方法高效液相色谱法
高效液相色谱仪的四种检测方法及计算
高效液相色谱仪的四种检测方法及计算高效液相色谱仪（HPLC）在化学、生物学、制药、食品等领域都有广泛应用，其检测方法多种多样，以下将详细介绍四种常用的检测方法及其计算方式。
一、紫外-可见光检测法 (UV-Vis)紫外-可见光检测法是最常用的HPLC检测方法。
在此方法中，样品组分在紫外或可见光区域有吸收，因此可以被检测。
计算方法一般采用峰面积或峰高法定量。
峰面积法比峰高法更为准确，因为它同时考虑了峰的高度和宽度。
在计算时，首先需要获得标准品的校正曲线，然后根据未知样品的峰面积或峰高在校正曲线上找到对应的浓度。
二、荧光检测法 (Fluorescence)荧光检测法的灵敏度通常比紫外-可见光检测法更高，但并非所有化合物都能产生荧光。
在这种方法中，样品组分被激发光照射后发出荧光，荧光强度与组分浓度成正比。
计算方式与紫外-可见光检测法类似，也是通过校正曲线进行定量。
三、电化学检测法 (Electrochemical Detection)电化学检测法通常用于检测具有电化学活性的化合物，如许多药物和神经递质。
它可以在没有光学性质的情况下对物质进行检测，提高了HPLC的应用范围。
常见的电化学检测方法包括安培检测法和电导检测法。
定量计算通常基于法拉第定律，即电流与通过电解池的电荷量成正比。
四、质谱检测法 (Mass Spectrometry)质谱检测法是与HPLC连用的一种高级检测方法，可以提供待测物质的分子量信息，从而确定其化学结构。
在此方法中，HPLC分离后的组分直接进入质谱仪进行检测。
定量计算通常使用内标法或外标法，需要对待测物质进行同位素标记或使用已知量的内标物质。
此外，还可以使用多反应监测模式（MRM）进行更准确的定量。
以上四种方法各有优缺点，应根据具体的应用需求和样品性质选择合适的方法进行检测和计算。
同时，为了获得准确可靠的结果，还需要对HPLC系统进行适当的维护和校准。
含量测定,高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析方法，可以用于含量测定。
该方法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
高效液相色谱法具有高分离度、高灵敏度、高选择性等优点，适用于对热不稳定、难挥发、易分解的物质的分离和分析。
在含量测定中，高效液相色谱法可以用于测定药物、食品、环境样品中的成分含量。
需要注意的是，在进行含量测定时，应先进行方法学验证，以确保该方法具有足够的灵敏度、精密度和准确性。
同时，还应根据具体的样品和待测成分的性质选择合适的色谱柱、流动相和检测器等。
总之，高效液相色谱法是一种重要的分析方法，可用于含量测定，但需要经过方法学验证和选择合适的实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
高效液相色谱法 HPLC
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
hplc高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法
4. 区域宽度
衡量色谱峰宽度的参数，三种
表示方法： （ 1 ）标准偏差 ( ) ：即 0.607 倍峰 高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半 处的宽度 Y1/2 =2.354 。 （3）峰底宽(Wb)：Wb=4 。
2. 相平衡参数
（1）分配系数（ partition coefficient） K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、
流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”
气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为
液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作
用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争， 即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
试样一定时，K主要取决于固定相性质；
每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。
3.分配比 （partition radio）k
一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。
2. 按孔隙深度分
• 表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面 覆盖一层多孔活性材料(如 硅胶、氧化铝、离子交 换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的 颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好， 出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。 • 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成， 因颗粒极细，因而孔径小、传质快、 柱效高。特 别适于复杂混合物的分离。
（2）用体积表示的保 留值
保留体积（VR）： VR = tR×qv qv为柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。 死体积（VM）： VM = tM ×qv
高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC) High Performance LiquidChromatography§3-1 高效液相色谱法概述一、定义以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.二、HPLC特点1、高压经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（150～350 ⨯105 Pa，最高输送压力可达450⨯105 Pa）;2、高速由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几min、十几min可完成一个分析任务。
3、高效HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）。
4、高灵敏度利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。
紫外检测器10-9g荧光检测器10-11g高效液相色谱三、液相色谱分离原理及分类液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
四、液相色谱与气相色谱的比较1、相同点（1）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同。
（2）基本概念一致：基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
（3）基本理论一致：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
2、不同点由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处：（1）仪器设备和操作条件不同；（2）应用范围不同；气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。
高效液相色谱法
高效液相色谱法高效液相色谱法(《中国药典》2010年版二部附录V D)系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带人柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局"液相色谱仪检定规程"定期检定并符合有关规定。
1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等〉也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm(lnm= lOA)以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3～10µm之间。
粒径更小(约2µm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40°C，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60°C。
流动相的pH值应控制在2～8之间。
当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
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in Aspirin,Sodium aminosalicylate & Clofibrate Assay
第一节
典型药物的结构与性质
苯甲酸类 水杨酸类 其他芳酸类
九、高效液相色谱法
保留时间相同
第三节 特殊杂质检查
阿司匹林中特殊杂质的检查 对乙酰氨基酚特殊杂质的检查 甲芬那酸中特殊杂质的检查 二氟尼柳中特殊杂质的检查
一 、阿司匹林中特殊杂质检查
（一）合成工艺
ONa CO2
COONa ONa H+
COOH OH
（CH3CO）2O
COOH OCOCH3 + CH3COOH
（二）检查 ---有关物质
COOH
检查——酚、苯酯类杂质。
OCOCH3
方法——高效液相色谱法(梯度洗脱)。
OH
CH3COO
酚
乙酸苯酯
COO OH
水杨酸苯酯
COO OCOCH3
乙酰水杨酸苯酯
二、对乙酰氨基酚中的特殊杂质
（一）合成工艺
NO2
NO2
NH2
NaOH 水解
Fe, HCl
C2H5OH, 乙酰化 对乙酰氨基酚
一 、阿司匹林中特殊杂质检查
（二）检查
水杨酸 有关物质
（二）检查 ---水杨酸
——为合成中间体和水解产物
COOH OCOCH3
COOH OH
HO
[O]
COOH OH
O
[O]
HO
COOH
O
O
HO
HO
O COOH
COOH
O COOH
淡黄、红棕、深棕色
O COOH
（二）检查Байду номын сангаас---水杨酸
方法：高效液相色谱法 应用范围：原料、片剂、肠溶片、肠溶胶囊等
一、苯甲酸类 代表药物
COOH
COOH NH
CH3 CH3
苯甲酸（pKa4.20） 甲芬那酸 mefenamic acid
(CH3CH2CH2)2N SO2
COOH
丙磺舒（pKa3.4）
COOH
性质
酸性 → 含量测定
苯甲酸（pKa4.20）
+ FeCl3→赭色↓(鉴别)
COOH
CH3 紫外吸收→ (鉴别、含量测定)
峰强度 强 弱～强 弱～中等 弱～中等 强 中等～强 强 中等～强
归属基团或化学键 O-H、N-H (胺基,羟基) C-H（烷基）、-CHO ≡CH、=CH、Ar-H C≡N C=O(醛,酮,羧酸及衍生物) C=C、C=N、N-H
C-O（醇,酚,醚,酯,羧酸）
不同取代形式双键、苯环
八、薄层色谱法
制剂鉴别：辅料干扰，分离后鉴别 比移值相同
检查方法： 高效液相色谱法。
注：对氨基酚对照溶液不稳定，应临用前新鲜配制。
新
疆
医
科
大 学
2、对氯苯乙酰胺
药
物 分
以对氯苯乙酰胺为对照品，HPLC限度检查。
析
教
研
室
三、甲芬那酸中特殊杂质的检查
（一）合成工艺
COOH
（蓝紫色）
O 3
二、重氮化—偶合反应
NH2 芳香第一胺类鉴别反应 具芳伯·氨基或潜在芳伯氨基的药物
Ar
NH2
HCl NaNO2
重氮盐
OH- 橙黄～猩红色
萘酚
二、重氮化－偶合反应
HO
NHCOCH3
对乙酰氨基酚：潜在芳伯氨基
盐酸或硫酸加热水解 NaNO2/HCl 有色偶氮染料（红色)
碱性β-萘酚
NH
CH3
甲芬那酸 mefenamic acid
(CH3CH2CH2)2N SO2
COOH
丙磺舒（pKa3.4）
二、水杨酸类
COOH OR
二、水杨酸类 代表药物
COOH OH
COOH OCOCH3
水杨酸（pKa2.98） 阿司匹林（pKa3.49）
二、水杨酸类 代表药物
COOH O O OH 双水杨酯?
Cl
OH
OH
对氨基酚的检查
新
疆 医
特殊杂质：中间体、副产物及分解产物（例：对氨基酚、对氯苯乙酰胺、
科
大 学
O-乙酰基对乙酰氨基酚、偶氮苯、氧化偶氮苯、苯醌和醌亚胺等）
药 物 分 析 教 研 室
二、对乙酰氨基酚中的特殊杂质
（二）检查
1、对氨基酚及有关物质 乙酰化不完全或贮藏不当引起水解－毒性较大并有色泽
具有酚羟基结构，弱酸环境与Fe 3+ 生成紫色配位化 合物。
4、水解反应：杂质检查
水解
水杨酸酯类
游离水杨酸
三、其他芳酸类
酰胺基:水解后芳伯氨基特性 酚羟基:与FeCl3显色 水解产物反应
HO
N C CH3
HO
对乙酰氨基酚 (paracetamol)
较弱酸性 紫外、红外吸收
CH3 CHCH2
CH3
CH COOH CH3
布洛芬 ibuprofen
第二节 鉴别试验
鉴别反应
与铁盐反应 重氮化-偶合反应 氧化反应 水解反应
UV IR TLC HPLC
一、与铁盐反应
COOOH
FeCl3 T.S. pH4~6
COO
O Fe Fe 紫堇色
23
NHCOCH3
3
+ FeCl3
OH
NHCOCH3
Fe + 3HCl
三、氧化反应
甲芬那酸＋H2SO4 K 2(CO r)2 O7 深蓝色 随即变为棕绿色
四、水解反应
阿司匹林 Na 2CO 3 水杨酸钠 醋酸钠 硫 酸 水杨酸（白色 ） 醋酸臭气
双水杨酯 NaOH 稀 盐酸 水杨酸白色 （测定熔点）， 可溶于醋酸铵
279,
(20g/ml)
350
对氨基水 磷酸盐缓冲液 265,
杨酸钠
299
0.69-0.74, 1.150.59-0.60 1.30
1.501.56
七、红外分光光度法
峰位（cm-1） 3750～3000 3000～2700 3300～3000 2400～2100 1900～1650 1670～1500 1300～1000 1000～650
六、紫外分光光度法
药物 贝诺酯
溶剂 无水乙醇
max/ min E值
A值
240
730-760
羟苯乙酯 乙醇(5 g/ml) 259
0.48
丙磺舒 盐酸-乙醇
225,249
0.67
(20g/ml)
布洛芬 0.4%NaOH (0.25mg/ml)
265,273; 245,271
A1/A2
甲芬那酸 盐酸-乙醇
二、水杨酸类 代表药物
OCOCH3 COO
NHCOCH3
贝诺酯
二、水杨酸类
性质
1、酸性：水杨酸类基本结构为邻羟基苯甲酸， 易形成分子内氢键，增强羧基中氧氢键的极 性，酸性强于苯甲酸。含量测定
2、吸收光谱特征：苯环及特征取代基
鉴别 含量测定
二、水杨酸类
性质
3、与Fe 3+反应：特征鉴别反应