基因工程1

5’……A G G A PuPuUUUPuPu…AUG mRNA
AGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位
30S
lF1、3
mRNA met-GTP-lF2
50S
fmet
GTP lF2, GDP+Pi
lF1、3
30S 50S fmet
基因克隆时的定向插入
插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会 倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’ 方向正确转录，这种构建方式称为定向插入。
DNA本身
生殖细胞、
体细胞、个体
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。 基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨 认、结合等组成的表达体系的调控。 基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻 译后修饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理 论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
周俊宜 fzyxzjy@
基因工程的表达体系
操纵子理论在基因工程中的应用
目的基因翻译表达及其准确性 常用基因载体
基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中 的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或 插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。 常用的载体有质粒、噬菌体、病毒
TTGATA
CTGACG TTGACA
共有序列
顺式作用元件 结构基因
-GCGC---CAAT---TATA
转录起始 增强子
TATA盒 CAAT盒 GC盒
真核生物启动子保守序列
RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合
Ptac启动子
Ptrp与 Plac的杂化产物 Ptac比原来各自的活性强 -35区 -10区
位点构成。 其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克 隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和 体外突变等研究。
pKO系列
组成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的 EcoRI-PvuII位点包括terr，.
表达产物催化 Gal + ATP Gal-1-P+ADP
酵母结构基因的上游还有上游活化序列（upstream activation sequence，UAS）。
核糖体结合位点（S-D序列）
mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列 (Shine-Dalgarno)，又称为核糖体结合点。
3’… A CACUAGG…5’ U C U-C-C-U
16sRNA
Apr
lacZ之内是M13的多 功能连接器。
( 2 . 6 8 k b)
Ori
三个显著特点： （1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大； 具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 可利用-互补原理进行蓝白筛选。
（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα， （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切
缺点： 原核生物载体构建的重组体是无法进入 动物细胞进行表达；
没有加工所需的酶系统；
热源、内毒素不易除去 ； 常会形成包涵体。
表达体系的发展
表达体 第一代 原核生物表达体系 第二代 酵母表达体系 载体 质粒、噬菌体 穿梭质粒 宿主 细菌 酵母 培养细胞
第三代 哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体
第四代 基因直接导入
的优越条件。
此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生 的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分
子质量标准。
普通型载体pBR322的结构图
H in d II I B am H I
P st I S al I S ca I A mp
r
pBR322
(4.36 kb)
o ri
Amp
Tet
插入片段
Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。
Plasmid
chromosome
基因载体应具备的条件：
（2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；
（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；
（3）有一定容量；
（4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。
多克隆位点
polylinker
476bp片段含有E.coli 的lacZ基因的 5’-序列，E c o R I 表达半乳糖苷酶的α 片段。
S a cI
K p nI
S m aI B a m H I X b aI
S a lI
P st I
S p hI
H in d I II
pU C19
LacZ
LacZ的上游包括乳 糖操纵子上的启动子 Plac和操纵基因O。
发展概况
第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的 利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。
第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立
多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载
体。
第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的 不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动 子载体，表达型载体及各种探针型载体。
pBR322
Tet平板
Amp平板
抗药性标志的选择
Amp
r
Tc
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组 有 DNA插 入
无 DNA插 入
Amp Tc
r
r
转化
Amp Tc
r
外 源 DNA
s
Amp Tcr
筛选重组子
r
Amp Tc s
r
无菌落
阳性菌落
提 取 DNA 电泳
Amp Tc s
r
重 组 DNA
pUC质粒系列
原核生物表达体系： 大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌
大肠杆菌表达体系的优点： 积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；
可因不同载体而选择不同菌种作宿主；
操作安全，致病能力低 ； 成本相对低得多 ； 真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称 为亚克隆（subclone），然后采用其它方式转移 至真核细胞上表达。
EcoRI
HindIII
LacZ
pUC19
Ori复制起 点 APR
能正确读出三联体密码的起始序列
如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切 点不能把读码框准确置于ATG之后,或插入片段编码未 清楚,可在目的基因之前设保险序列:
5’…ATGNATGNATG
5’…ATGNATGN ATG 123 456
5’…ATGN ATG NAT GXY 123 456
5’…ATG NAT GNA TGZ 123 456
ATG I II III IV
成熟蛋白质 CS
TAA V
转录终止区
转录起始 翻译起始 信号肽
I II
I
I
CS
V
II ATG
CS
V
III
CS--cloning site
I
II
III
V
Ori
质粒(plasmid )
能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细
胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。
5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为
严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质
粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的 质粒应该是松弛型的。 6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不 能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
一、启动子与转录调控 原核生物的转录单位是操纵子，操纵子包括 相关结构基因及其上游的调控序列。
调控序列
结构基因
以乳糖操纵子（lac operon）为例： 操纵子
I
CAP P O
Z
调控区 P：启动序列 O：操纵序列
Y 结构基因
X
I：调节序列
I
诱导物
CAP
P
O
Z
Y
X
I
CAP
P
O
Z
Y
X
二、强启动子的构建
片段
片段
lacZ
标志补救（ß -半乳糖苷酶法）
Lac Z
X-gal
蓝色化合物
X-gal
（LacZ基因 N端序列） LacZ基因 N端序列
插入片段 （LacZ基因失活）
LacZ酶
四、转录终止结构的插入
转录终止：非依赖ρ因子的转录终止需要茎环 结构，以t（termination）代表。
U A A C C G C C G 5’…AUACCA U
pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。
它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和 复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了 M13噬菌体的476bp片段，含LacZ不得基因及其启动 子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.
pU C18
H in d II I S ph I P stI S a lI X b aI B a m H I S m aI K p n I S a cI E co R I
噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核 细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的 “寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结 构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复 制、转录、翻译。 入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方 式生存和繁殖（图1-5）。 图左示λ噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体 内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌 释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。 λ噬 菌 体 侵入 菌 体后 ， 把自 身 DNA 加 进 细菌 DNA 里 （整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂 而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。