高效液相色谱方法的验证
高效液相色谱仪验证方案
高效液相色谱仪验证方案验证文件类别：技术标准编号：V-A-c-004-0部门：验证委员会页码：共1页，第1页版次：¨新订¨替代：起草：年月日部门审核：年月日审阅会签：（验证委员会）批准：年月日实施日期：年月日复印数：批准：分发至：目录1.设备基本情况1.1概述1.2基本情况3职责3.1验证委员会3.2工程处3.3Qc4验证内容4.1安装确认4.1.1安装确认所需文件资料 4.1.2关键性仪表及消耗性备品4.1.3评价仪器的安装是否符合GmP及供应商提议的要求4.1.4起草标准操作规程4.2校正4.2.1紫外检测器4.2.1.1固定波长紫外检测器波长示值误差的校正4.2.1.2可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差和重复性误差的检定4.2.2高压泵4.3运行确认4.3.1紫外检测器4.3.2高压泵4.4性能确认4.4.1最小检测浓度4.4.2定性、定量测量的重复性4.5拟订再验证项目及周期4.6验证结果评定与结论1.设备基本情况1.1概述本高效液相色谱仪主要由一个二元泵、一个柱温箱、一个可变紫外检测器、一个带有20μL定量环的进样器和一台工作站组成，各部分由工作站软件控制。
本仪器主要用于分析原料和成品的有关物质和含量。
1.2基本情况设备编号：设备名称：高效液相色谱仪型号：生产厂家：供货厂家：安装日期：使用部门：工作间：保管员：2．验证目的为确认高效液相色谱仪测试数据准确可靠，性能稳定，特制订本验证方案，对高效液相色谱仪进行验证。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证委员会批准。
3职责3.1验证委员会1.负责验证方案的审批。
2.负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。
3.负责验证数据及结果的审核。
4.负责验证报告的审批。
5.负责再验证周期的确定。
3.2工程处1.负责设备的安装、调试，并做好相应的记录。
高效液相色谱仪验证
中心化验室型高效液相色谱仪验证（一）验证方案（二）验证报告药业有限公司中心化验室型高效液相色谱仪验证方案（SOP-YZ-???）方案制定人：制定日期：方案审查人：审查日期：方案审核人：审核日期：方案批准人：批准日期：药业有限公司目录1、概述2、验证目的3、验证实施小组成员及有关责任4、验证文件5、合格标准6、验证方法和步骤7、验证结果分析和综合评价8、最终评价9、验证周期10、验证记录1、概述高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。
由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
其中LC-2010和Agilent1100型为单泵型，LC-20AB型为双泵型高效液相色谱仪。
2、验证目的检查并确认高效液相色谱仪运行性能符合要求。
3、验证实施小组成员及有关责任验证实施小组组长???负责协调及异常情况的处理；操作员??????负责验证的具体操作工作；QA???负责监督实施本方案。
4、主要验证文件高效液相色谱法（SOP-ZL-???）、中华人民共和国国家计量检定规程液相色谱仪（JJG705-2002）、UV-VIS检测器SPD-20A/SPD-20AV说明书、溶液传输单元LC-20AB说明书、中华人民共和国药典2005年版二部、LC-2010A/2010C操作说明书安装手册和维修手册。
5、合格标准6、验证方法和步骤6.1验证方法整个验证过程分为单个部件的验证和整机验证。
验证时一般先验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能验证。
HPLC有关物质分析方法验证
HPLC有关物质分析方法验证HPLC（高效液相色谱）是一种常用的物质分析方法，广泛应用于药品、食品、环境等领域。
为了保证分析结果的准确性和可靠性，对HPLC方法进行验证是非常必要的。
HPLC方法验证包括了准确性、精密度、线性范围、灵敏度、特异性和系统适应性等方面的评估。
首先，准确性是衡量方法是否精确地测量目标物质含量的能力。
方法准确性的验证包括添加回收试验、标准品浓度重现性试验以及样品稀释后的测试。
通过添加已知浓度的目标物质到待测样品中，在不同浓度下测定回收率，可以评估方法的准确性。
其次，精密度是衡量方法在短期内进行重复实验的一致性。
精密度的验证包括了重复测定试验以及系统精密度试验。
通过重复测定同一样品多次，计算相对标准偏差，可以评估方法的精密度。
线性范围是指方法在一定浓度范围内的目标物质含量与测定结果之间的关系。
验证线性范围时，需要测试少量目标物质的浓度，以及相对较高的浓度，测定结果在一定限度内应与浓度成比例关系。
灵敏度是指方法在检测限下测定目标物质的能力。
灵敏度的验证包括了检测限试验和定量限试验。
检测限试验是通过在基质中添加多个不同浓度的目标物质溶液，确定出检测限。
定量限试验是通过在基质中添加不同浓度的目标物质溶液，确定出定量限。
特异性是指方法所测定的目标物质与其他干扰物之间的选择性。
特异性的验证包括了干扰物试验和选择性试验。
通过加入干扰物到目标物质溶液中，然后进行测定，确定干扰物是否对结果产生影响。
选择性试验是通过测定其他可能存在的相关物质浓度，确定是否与目标物质有影响。
最后，系统适应性主要是验证HPLC仪器和设备的稳定性和可靠性。
系统适应性的验证包括了仪器精度试验和仪器稳定性试验。
精度试验是通过测定标准品溶液的浓度，评估仪器的精度。
稳定性试验是在一定时间范围内，对同一样品进行多次测定，评估仪器的稳定性。
在进行HPLC方法验证时，需要根据相关规范文件，制定详细的验证计划和方案，确保验证方法的全面性和科学性。
高效液相色谱仪的四种检测方法及计算
高效液相色谱仪的四种检测方法及计算高效液相色谱仪（HPLC）在化学、生物学、制药、食品等领域都有广泛应用，其检测方法多种多样，以下将详细介绍四种常用的检测方法及其计算方式。
一、紫外-可见光检测法 (UV-Vis)紫外-可见光检测法是最常用的HPLC检测方法。
在此方法中，样品组分在紫外或可见光区域有吸收，因此可以被检测。
计算方法一般采用峰面积或峰高法定量。
峰面积法比峰高法更为准确，因为它同时考虑了峰的高度和宽度。
在计算时，首先需要获得标准品的校正曲线，然后根据未知样品的峰面积或峰高在校正曲线上找到对应的浓度。
二、荧光检测法 (Fluorescence)荧光检测法的灵敏度通常比紫外-可见光检测法更高，但并非所有化合物都能产生荧光。
在这种方法中，样品组分被激发光照射后发出荧光，荧光强度与组分浓度成正比。
计算方式与紫外-可见光检测法类似，也是通过校正曲线进行定量。
三、电化学检测法 (Electrochemical Detection)电化学检测法通常用于检测具有电化学活性的化合物，如许多药物和神经递质。
它可以在没有光学性质的情况下对物质进行检测，提高了HPLC的应用范围。
常见的电化学检测方法包括安培检测法和电导检测法。
定量计算通常基于法拉第定律，即电流与通过电解池的电荷量成正比。
四、质谱检测法 (Mass Spectrometry)质谱检测法是与HPLC连用的一种高级检测方法，可以提供待测物质的分子量信息，从而确定其化学结构。
在此方法中，HPLC分离后的组分直接进入质谱仪进行检测。
定量计算通常使用内标法或外标法，需要对待测物质进行同位素标记或使用已知量的内标物质。
此外，还可以使用多反应监测模式（MRM）进行更准确的定量。
以上四种方法各有优缺点，应根据具体的应用需求和样品性质选择合适的方法进行检测和计算。
同时，为了获得准确可靠的结果，还需要对HPLC系统进行适当的维护和校准。
WATERS高效液相色谱仪验证方案
WATERS高效液相色谱仪验证方案名称：WATERS高效液相色谱仪验证方式：检验设备测试确认验证编号：目录1.设备的基本情况1.1.概述1.2.文件资料1.3.维修服务1.4.基本情况2.验证目的3.职责4.验证内容4.1.安装确认4.2.高压泵4.3.2489紫外检测器4.4.2424蒸发光散射检测器5.再确认6.验证周期7.验证确认8.验证结果确认9.附件1.设备的基本情况1.1.概述本仪器由美国WATERS公司生产，由1525泵、2489紫外检测器、2424蒸发光检测器、1500系列柱温箱及电脑系统组成。
主要用于我公司生产所需的各种原料药、中间体及成品的含量测定。
1.2.文件资料1.3.维修服务供货单位名称：本地维修站联系人：电话：1.4.基本情况2.验证目的为确认高效液相色谱仪测试数据准确可靠，性能稳定，能符合检验产品需求，特制订本验证方案，对高效液相色谱仪进行验证。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行。
3.职责QC：负责验证方案的起草及具体实施。
QC负责人：负责按验证方案组织实施验证工作，协助验证方案的起草，组织协调验证工作，总结验证结果，出具验证报告。
质量部经理：负责验证方案和验证报告的审核、以及对验证工作的管理。
负责验证数据及结果的审核，负责验证报告的审批，负责再验证周期的确定。
质量授权人：负责验证方案和验证报告批准。
4.验证内容4.1.安装确认4.2.高压泵4.2.1.流量准确度可执行标准：＜±3%（0.97ml/min～1.03ml/min，以蒸馏水为标准）测试方法：将输液系统、进样器、色谱柱（两通）和检测器连接好，以蒸馏水为流动相，将流速稳定后，分别设定1.0、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0ml/min六段，在流动相排出口用已恒重的比重瓶收集流动相，同时计时收集10分钟，称重，查表，即得。
4.2.2.流量精确度可执行标准：＜±0.3%（0.997ml/min～1.003ml/min，以蒸馏水为标准）测试方法：将输液系统、进样器、色谱柱（两通）和检测器连接好，以蒸馏水为流动相，将流速稳定后，设定流量为1.0ml/min，在流动相排出口用已恒重的比重瓶收集流动相，同时计时收集10分钟，称重，查表，即得，共收集5次。
LC-16高效液相色谱仪验证方案
高效液相色谱仪验证方案1.0 概述根据质量控制的要求，为满足分析检测工作的需要，我司新购高效液相色谱仪一台。
本仪器由LC-16高效液相色谱仪溶液传输单元，UM4800蒸发光散射检测器，C18色谱柱，色谱工作站及其它配套设备组成。
本仪器主要用于成品含量测定、鉴别，有关物质测定。
按照GMP规范和我司《验证管理规程》要求，对该仪器进行验证。
2.0验证目的2.1确认目前的实验室环境能够满足该仪器的使用，仪器的运行、性能符合相应的要求。
2.2确认该仪器能够满足我司日常分析检测工作的需要。
3.0适用范围本方案适用于LC-16高效液相色谱仪的验证。
4.0验证小组成员组长：邓忠志组员：邓红梅唐小曼5.0职责5.1检验小组职责：5.2 QA负责验证方案的审核和监督实施，验证报告的审核及验证的组织协调工作。
5.3 质量负责人负责验证方案的审批，验证报告的评定。
相关技术支持及本次验证过程参与人员的培训工作。
6.0参考文件7.0 进度计划：2016年11月10日，完成人员培训工作；2016年11月 11日至11月14日，完成安装确认及运行确认工作；2016年11月 15日至11月 16日，完成性能确认及适用性预实验工作；2016年11月17日进行数据分析汇总，完成验证报告8.0测试项目8．1人员培训确认目的:确认所有参与方案实施的人员经过验证活动培训。
程序：对方案实施人员进行LC-16高效液相色谱仪验证方案培训，并由培训人对培训效果进行评价。
方案实施人员熟悉LC-16高效液相色谱仪构造和运行，并填写培训记录。
可接受标准：所有方案实施人员已经过LC-16高效液相色谱仪验证方案培训，培训效果合格。
所有方案实施人员熟悉LC-16高效液相色谱仪构造和运行，培训记录存在。
测试报告：测试结果填写在测试报告1《人员培训确认》表内，如有偏差记录在偏差报告中。
8.2测试仪器仪表校准确认目的：确认测试使用仪器仪表均经过校准，且在有效期内。
高效液相色谱仪验证方案
高效液相色谱仪验证方案1.适用范围本方案适用于LC-10A高效液相色谱仪验证。
2.目的通过验证确认LC-10A高效液相色谱仪能够达到仪器性能指标，能符合检验产品需求。
3.职责质量部QC：负责验证方案的起草及具体实施设备动力科：协助验证的实施QC室主管：负责按验证计划组织实施验证工作QA验证管理员：负责验证工作的管理，协助验证方案的起草，组织协调验证工作，总结验证结果，出具验证报告质量部经理：负责验证方案审核质量总监：负责验证方案及报告的批准4.内容4.1.概述本仪器由日本岛津公司生产，由LC-10ATVP泵、LC-10ATVP检测器、LC-SCL控制器、Class-vp控制程序及电脑组成。
当供试品通过高压泵流动相带入色谱柱时，根据色谱柱箱温度以及柱内的填料，多次吸附和脱附，将供试品不同组份分开，进入检测器，绘出色谱图。
根据保留时间进行定性分析，根据峰高或峰面积进行定量分析。
该仪器主要用于各种原辅料、中间体、成品的含量测定。
4.2.预确认该仪器主要技术指标：波长范围：190～600nm 波长准确度：±1nm带宽：8nm 波长重复性：±0.1 nm基线漂移：≤2×10-4AU/h基线噪声：≤±0.35×10-5 AU光源：氘灯泵压力范围：0.1～39.2Mpa泵流量范围：0.001～5ml （0.1～39.2Mp）/min柱温箱温度范围：4～80℃技术指标是否符合中国药典2000版要求复核者：预确认者：4.3.安装确认4.3.1.目的确认仪器整个安装过程是否符合要求，编制仪器的使用SOP，并纳入文件管理系统，对操作人员进行操作培训考核，纳入培训档案。
4.3.2.安装确认：安装确认记录见表一。
4.4.运行确认4.4.1.基线噪声和基线漂移：在254nm处测定，结果见运行确认记录（表二）。
4.4.2.流动相流量：流动相为水，测试温度为25℃。
水在25℃时的密度为0.997041 g/cm3，先将三个10ml容量瓶干燥，分别称定重量后接收流动相，设定流动相流速为0.5ml/min，各接10分钟（用秒表准确计时），精密称定水的重量，水的重量分别为M1、M2、M3，计算流量设定值误差（S s）、流量稳定性误差（S R）均应≤±2%，结果见运行确认记录（表二）。
SOP高效液相色谱法检验操作规程
SOP高效液相色谱法检验操作规程SOP(S tandard O perating P rocedure)高效液相色谱法检验操作规程应包括以下内容，长度不少于1200字：一、目的和适用范围说明制定此操作规程的目的和适用范围，例如适用于其中一种特定的样品检验。
二、相关参考文件列举与此操作规程相关的参考文件，例如国家标准、行业标准、公司内部文件等。
三、术语和定义定义操作中可能出现的术语和缩写词的含义，以确保操作规程的清晰和一致性。
四、仪器设备确定用于该检验的高效液相色谱仪及其相关设备的说明和规格。
五、试剂和材料列出用于检验的试剂和材料，并提供其质量标准、存储要求和有效期等信息。
六、工作环境和安全要求确定进行检验时所需的工作环境和安全要求，包括所需的实验室设施、通风要求、个人防护措施等。
七、样品准备详细描述样品的获取、保存、处理和制备方法，确保样品的准备符合标准要求。
八、标准曲线制备说明制备标准曲线所需的试剂和材料、操作步骤和相关参数设置，以确保准确测量样品。
九、仪器校准和验证指导操作员如何校准和验证高效液相色谱仪以确保仪器的准确性和可靠性。
十、方法操作步骤详细描述高效液相色谱检验的操作步骤，包括进样器设定、流速设定、柱温设定、检测波长设定等，确保操作的标准化和一致性。
十一、结果记录和数据处理提供一个记录表格，规定操作员如何记录检验结果，包括峰面积、保留时间等数据，并说明如何进行数据处理和解读。
十二、异常处理列举可能出现的异常情况，如仪器故障、色谱图异常等，并给出相应的处理措施和纠正措施。
十三、参考范例和质量控制提供一些操作示例或参考范例，以及质量控制的要求和方法，以确保结果的准确性和可靠性。
十四、操作员培训和授权确定操作员接受培训的要求和方法，表明完成培训后的操作员可以独立进行该检验，并进行检验授权和审批的规定。
十五、附录列举相关的附录，如计算公式、样品制备方法详解、有关仪器的文章等。
以上是SOP高效液相色谱法检验操作规程的基本内容，操作规程的编写应根据具体情况进行调整和修改。
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高效液相色谱方法的验证
•方法验证的目的
•方法验证的内容
•方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的
目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。
方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。
同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容
•准确度
•精密度
•专属性
•检测限
•定量限
•线性和范围
•耐用性
准确度
定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。
一般用回收率%表示。
1.主成分含量测定
原料药：对照品或方法比对
制剂、中药：标准加样回收
2. 杂质定量
杂质对照品
方法比对
杂质与主成分的相对含量
%
100
%×
−
=
B
A
C
回收率
A: 试验供试品中被测成分的量（通常为含量测定量的50%）B: 试验供试品中加入的对照品的量（通常为±20%）
C: 试验测定值
测定：加样回收（n≥9）
精密度
定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差
1. 重复性（n≥9）
2. 中间精密度
3. 重复性
测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度，分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。
同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性
定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。
1. 鉴别反应
2. 含量测定
杂质测定
测定：
限量检查
空白制剂，模拟复方
加速破坏试样测试
DAD峰纯度检查
检测限和定量限
检测限（LOD ）：供试品中被测物能被检测出的最低量。
通常采用信噪比3:1或2:1
定量限（LOQ ）: 供试品中被测物能被定量测定的最低量。
通常采用信噪比10:1
测定：将一对照品储备溶液，逐步稀释，分别进样分析，计算相应色谱峰高h p 和平均基线噪音（h baseline noise ）之比。
通常报告进样质量或进样体积（需与样品制备方法相关）。
h h N S ise baselineno P
=
线性和范围
线性：在设计范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。
范围：在能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。
测定：至少5个浓度（n≥5），每个浓度进样3次，以3次进样的平均峰面积对样品浓度进行线性回归。
耐用性
定义：在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。
测定：
供试品溶液的稳定性（溶剂，温度，时间等）
进样量
流动相组成比例，pH
不同牌号的同类型色谱柱，柱温，流速
检测波长（最大吸收波长位移范围，及吸收强度的变化等）
分析方法研究和验证中使用的标准物质
•对照品（一级标准）
•工作标准（二级标准）
•非法定对照品
杂质分析
新原料药和新制剂中的杂质研究国家有关新药申报要求
ICH 文本：Q3A, Q3B •采用对照品，或相对保留时间定位
•采用DAD 或MWD 确定UV 光谱或不同波长的检测情况•测定对主成分的相对响应因子（0.9~1.1）仪器要求：
1.检测灵敏度：波长，灯
能量，流通池，进样量
等其它色谱条件
2.
数据处理：积分参数。