三种快速制备含重复序列质粒PCR模板的方法
三种PCR技术
反义PCR的高敏感性： Noguchi用MVCI(多形上皮 粘蛋白的核心蛋白)作标志物,检测了15例乳腺癌的50 个腋窝淋巴结。免疫组化方法显示有9个淋巴结转移, 反义PCR也显示阳性。其余41个免疫组化检测阴性的 淋巴结中,有6个反义PCR法检测阳性。 反义PCR的特异性：Wang等用酪氨酸酶做标志物，检 测了29例处于Ⅰ期、Ⅱ期的恶性黑色素肿瘤患者，结 果显示病理学检测有11例淋巴结转移；反义PCR检 测则有19例淋巴结转移，其中包括病理检测的11例 阳性，既假阳性概率为0。 反义PCR要注意的问题：总RNA提取时,应防止RNA酶降 解RNA;防止样品，交叉污染;防止体细胞DNA混入样品。
反义PCR技术（RT-PCR）
RT-PCR：脱胎于经 典PCR技术,将有特 定基因序列mRNA表 达的组织中的总RNA 提取后,通过逆转录 酶作用,以mRNA为模 板反向合成cDNA,再 利用PCR技术将特定 序列进行扩增,最后 利用琼脂糖凝胶电 泳将扩增片段检出。 其逆转录引物与PCR 引物有共用性。
RNA提取：Trizol试剂方法提总RNA EV71和Cox.A16的鉴别诊断 RT-PCR
EV71肠道病毒VP1区全基因核苷酸序列扩增
DNA序列测定和分析
Trizol试剂方法提总RNA
取200μl反复冻融3次的病毒细胞培养液,加入 1ml Trizol提取液,混匀后室温放置20min,加200μl 氯仿,混匀,室温静置10min,4℃13000r/min离心10min; 转移上层水相到新的离心管中,并加入500μl异丙醇, 室温沉淀10min,4℃13000r/min离心10min;弃上清,沉 淀用75%乙醇洗2遍,室温干燥,加20μl纯水溶解 RNA,2μl RNA酶抑制剂(RNAsin)。提取的RNA立即进 行逆转录,或置-70℃保存备用。
重组质粒的构建
重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。
以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。
目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。
根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。
2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。
根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。
常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。
3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。
4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。
连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。
连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。
5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。
常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。
转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。
6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。
常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。
7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。
序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。
3PCR方法
1988年，Saiki从温泉中分离出一株水生 嗜热杆菌（耐热DNA聚合酶）
扩增两段已知序列之间的DNA 扩增已知序列两侧的未知序列
扩增序列未知的新基因
RNA为模板 克隆PCR 定性 定量
PCR原理
• 根据已知的待扩增的DNA片段序列，人工合成与该DNA
两条链末端互补的两段寡核苷酸引物，在体外有模板 DNA和4种脱氧核糖核苷存在的条件下依赖于DNA聚合酶
pcr扩增聚合酶sscpdna缓冲液3pcr方法更多
实验三 PCR－RFLP技术
PCR－SSCP技术
RT-PCR技术
PCR发展简史
1983年，美国科学家Kary Mullis,孕育出 了PCR技术的原型，DNA聚合酶（大肠 杆菌DNA聚合酶I的klenow片段）
1988年，keohanog,T4DNA聚合酶
3′ 变性 5′ 3′
3′ 5′
退火
5′ 3′
3′ 聚合 5′
5′
3′
3′
5′
分子信标
SYBR Green I荧光染料技术
SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。 与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出 来，荧光信号急剧减弱。 信号强弱代表了双链DNA 分子的数量。 基本过程：
－10分钟，随后立即置于冰上冷却。
影响SSCP显示的因素
• PCR扩增的特异性要强。设计引物时要使引物能 与DNA模板特异性结合，而且引物之间不能形成 二聚体，引物内最好不要存在发夹结构，还要选
择一个合适的退火温度。
• PCR扩增的产量要高。
•
PCR扩增的片段不宜过长。一般以100－300bp
为宜，此时SSCP检出率约为99％；但当DNA片
基 因 外 重 复 回 文 序 列 pcr
基因外重复回文序列 pcr
PCR技术是一种常用的分子生物学方法，其能够扩增DNA序列并进行检测。
基因外重复回文序列是一种在基因组中广泛存在的序列，其长度通常在100 - 10,000个碱基对之间。
由于这些序列具有高度
的重复性，因此它们往往会被认为是基因组中的“垃圾DNA”。
但是，最近的研究表明，基因外重复回文序列可能会在某些基因表达和调控过程中发挥重要作用。
因此，研究这些序列的扩增和检测方法变得尤为重要。
基因外重复回文序列的PCR扩增可以通过使用特定的引物来完成。
这些引物通常设计为与回文序列两端互补的序列，以便在扩增时能够将回文序列的两个端点扩增出来。
此外，PCR扩增还可以结合其他技术，如Southern blotting或测序，以确定扩增产物的大小和纯度。
PCR检测基因外重复回文序列的应用非常广泛。
例如，这种技术可以用于鉴定某些基因的基因组位置，或者用于检测某些疾病所涉及的回文序列扩增产物。
除此之外，PCR扩增还可以用于筛选大量基因组样本，以便在基因组中发现新的基因外重复回文序列。
总之，PCR技术是一种可靠且有效的基因外重复回文序列扩增和检测方法。
这种技术的应用将促进对基因组中这些序列的研究和理解，有助于我们更好地了解基因组中的“垃圾DNA”及其可能的生物学意义。
- 1 -。
27 生物化学实验--重组质粒的提取与PCR鉴定
重组质粒的提取与 PCR 鉴定【目的】1 ．掌握碱裂解法提取质粒的方法和 PCR 的基本原理与实验技术。
2 ．熟悉 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定法。
【原理】• 质粒 DNA 的提取与鉴定原理从大肠杆菌细胞中分离质粒 DNA 的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。
目前常用的有碱裂解法（又称碱变性抽提法）、羟基磷灰石柱层析法、质粒 DNA 释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭一氯化铯密度梯度离心法。
以上方法各有利弊。
但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好、经济且收获率较高，是一种使用最广泛的制备质粒 DNA 的方法，也是当今分子生物学研究中的常规方法。
制备的质粒 DNA 可用于酶切、连接、转化以及 PCR 等。
本实验采用碱变性法微量制备质粒 DNA 。
其基本原理是在溶菌酶和 SDS ( 十二烷基磺酸钠 ) 破除细胞壁后，使 DNA 释放出来。
在强碱条件下， DNA 变性成单链，当加入醋酸钾溶液适当中和 pH 时，质粒 DNA 能很好地复性，而基因组DNA 和大分子 RNA 仍为单链，并以蛋白质 -SDS 复合物形式被高浓度盐沉淀。
质粒 DNA 留在溶液中，进一步用酚 : 氯仿 : 异戊醇抽提去除蛋白质后，再用乙醇沉淀上清中的质粒 DNA ，并溶解于低离子强度的 TE 缓冲液后，加适量RNase A 降解残留的 RNA 。
质粒 DNA 的存在形式有 3 种：① 共价闭环 DNA, 常以超螺旋形式存在；② 开环 DNA ，此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂；③ 线性DNA ，因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。
琼脂糖凝胶电泳可以鉴定质粒 DNA ，在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度不同，超螺旋＞线性＞开环。
• PCR 反应的原理聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ， PCR ）类似于天然的复制过程，用于体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA 区段（靶序列），其原理是在模板DNA 、引物和 4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖 Taq DNA 聚合酶的酶促合成反应。
PCR操作步骤及结果
PCR操作步骤及结果PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种体外放大特定DNA片段的技术，具有高效、快速和特异性的特点。
下面将详细介绍PCR的操作步骤及其结果。
一、PCR的操作步骤：1.模板DNA制备：-从样品中提取DNA，常见的提取方法包括CTAB法、盐溶法和商用DNA提取试剂盒等。
-根据实验需求，选择合适的DNA浓度作为PCR的模板。
2.PCR反应体系的配制：PCR反应体系由模板DNA、引物、dNTPs（四个单核苷酸）、缓冲液和聚合酶等组成。
-引物：引物是PCR反应中的两个短链DNA分子，分别与待扩增的目标DNA的两个互补区域序列相配对。
-dNTPs：dNTPs是脱氧核苷酸，包括A、T、C和G四种，供给聚合酶合成新DNA链使用。
-缓冲液：缓冲液用于提供合适的pH值和离子环境，维持PCR反应的正常进行。
-聚合酶：聚合酶是PCR反应的酶，能够识别引物，并在引物上逐个添加dNTPs，合成新的DNA链。
3.PCR循环反应：PCR反应主要包括三个步骤：变性、引物结合和延伸。
-变性：将PCR反应混合液加热至95°C，使模板DNA的双链解开，得到两条单链DNA。
-引物结合：将PCR反应体系降温至合适的温度（通常为45-65°C），使引物与单链DNA的互补区域结合。
-延伸：将PCR反应体系升温至聚合酶的最适温度（通常为65-75°C），聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链，延伸特定的目标序列。
4.PCR循环程序：PCR的循环程序通常分为三个阶段：变性、引物结合和延伸。
-变性：95°C，持续时间为30秒至2分钟。
用于使DNA变性，并解开双链。
-引物结合：温度通常为45-65°C，持续时间为20秒至1分钟。
用于引物与模板DNA的互补区域结合。
-延伸：温度通常为65-75°C，持续时间为0.5-2分钟。
用于聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链。
质粒构建的原理及方法
质粒构建的原理及方法质粒构建的原理及方法是指通过研究DNA片段的特征，以及其在生物学实验中的复制、表达、合成和移植的原理及方法，来构建质粒。
质粒是一类由DNA片段组成的可重复使用的基因工程载体，用于转移和表达外源基因，广泛应用于基因工程和生物技术研究中。
质粒构建的原理主要是根据DNA片段的周期性结构形成的，即质粒的结构是由DNA片段组成的，而不是其他的物质。
在质粒构建中，首先要明确需要构建的质粒的目的和功能，然后根据此目的和功能，从DNA片段库中选择合适的片段，将其组装成质粒，以达到预期的效果。
质粒构建的方法有几种，常用的有PCR扩增法、等位子构筑法、同源克隆法和限制性内切酶构建法等。
1 PCR扩增法：PCR扩增法是一种用于构建质粒的有效方法，其原理是利用特定酶，如Taq DNA聚合酶，对DNA 片段进行反复扩增，从而获得大量的DNA片段。
该方法的优点是快速、灵敏，可以构建任意大小的质粒，但也有一定的缺点，例如扩增的精确性和准确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。
2 等位子构建法：等位子构建法是指在特定的位置插入预先准备好的DNA片段，即将DNA片段配对到等位子上，从而构建质粒。
该方法的优点是可以以高精度构建质粒，精度可达99.9%，但是缺点是时间较长，构建大型质粒时耗时较长。
3 同源克隆法：同源克隆法是指将DNA片段插入到一种特定的质粒中，从而形成新的质粒。
该方法的优点是可以用于构建任意大小的质粒，但缺点是构建的质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。
4 限制性内切酶构建法：限制性内切酶构建法是指将DNA片段插入到限制性内切酶识别序列中，从而形成质粒。
该方法的优点是可以快速构建质粒，而且可以构建任意大小的质粒，但缺点是质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。
以上就是质粒构建的原理及方法，质粒构建的方法也不断发展壮大，未来还有可能推出更多的质粒构建方法，以满足更多的应用需求。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
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表 2 PCR扩增的目的条带量化值
关键词 : 高速离心法 TE煮沸法 TE / SDS煮沸法 PCR模板 重复序列
Three M ethods of Rap id Prepara tion of Pla sm id D NA Tem pla te w ith Repea t Sequence for PCR
Zhao Hongyu1, 2 Cai Lu1, 2 Zhao Xiujuan1, 2 W ang J ingyan1, 2 L i J ing1
反应体系为 25μL ,其中包括 1 ×PCR B uffer (内 含 115 mmol/L M g2 + ) 、模板 DNA 2μL、Taq DNA 聚 合酶 0175 U、引物终浓度 013μmol/L、dNTP终浓度 0125 mmol/L ,其余用 ddH2O 补足 。
反应程序 : 94℃预变性 2 m in; 94℃变性 30 s、 65℃退火延伸 2 m in, 29 个循环 ; 72℃延伸 5 m in; 4℃保存 。反应结束后 ,取反应产物 20μL ,于 5%聚 丙烯酰胺凝胶电泳 , EB 染色 , 凝胶成像仪下观察 结果 。
菌体 115 mL , 4 000 r/m in、4℃离心 3 m in,去上清 ; 加 20μL TE清洗 , 4 000 r/m in、4℃离心 3 m in,去上
清 ,加 20 μL TE /011% SDS回溶 ,分别煮沸 1、115、
2、215和 3 m in, 12 000 r/m in、4℃离心 2 m in, ,取上 清用于 PCR扩增 。 114 PCR 扩增 [ 10 ]
摘 要 : 为了探索含重复序列质粒 PCR模板的快速简易制备方法 ,分别利用高速离心法 、TE煮沸法和 TE / SDS煮沸法 处理过夜培养的含重组质粒大肠杆菌菌体 ,制备模板后进行 PCR 扩增发现 ,均能得到比较清晰的目的条带 ,可以用于含重复 序列质粒的初步鉴定 。相比较而言 ,高速离心 5 m in、TE煮沸 3 m in、TE / SDS煮沸 215 m in制备的样品 PCR 扩增后效果较好 。 这 3种方法快速 、简便 、费用低 、无污染 ,简化了 PCR模板制备的过程 ,为重组质粒大量筛选鉴定的研究奠定了基础 。
Ab s tra c t: H igh, TE boiling method and TE / SDS boiling method were used to treat E. coli in order to exp lore the rap id p reparation method of PCR temp late using p lasm id with DNA repeat sequence. It was found that clear objective bands could be got using these three methods which could be app lied to p relim inary identification of p lasm id w ith repeat sequence. The results of centrifugating 5 m in, boiling 3 m in by TE and boiling 2. 5 m in by TE / SDS were better than that of others. The three methods were rap id, simp le, low cost, no pollu2 tion and simp lification of p reparation of PCR temp late, that could lay a basis for further study of rap id screening and identification of re2 combinant p lasm id.
1 材料与方法
111 菌株 大肠 杆 菌 DH5α, 本 实 验 室 保 存 。重 组 质 粒
pLC ( GAA ) 42 、pLC ( GCCT) 18由本实验室构建 ,分别 含有一段三核苷酸重复序列 ( GAA ) 42和四核甘酸重
收稿日期 : 2009211202 基金项目 :国家自然科学基金 (30460038) ,内蒙古自然科学基金重点项目 (200508010102) 作者简介 :赵宏宇 ,男 ,讲师 ,硕士研究生 ,研究方向 :分子生物学 ; E2mail: zhaohongyu2000@163. com 通讯作者 :蔡禄 ,男 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向 :生物信息学及分子生物学 ; E2mail: nmcailu@163. com
Key wo rd s: H igh speed centrifugation TE boiling method TE / SDS boiling method PCR temp late Repeat sequence
近年来 ,人们已经发现 40多种人类神经系统疾 病与 DNA 重复序列扩增或删除有关 [ 1 - 3 ] ,这些疾病 所涉及的重复序列的一个共同特点是以非孟德尔遗 传方式在世代间发生动态突变 [ 4 ] ,且往往伴随着遗 传早现现象 [ 5, 6 ] 。在研究该类疾病的致病机理时 , 需要应用 PCR 的方法对构建含重复序列的质粒重 组子进行大量的筛选鉴定 ,并且探索治疗药物及方 案时也需制备成百上千的 PCR 样品进行定性检测 重复序列的长度变化情况 。传统的 PCR 模板制备 一般需要进行碱法小提质粒 ,即 SDS /NaOH 消化 、 酚 /氯仿 等 有 机 溶 剂 抽 提 及 乙 醇 沉 淀 等 多 步 操 作 [ 7 ] ,虽然得到的质粒 DNA 样品纯度较高 ,但费时 、
赵宏宇等 :三种快速制备含重复序列质粒 PCR模板的方法
121
图 1 样品的琼脂糖电泳检测结果
212 PCR 扩增检测 对 3种方法制备的含 ( GAA ) 42重复序列的质粒
的直接进行进行 PCR 扩增后 ,其结果见图 2。从图 2中可见 , 3种方法得到目的条带都在 159 bp 左右 , 位置正确 ,条带清晰 ,与试剂盒提取质粒作为对照扩 增的结果基本一致 ,均可以用于重复序列长度的初 步鉴定 。
μL TE清洗 , 4 000 r/m in、4℃离心 3 m in,去上清 ,加
20μL TE 回溶 ,分别煮沸 1、115、2、215 和 3 m in,
12 000 r/m in、4℃离 心 2 m in, 取 上 清 用 于 PCR
扩增 。
11314 TE / SDS煮沸法制备模板 取过夜培养的
费力 ,因此如何简化 DNA 模板的制备便成为 PCR 试验中的重要问题 。本试验探索了高速离心法 、TE 煮沸法和 TE / SDS煮沸法制备 PCR 模板 ,整个提取 过程在较短时间内即可完成 ,建立了快速 、简易 、低 成本的 PCR模板制备方法 ,为分子克隆及药物处理 菌体后大量检测 DNA 重复序列及相关遗传疾病分 子机制研究奠定了基础 。
(1 School of M athem atics Physics and B iological Eng ineering, IMUS T, B aotou 014010; 2 Institute of B ioengineering & Technology, IMUS T, B aotou 014010)
120
生物技术通报 B io techno logy B u lle tin
2010年第 2期
复序列
(
GCCT)
[8 18
,
9
]
。
112 试剂与仪器
11211 试剂 Taq DNA 聚合酶 、dNTP、100 bp mak2
er购自 TaKaRa公司 , Tris2base、SDS购自 OXO ID 公
样品编号
浓度 ( ng/μL)
表 1 三种方法制备的含 D NA重复序列质粒样品的浓度与纯度
OD260 /280
样品编号
浓度 ( ng/μL)
OD260 /280
样品编号
浓度 ( ng/μL)
OD260 /280
A1
78114
2119
A2
54310
2115
A3
53112
2108
A4
61018
2117
司 ,其余为国产分析纯 。
11212 引物 引物为 pLC质粒系列插入的重复序
列两端接头 [ 8, 9 ] , 由 上海 生工 合成 , 其 序列 为引 物
EP1: 5′2GGA ATT CGA GTC GCG C23′,引物 PB2: 5′2
CGG GAT CCG AGT CGC GC23′。
11213 仪器 基因扩增仪 (B iometra) ;凝胶成像仪
每一种方法的第 1 个样品条带 (即泳道 A1、B1、C1 的目的条带 )分别定义为 1000,去除背景噪声干扰 后 ,其余的条带则选定目的区域后由软件自动处理 , 试验结果如表 2。从表 2 中数据可看出 ,同种方法 不同处理时间制备的模板扩增后的量化值相差不 大 ,说明处理时间对试验结果的影响较小 ,与文献中 报道的有所差异 [ 11 ] 。
2 结果与分析
211 PCR 模板的制备 高速离心法分别离心 1、2、3、4 和 5 m in 得到
PCR 模板样品记为 A12A5; TE 煮沸法分别煮沸 1、 115、2、215和 3 m in得到 PCR 模板样品记为 B1 B5; TE / SDS煮沸法分别煮沸 1、115、2、215和 3 m in 得到 PCR模板样品记为 C1 - C5。紫外分光光度计 测量制备样品的浓度与纯度 ,含 ( GAA ) 42质粒的模 板测量结果见表 1。从表 1 中数据可看出 ,高速离 心法制备的样品浓度普遍较低 , TE / SDS煮沸法制 备的 样 品 浓 度 较 高 , OD260 /280 值 均 大 于 2。经 过 018%琼脂糖凝胶电泳检测 , A 组样品 DNA 含量较 低 ,没有明显的条带 (图略 ) ,B组、C组检测结果如图 1 所示。图 1中 C为对照 ,是用试剂盒提取的质粒 pLC (GAA)42 ,B组与 C组样品的相应位置均具有明显的条 带 ,说明含有该质粒 ,由于制备样品过程中 E. coli基 因组断裂片段或 RNA 的存在造成拖尾现象 。