高效液相色谱实验报告

高效液相色谱实验报告
一、实验目的
1了解液相色谱的发展历史及最新进展
2 学习液相色谱的基本构造及原理
3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过HPLC分离测定来对目标化合物的分析鉴定。

二、实验原理
液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。

当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。

液相色谱与气相色谱相比，最大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。

高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。

80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。

三、高效液相色谱的分类
吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法
四、高效液相色谱仪的基本构造
高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。

1 输液系统：
包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。

贮液装置用于存贮足够量、符合HPLC要求的流动相。

高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，因此需要高压泵输送流动相。

2 进样系统：
将待测的样品引入到色谱柱的装置。

液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。

进样系统包括取样、进样两项功能。

3 分离柱：
色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。

商品化的HPLC微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。

采用的固定相粒度甚至可以达到1μm，而制备色谱所采用的固定相粒度通常大于10μm。

HPLC填充柱效的理论值可以达到50000/m～160000/m理论板，一般采用100-300mm的柱长可满足大多数样品的分析的需要。

由于柱效内、外多种因素的影响，因此为使色谱柱达到其应有的效率。

应尽量的减小系统的死体积。

4 检测系统：
HPLC检测器分为通用型检测器和专用型检测器两类。

通用型检测器可连续测量色谱柱流出物（包括流动相和样品组分）的全部特性变化。

这类检测仪器包括示差折光检测器、介
电常数检测器、电导检测器和磁光旋转检测器。

这类检测器适用范围广，但是对于流动相有响应，受温度变化、流动相流速和组成变化的影响，检测灵敏度低，不能用于梯度洗脱的分离模式。

专用型检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，可用于测量被分离组分某类特性的变化。

这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、放射性检测器。

5 数据处理系统：
数据处理系统可以分为数据处理系统和专用智能处理系统两类，前者可以完成一般的色谱数据处理任务，有些软件可以实现部分仪器的控制功能。

前者即一般的色谱工作站，后者通常称之为专家系统。

五、实验数据
数据一：
数据二：
ＨＰＬＣ－Ｌ
1 1
六、高效液相色谱的使用中的注意事项
流动相：
1 、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；
2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；
样品：
1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；
手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；
色谱柱：
1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；
2、使用符合要求的流动相；
3、使用保护柱；
4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；
6、不要高压冲洗柱子；
7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；。