分离柱 样品环
至分离柱
3 实验仪器设备、试剂、溶液 和实验用品
3.1 仪器 高效液相色谱仪：美国WATERS 600高压泵， WATERS 2996型二极管阵列检测器和Rheodyne 7725i 六通阀进样器；Empower Pro中文版色谱工作站； BS210S型电子分析天平；100 µ L微量进样器。 3.2 试剂与样品 甲醇（99.9 %）：色谱纯；水：二级水；苯 （99.5 %）、甲苯（99.5 %）、二甲苯（99.0 %）均 为分析纯；试样。
6.2.2 用Empower Pro中文版色谱工作站自动计算试样中各组分的含量 选择标准工作溶液文件，双击进入主窗口，提取色谱图。点击处理 方法指南→新建处理方法→处理类型：PDA→下一步→下一步→用鼠标 拖放选择积分范围→下一步→最小面积：10000→下一步→下一步→输 入色谱峰名称→下一步→输入标样中各组分的名称、含量及单位→下一 步→外标校正→下一步→下一步→下一步→下一步→输入方法名称→完 成。 返回主窗口界面。点击方法组，选择采集分析数据时用的仪器方法， 点击文件保存到方法组，关闭。在项目窗口点击修改样品快捷键，将样 品类型由未知改为标准样，点击量快捷键，输入量值和单位。点击从方 法组复制快捷键，打开，确定，存盘退出。点击项目窗口中更新，原来 未知变为标准样。此时，标准样品建立完毕。将标准样品和试样文件选 上，右键查看，从文件中打开方法组，按结果快捷键，即可显示标准样 品结果。按浏览中下一个3D通道，可显示出试样的计算结果。
5 实验步骤
5.1 标准工作溶液和试样溶液的配制 先取少许流动相置于100 mL容量瓶中，放入天 平中去皮归零，用移液管分别量取0.1 mL苯、甲苯、 二甲苯于容量瓶中并依次称重，精确至0.0001 g，然 后用流动相定容制备成标准溶液母液。取标准溶液 母液0.3 mL用流动相稀释定容至10 mL即配制成约30 g/mL的苯、甲苯、二甲苯标准混合工作溶液。 试样溶液由实验课教师配制编码并分发给各实验 小组。
5.2.6 进样：将六通阀手柄置于LOAD状态。用微量进样器装样， 注入5倍于定量管体积的试样溶液；装样后将手柄顺时针置于 INJECT状态开始进样，同时会听到蜂鸣声及屏幕提示，这时 工作站开始记录。待进样后2 ~ 3 min，将手柄转回LOAD位置， 这时才能取下进样器，装样准备开始下次分析。注意必须使用 液相色谱仪专用进样器，避免损坏阀片，造成漏液。在规定的 高效液相色谱分析条件下，待基线平稳后，连续注入数针标准 混和工作溶液，直至相邻两针的峰面积变化小于1.5 %时，按 照进样规则的顺序（标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶 液）进样分析。本实验先对苯、甲苯、二甲苯单标溶液逐一进 样分析，确定苯、甲苯、二甲苯的各自相对保留时间。接下来 用苯、甲苯、二甲苯标准混和工作溶液进样建标后，获得相应 的色谱图和典型光谱图，并在相同分析条件下对试样溶液进行 测定，确证组分，计算结果。
外标法又可分为标准曲线法或单点或双点校正曲线法。 本实验采用单点校正曲线法。将测得的两针试样溶液以及其
前后两针标准混合工作溶液，相应组分的峰面积，分别进行
平均。 以浓度表示的各组分含量X（g/mL），按下式（3）计 算：
X
式中：
C 1 A2 A1
……………………………（3）
C1 — 标样溶液中，相应组分的浓度（g/mL）； A1 — 标样溶液中，相应组分峰面积的平均值； A2 — 试样溶液中，相应组分峰面积的合标准工作溶液（约30 g/mL）；试样溶液。 3.4 实验用品 每小组按4人计，容量瓶：100 mL 1只（共 用）；具塞刻度试管：10 mL 5支；移液管：0.1 mL 3支（共用）、1 mL 1支（共用）。
4 高效液相色谱仪的操作条件
流动相：甲醇水=7525； 流动相流速：0.8 mL/min；氦气鼓泡脱气； 色谱柱：Waters C8 (150 mm4.6 mm5 µ m)不锈钢柱； 定量管：20 L； 柱温：25 ℃； 检测波长范围：195 nm ~ 400 nm； 提取波长：254 nm； 采样速率：1.0； 分辨率：1.2 nm； 仪器控制：自动曝光； 3D数据采集； 保留时间：苯：约3.0 min；甲苯：约3.8 min；二甲苯：约4.7 min。